Tiểu luận một số yếu tố cần thiết trong kỹ thuật gen

Chia sẻ: Hoang Thuy | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

76
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vectơ tách dòng ( cloing vectơ) là các phân tử AND có kích thước nhỏ cho phép cài(gắn) các đoạn AND cần thiết ,có khả năng tái bản không phu thuộc vào sự phân chia của tế bào ,tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gen của tế bào vật chủ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tiểu luận một số yếu tố cần thiết trong kỹ thuật gen

CHƯƠNG 4 I.M T S Y U T C N THI T TRONG K THU T GEN 4.VECTƠ TÁCH DÒNG 4.1.Khái ni m: Vectơ tách dòng ( cloing vectơ) là các phân t AND có kích thư c nh cho phép cài(g n) các o n AND c n thi t ,có kh năng tái b n không phu thu c vào s phân chia c a t bào ,t n t i trong t bào v t ch qua nhi u th h không gây bi n i b gen c a t bào v t ch . Vectơ tách dòng ph i có nhi u i m c t c bi t duy nh t cho các lo i enzim gi i h n khác nhau, ng th i mang các gen tín hi u (gen ch th màu ho c ch th d dàng nh n bi t các t bào mang vectơ tái t h p.Vectơ tách dòng kháng sinh) ư c s d ng như m t “phương ti n v n chuy n gen” nh m t o s lư ng l n các b n sao c a m th gen ho c m t trình t AND trong các t bào ch .Vectơ tách dòng có vai trò quan tr ng trong tách dòng gen,gi i trình t gen, ho c xây d ng các b n d gen… c tính c a m t vectơ : 4.2. Các - Vectơ ph i có kh năng t sao chép tích c c trong t bào ch , không ph thu c vào s sao chép b gen t bào ch . - Vectơ ph i có kích thư c càng nh càng tôt có th thu nh n lư ng AND t i a. Hơn n a, kích thư c vectơ càng nh thì càng d xâm nh p vào t bào vi khu n và càng ư c sao chép nhanh và hi u qu . - Vectơ ph i cónh ng c tính cho phép phát hi n d dàng t bào vi khu n có ch a c tính này ư c mã hóa b ng các gen ch n l c. Thông thư ng ó là các chúng; các c tính kháng v i kháng sinh giúp vi khu n có mang vectơ s ng ư c trên môi trư ng có kháng sinh ho c là có kh năng s n sinh m t enzim chuy n hóa m t cơ ch t t o màu phát hi n ư c trên môi trư ng th ch. - Vectơ ph i t n t i trong t bào vi khu n qua nhi u th h và ph i ít gây xáo tr n nh t cho t bào ch . - Vectơ ph i mang nh ng v trí nh n bi t duy nh t ( nghĩa là ch t n t i m t v trí nh n bi t cho m i enzim ) c a m t s lư ng t i a enzim gi i h n( RE). i u này m r ng kh năng xây d ng các vectơ tái t h p.Do m i RE t o m t d ng u sole riêng, có kh năng g n n i v i m t o n AND mang u sole tương ng.Các âu sole càng a
d ng thì các trình t AND g n vào cũng càng a d ng hơn. Hơn n a các v trí cũng s xen vào chính gi a gen và làm b t ho t gen y. 4.3 Các lo i vectơ tách dòng : Có nhi u lo i vectơ :plasmid,phage,cosmid,YAC,…Ngư i ta ch n s d ng m t lo i vectơ d a vào vào kích thư c c a o n AND c n t o dòng và m c ích t o dòng: a. Vectơ tách dòng là Plasmid: - Plasmid là các phân t AND xo n kép d ng vòng,có kích thư c nh ,trong t bào ch t c a t bào vi khu n ho c t bào n m men. Kích thư c trung bình c a plasmid t 1-5kb,plasmid có kh năng t tái b n c l p v i s phân chia t bào.Plasmid cho cài g n các o n AND l , không gây nh hư ng t i ch c năng và ho t ng c a t vi khu n mang m t s ít gen như các gen xác bào.Plasmid nh gi i tính F,gen kháng ch t kháng sinh,gen sinh c t ..M i loài vi khu n có các lo i plasmid c trưng riêng. - Qui ư c: Cách g i tên plasmid:Ch p vi t thư ng là plasmid.M t,hai ho c ba ch cái vi t in hoa là ch u tiên tên tác gi t o nên plasmid ho c tên vi khu n có plasmid ó.Ví d : pBR322 - Các lo i vectơ tách dòng và kích thư c o n AND insert Lo i vectơ Kích thư c AND insert Plasmid 1-5 kb Phage 15-25 kb Phagemid 20-30 kb Cosmid 30-50 kb BAC( thi t k t m t ph n AND E.coli và các plasmid) 100-300 kb TAC (thi t k t m t ph n o n vir gen c a Ti-plasmid) 100-300 kb BiBAC (thi t k t m t ph n AND b gen Agrobacterium) 100-500 kb PAC (b gen c a phage P1 + plasmid) 100-300 kb YAC( thi t k t m t ph n AND b gen c a n m men) 2.000 kb … - M t s lo i plasmid thông d ng: +Plasmid t nhiên ư c tách chi t ư c t vi khu n như pSC101,ColE1.
+Plasmid nhân t o ( th h 2 và th h 3) ư c t o nên b ng cách t p h p các c tính quí c a c a nhi u plasmid t nhiên và thêm các gen ch th và o n a c t n i MCS t o nên các plasmid m nh.Ví d :pBR322,pUC18,pSP64,Gemini..pCR2.1,pET.. b. Vectơ tách dòng là Phage: - Phage ( Bacteriophage) bao g m nhi u lo i th c khu n th có b AND m ch ơn ưc s d ng làm vectơ tác dòng g m nhi u lo i khác ho c m ch kép nhau:f1,M13,fd,λ EBML3, λ GEM 11..Các vectơ tách dòng là phage thư ng ư c t o nên t s c i bi n b gen phage. -Ưu i m c a phage:Dùng vectơ phage có th cài o n ADN l n hơn plasmid,phage có h th ng gen giúp xâm nhi m và t o nên s b n sao r t cao trong t bào vi khu n, có hi u qu cao c t bào prokaryote và eukaryote c. Vectơ tách dòng là Phagemid - Phagemid c u t o g m m t s gen c a plasmid ( các gen ch th , o n ori…) và m t ph n gen c a phage ( o n ori, các gen c n thi t cho s ng gói). Ví d : vectơ pEMBL8 là plasmid c u t o t m t o n c a M13,mang các gen ch th kháng sinh AmpR và lacZ l y t plasid. d. Vectơ tách dòng là Cosmid - Vectơ tách dòng cosmid ư c thi t k t m t o n c a plasmid và o n cos c a phage.Các vectơ cosmid m nh có th ư c g n thêm o n a c t n i (MCS), o n kh i u tái b n (ori) c a vi rut.. - Ví d , vectơ SuperCos kích thư c 7,9 kb có c u trúc g m 2 o n cos c a b gen phage,2 gen ch th kháng sinh (ampicilin và neomycin), o n ori c a virus SV40 và o n c t n i(MCS). Vectơ cosmit cho cài g n AND insert có kích thư c l n t i 50 kb. e. Vectơ tách dòng là Nhi m s c th nhân t o: - B gen c a sinh v t b c cao có kích thư c r t l n nên khi chuy n gen b ng các vectơ thông thư ng t o nên s lư ng dòng r t l n gây khó khăn trong tách dòng.Các nhi m s c th nhân t o ư c thi t k làm vectơ tách dòng cho phép cài g n các o n AND insert có kích thư c r t l n t 100 kb én hàng nghìn kb,t o thu n l i trong tách dòng và l p ngân hàng b gen. M i lo i vectơ tách dòng là nhi m s c th có c trưng riêng,cho phép cài o n AND có kích thư c khác nhau. - Ví d :Vectơ tách dòng là nhi m s c th nhân t o vi khu n BAC ư c thi t k t m t ph n AND b gen c a vi khu n g m các o n ori,các gen ch th c hi u, o n a c t
c hi u.Vectơ này cho phép cài o n AND kích thư c 100- n i MCS và promoter 300kb.và ư c ng d ng trong vi c l p ngân hàng gen c a c t bào prokaryote và eukaryote g. Vectơ tách dòng là Ti plasmid: - Ti plasmid là plasmid có kích thư c l n hơn t i 200kb trong t bào vi khu n Agobecterium tumefacien. Ti plasmid có m t o n T-AND kích thư c kho ng 10- 20kb mang các gen t ng h p opin,auxin..gây nên các kh i u th c v t hai lá m m, Ti plasid ư c c i bi n c u trúc làm vectơ tách dòng và vectơ chuy n gen có hi u qu th c v t. - Ti plasmid kích thư c quá l n, gây khó khăn trong tách dòng gen do ó ngư i ta s d ng m t ph n AND c a Ti plasmid,g n thêm gen ch th và các o n AND ch c năng t o nên các lo i vectơ nh th , vectơ lien h p. Ví d ,pTiC58,pTiAch5 h. Vectơ tách dòng t bào sinh v t eukaryote - ng v t b c cao và th c v t ngư i ta s d n vectơ tách dòng là các i v i t bào lo i virus ư c c i bi n b gen, c t b các gen c l c và cài thêm các gen ch th c hi u - Ví d ,các lo i virus SV40 c i bi n b gen ư c s d ng làm vectơ tách dòng,vectơ chuy n gen sinh v t b c cao . 5. Vectơ bi u hi n gen: 5.1. c i m c u trúc vectơ bi u hi n gen: - Vectơ bi u hi n gen ( expression vectơ) là nh ng vectơ tác dòng mang các promoter m nh,cho phép bi u hi n ng th i c gen ch th và gen tách dòng t o nên các protêin lai( fusion protein). - C u trúc :promoter m nh,trình t kh i u sao chép(ori),v trí kh i u phiên mã,v trí bám c a riboxom, tín hi u k t thúc d ch mã,các trình t a c t n i ( MCS) và các gen ch th … - Vectơ bi u hi n m nh là các vectơ có c i m :có kh năng t o s lư ng l n b n sao trong t bào v t ch ,promoter ho t ng m nh,d ch mã t o nhi u protein lai, o n c hi u c a nhi u lo i enzim gi i h n, vectơ v n gi trình t MCS có nhi u v trí c t ư c ho t tính khi cài g n gen tách dòng kích thư c l n, ho t ng c a vectơ không nh hư ng ho c gây c ch t bào ch , gen ch th d dàng nh n bi t..
5.2 Các lo i promoter thư ng s d ng trong vectơ bi u hi n gen: - Trong t bào prokaryote :vectơ bi u hi n gen thư ng s d ng là promoter m nh c a th c khu n th ho c c a vi khu n..là nh ng lo i promoter thích h p v i nhi u lo i ARN polymerase. Ví d : T7 promoter ki m soát s bi u hi n c a gen mu n bacteriophage T7. - Trong t bào eukaryote thư ng s d ng các vectơ bi u hi n gen có các promoter m nh c a virus CMVpromoter, SV40 promoter, PGK promoter,ADHI promoter,GAL promoter , AOXI promoter…. trư c v trí - V trí cài g n o n DNA tách dòng có th ngây sau promoter ho c c trưng c a o n gen tách dòng và k t thúc phiên mã c a gen ch th . Tùy c u trúc lo i promoter l a ch n v trí g n gen tách dòng thích h p . 6.Các h th ng bi u hi n gen ( Expression systems) Bi u hi n gen t o s n ph m protein tái t h p là k thu t quan tr ng, quy t nh s thành b i c a k thu t gen 6.1. Bi u hi n gen trong t bào vi khu n: ư c ưa chu ng nh t trong bi u hi n gen, do mang *) Vi khu n E.coli là t bào ch nhi u ưu i m hơn so v i các t bào khác: sinh trư ng nhanh, kha năng bi u hi n protein tái t h p m nh, ch sau 8h -T c i u ki n thích h p ã có s n ph m protein tái t h p. kh năng t o s n nuôi c y ph m gen cao t 50mg/lít n 500 mg/lit - Gi m chi phí cho công ngh và hóa ch t, nên giá thành s n ph m h c i m di truy n ã ư c bi t tương - C u trúc b gen E.coli và các i y nên thu n l i khi bi u hi n protein tái t h p. Ch ng vi khu n E.coli BL 21 ư c ưa chu ng và s d ng r ng rãi nh t. * ) H n ch khi s d ng E.coli: - Các gen mã hóa các lo i protein có kích thư c l n hơn 50kD, protein giàu cystein ho c nh ng s n ph m protein có sưn hình thành nhi u liên k t disunfua( S-S) r t khó bi u hi n - T bào E.coli có th cho bi u hi n t t các lo i protein không bi n i c u trúc phân t sau d ch mã và không có quá trình glycosyl hóa.
- M t s ch ng vi khu n E.coli có th gây b nh,ho c t o các c t khi bi u hi n gen c a sinh v t b c cao. - Kh năng t o và ti t protein ngo i bào c a các ch ng vi khu n E.coli tương i th p *) Ngoài ra vi khu n Bacillus cũng có 1 s ưu i m s d ng làm t bào bi u hi n gen 6.2. Bi u hi n gen trong Baculovius nuôi trong t bào côn trùng - Baculovius là nhóm virus ký sinh hơn 600 loài côn trùng khác nhau, có th bi u hi n các gen mã hóa proein có kích thư c l n hơn 50kD, th m chí protein ngư i. - c i m: Baculovius cho phép bi u hi n các protein có ph n ng glycosyl chính xác và có ph n ng c t chu i peptit tín hi u, cho hi u qu cao, giá thành s n ph m protein tái t h p gi m - H n ch : S t o thành protein tái t h p gi m,thư ng sau 4-5 ngày nuôi c y m i có s n ph m,th i gian nuôi c y lâu( sau 10-15 ngày) . m t khác, i u ki n th c hi n công ngh và môi trư ng nuôi c y ph c t p 6.3.Bi u hi n gen trong t bào n m men: - N m men ư c s d ng r ng rãi trong bi u hi n gen sinh v t b c cao do có ưu i m:cho phép s d ng c 2 lo i vectơ bi u hi n prokaryote và eukaryote, bi u hi n protein kích thư c l n hơn 50 kD, c u trúc b gen n m men ã ư c nghiên c u y , không gây b nh, cho s n ph m nhanh (sau 8h nuôi c y ã cho s n ph m protein tái t h p) ,hi u su t bi u hi n gen tương i cao ( 50mg n 5000mg/lit d c nuôi c y) - Các vectơ bi u hi n gen trong t bào n m men thư ng có promoter AOX r t m nh,kh năng ki m soát gen c n bi u hi n cao.. - N m men S.Cceseivisiae và Pichia Pastoris là các t bào bi u hi n gen ư c u chu ng nh t trong các h th ng bi u hi n gen. 6.4 Bi u hi n gen trong t bào ng v t b c cao: Trong s n xu t vaccine tái t h p và nhi u lo i protein có ho t tính sinh h c như interferon, hGH,factor VIII,..ngư i ta thư ng dùng h th ng bi u hi n gen là các t bào S2 c a ru i gi m và t bào tr ng chu t t vàng Trung Qu c. - Ưu i m: Bi u hi n các protein kích thư c l n hơn 50kD, có các promoter m nh SV40,CMV cho phép th c hi n các ph n ng glycosyl hóa,ho c c t chu i tín hi u t vàng Trung Qu c ư c ng d ng s n xu t chính xác.Ví d ,t bào tr ng chu t
nhi u lo i protein tái t h p cho con ngư i,do kh năng t o thành các protein có c u trúc không gian thích h p.. - H n ch :Ch có th bi n n p b ng xung i n, th i gian sang l c r t lâu,nuôi c y ph c t p,giá thành cao. c trưng riêng, do ó c n căn c * Chú ý: M i lo i h th ng bi u hi n có c im vào c i m c a gen bi u hi n, b n ch t protein tách dòng và protein lai( fusion protein) i u ki n c th c a phòng thí nghi m l a ch n h th ng bi u hi n gen thích h p.Thông thư ng n u bi u hi n protein có kích thư c dư i 30 kD thư ng ch n h th ng bi u hi n trong t bào vi khu n.Các protein kích thư c l n hơn có quá trình bi n i sau d ch mã,ho c glycosyl hóa có th ch n h th ng bi u hi n là n m men, baculovirus ho c th bào CHO..