Tìm hiểu kỹ thuật nhân sinh khối tế bào sâu khoang (S. litura)

Chia sẻ: Leon Leon | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

48
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Một số thử nghiệm để xác định các yếu tố cần thiết cho việc nuôi cấy tế bào côn trùng của Spodoptera litura đã được thực hiện trong năm ngoái. Kết quả của những con đường mòn đã chỉ ra rằng trung bình của Ex-Cell 14420 với 10% FBS là thích hợp cho sự phát triển của tế bào côn trùng với mật độ tế bào đạt đến 4,2 x 1010 tế bào mỗi mililit. Khi nuôi cấy tế bào với môi trường này bao gồm 10% FBS ở pH = 7,0, mật độ tế bào là như 3,6 x 1010 sau sáu ngày...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tìm hiểu kỹ thuật nhân sinh khối tế bào sâu khoang (S. litura)

TÌM HI U K THU T NHÂN SINH KH I T BÀO SÂU KHOANG (S. litura) Lê Văn Tr nh SUMMARY Identification of culture technologies on cell propagation of S. litura Some trials to identify necessary factors for insect cell culture of Spodoptera litura have been done in last year. The result of trails had indicated that the medium of Ex-Cell 14420 with 10% FBS was 10 appropriate for development of insect cell culture with density of cells reached to 4,2 x 10 cells per mililit. When cell culture with this medium including 10% FBS at pH= 7,0, the density of cells was as 3,6 x 1010 after six days of culturing. If cells cultured in medium with pH were 6,5 and 7,5, the density of cells was significantly decreased. Among of 5 mediums without FBS have been tested, it was identified that the medium of Ex- Cell 14420 was considered to be most appropriate for cell culture with its density up to 3,2 x 1010 cell/ml. Keywords: Spodoptera litura, insect cell culture, cell propagation I. §ÆT VÊN §Ò ng d ng công ngh nuôi nhân sinh kh i t bào côn trùng s n xu t ch phN m Các ch phNm sinh h c s d ng tác nhân NPV v i qui mô công nghi p ã và ang vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) u b t u phát tri n t i m t s nư c trên th r t chuyên tính và có hi u qu cao trong gi i. Trong th i gian qua, chúng tôi ã tìm phòng tr sâu khoang nói riêng và các sâu hi u theo nh hư ng này, k t qu thu ư c h i cây tr ng nông, lâm nghi p nói chung. bư c u có nhi u tri n v ng, m ra nh Tuy nhiên, các lo i vi rút ch có th t n t i, hư ng m i trong vi c ng d ng công ngh phát tri n ư c trong các t bào s ng và t bào phát tri n ch phN sinh h c b o m trong i u ki n môi trư ng thích h p. Vì v cây tr ng. v y, vi c s n xu t ch phN vi rút òi h i m ph i ư c th c hi n trên cơ th sâu s ng II. VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU ho c trên các mô, t bào sâu h i còn s ng. 1. V t li u nghiên c u Lâu nay, vi c s n xu t NPV v n ti n hành theo phương pháp th công, b ng cách - Th c li u dòng t bào sâu khoang nuôi sâu s ng s lư ng l n, sau ó nhi m vi ư c phát tri n t mô phôi c a sâu khoang. rút NPV c a loài sâu tương ng, r i nghi n - Các lo i môi trư ng nuôi nhân t l c và em ra s d ng. Theo cách này thì bào côn trùng, các lo i kháng sinh c s n xu t ch phN NPV m tr sâu h i khó d ng (như Gentamicine, Fujione) và huy t có th th c hi n v i qui mô công nghi p, vì thanh ph tr FBS (fetal bovin serum) nuôi ư c s lư ng l n m t loài sâu h i trong nuôi nhân do Công ty In-Vitrogen ph c v s n xu t ch phN là m t v n m cung c p. h t s c khó khăn và ph i có i u ki n v - D ng c nuôi c y t bào, như: Bình nhà xư ng, trang thi t b . nuôi c y l c khuN lo i 25 cm2 và 75 cm2. n
2. Phương pháp nghiên c u Trong khi ó, n u nuôi nhân t bào Vi c nghiên c u k thu t nuôi nhân trong môi trư ng Ex-Cell 14420 có ch a sinh kh i t bào ư c ti n hành theo 10% huy t thanh bò thì cũng t hàm lư ng phương pháp c a Granados et al. (2007) và t bào khá cao, t i 3,1 x 1010 t bào/ml, t l Agathos (1994). Các thí nghi m ư c ti n t bào s ng t t i 92,5% và t l t bào hành v i các công th c môi trư ng có b tiêu chuN t ư c là 72,6%. Trong khi ó, n sung thành ph n b tr FBS khác nhau. n u không có 10% ch t b tr (FBS ho c Nh c l i 5 l n, m i l n nh c l i là 1 bình. huy t thanh bò) mà ch có môi trư ng Ex- T bào ư c nuôi c y trong bình c v ch Cell 14420 thì cũng ch t hàm lư ng t Corning l c khuN có di n tích 25 cm2. n bào là 2,7 x 1010 t bào/ml và t l t bào Ngu n t bào cho thí nghi m có hàm lư ng s ng t 96,6% và t l t bào tiêu chuN n 1,5 x 107 t bào/ml. Sau 6 ngày nhân nuôi t 80,3%. nhi t n nh tùy theo t ng thí nghi m. Khi nuôi nhân trên môi trư ng Schneider Sau ó, theo dõi m t t bào trong các l n 0146 cũng di n ra xu hư ng tương t như i nh c l i. v i vi c nuôi nhân t bào trong môi trư ng Ex-Cell 14420. Khi nuôi nhân t bào trong III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN môi trư ng Schneider 0146 có b sung 10% FBS thì hàm lư ng t bào t khá cao, lên t i 1. T l thành ph n huy t thanh b tr cho phát tri n t bào 2,6 x 1010 t bào/ml và t t l t bào s ng t i 95,5% và t l t bào tiêu chuN t i n Ti n hành thí nghi m nuôi nhân t bào 78,3%. Còn s d ng 10% huy t thanh bò thì sâu khoang trên 2 lo i môi trư ng có ch a hàm lư ng t bào t 2,4 x 1010 t bào/ml và các thành ph n huy t thanh b tr khác t l t bào s ng t 89,1% và t l t bào tiêu nhau. K t qu nêu trong b ng 1 cho th y khi chuN t 65,6%. N u ch dùng môi trư ng n nuôi nhân t bào trên môi trư ng Ex-Cell nuôi nhân là Schneider 0146 không có 10% 14420 có ch a 10% ch t b tr FBS thì hàm thành ph n b tr thì ch t hàm lư ng 1,2 x lư ng t bào t m c cao nh t, t t i 4,2 x 1010 t bào/ml v i t l t bào s ng là 94,5% 1010 t bào trong 1 mililit. ng th i, có t và t l t bào có hình d ng tiêu chuN ch t n l t bào s ng t t i 97,2% và t l t bào 78,0%. có hình d ng tiêu chuN t t i 82,3%. n B ng 1. Hàm lư ng t bào sau nuôi nhân trên các môi trư ng ch a huy t thanh khác nhau (Vi n BVTV, 2010) Công Hàm lư ng t % t bào % t bào tiêu Môi trư ng nuôi nhân th c bào (tb/ml) s ng chu n 10 1 Ex-Cell 14420 ch a 10% FBS 4,2 x 10 d 97,2 82,3 10 2 Ex-Cell 14420 ch a 10% huy t thanh bò 3,1 x 10 c 92,5 72,6 10 3 Schneider 0146 ch a 10% FBS 2,6 x 10 b 95,5 78,3 10 4 Schneider 0146 ch a 10% huy t thanh bò 2,4 x 10 ab 89,1 65,6 5 Ex-Cell 14420 (Đ/c 1) 2,7 x 1010 b 96,6 80,3 10 6 Schneider 0146 (Đ/c 2) 1,2 x 10 a 94,5 78,0
B ng 1 cho th y, môi trư ng Ex-Cell K t qu thu ư c sau 6 ngày nhân 14420 có ch a 10% thành ph n b tr là nuôi (B ng 2) cho th y khi pH môi trư ng FBS ho c huy t thanh bò nuôi nhân t nuôi nhân là 7,0 ho c 7,5 thì hàm lư ng t bào sâu khoang là r t thích h p hơn so v i bào tăng lên rõ r t c 2 lo i môi trư ng. môi trư ng Schneider. V i các môi trư ng V i môi trư ng nuôi nhân là Ex-Cell này vi c nuôi nhân t bào sâu khoang có th 14420 có ho c không b sung FBS thì sau cho phép t tương ng là 3,1 x 1010 và 4,2 x 6 ngày i u ki n pH = 6,5 t hàm 1010 t bào/ml. Tuy nhiên, trong th c t n u 9 lư ng t bào tương ng là 6,9 x 10 và 5,9 s d ng huy t thanh bò s găp nhi u khó x 109 t bào/ml. Nhưng khi nuôi nhân khăn trong vi c m b o tiêu chuNn ch t môi trư ng pH = 7,0 thì hàm lư ng t bào lư ng n nh. tăng lên m t cách áng k , t t i 3,6 x 1010 và 3,2 x 1010 t bào/ml (tương ng) 2. Đi u ki n pH c a môi trư ng nuôi nhân và khi pH = 7,5 thì m t t bào có gi m i u ki n pH c a môi trư ng nhân nuôi i, t 1,2 x 10 và 1,0 x 1010 t bào/ml 10 có nh hư ng r t l n n kh năng phát (tương ng) tri n c a t bào. Theo Freshney (1987) và Còn v i môi trư ng nuôi nhân t bào là Weiss et al. (1981), h u h t các lo i t bào Schneider 0146 thì hàm lư ng t bào pH côn trùng trong quá trình phát tri n s môi trư ng là 7,0 và 7,5 cũng cao hơn áng lư ng u yêu c u pH môi trư ng m c k so v i hàm lư ng t bào thu ư c khi trung tính. N u i u ki n c a môi trư ng nuôi nhân môi trư ng có pH = 6,5. Tương ch t pH ≤ 6,0 k t h p v i nhi t nuôi ng v i pH = 6,5 thì hàm lư ng t bào môi 0 c y th p ≤ 20 C thì các enzym tái t h p trư ng Schneider có thêm 10% FBS là 1,4 x không ho t ng và quá trình phân chia t 109 t bào/ml và không b sung thêm 10% bào không di n ra. Ngư c l i, n u pH cao FBS là 1,0 x 109 t bào/ml. Khi nuôi nhân (pH ≥ 7,2) k t h p nhi t ≥300C thì quá b ng môi trư ng này có b sung 10% FBS trình phân chia t bào b c ch vì các pH = 7,0, thì sau 6 ngày hàm lư ng t bào enzym b phân rã. t ư c là 2,1 x 109 t bào/ml và môi Nghiên c u kh năng phát tri n s trư ng không có FBS thì hàm lư ng t bào lư ng t bào trong i u ki n pH môi t ư c là 1,3 x 109 t bào/ml. Khi pH = 7,5 trư ng nuôi nhân khác nhau và ư c i u thì s li u tương ng là 0,8 và 0,7 x 1010 t ch nh trư c khi nuôi nhân b ng NaOH. T bào/ml. bào ư c nuôi c y trong môi trư ng Ex- Như v y, tùy theo t ng lo i môi trư ng Cell 14420 và Schneider có ch a 10% nuôi c y khác nhau hàm lư ng t bào thu thành ph n b tr FBS. Ngu n t bào khi ư c có khác nhau, nhưng i u ki n pH c a ưa vào thí nghi m có hàm lư ng 2,1 x 106 môi trư ng nuôi nhân thích h p là 7,0. i u t bào/ml theo t l d ch t bào và môi này cũng phù h p v i công b c a trư ng là 1: 3. Freshney R. (1987).
B ng 2. Hàm lư ng t bào thu ư c khi môi trư ng nuôi nhân có pH khác nhau (Vi n BVTV, 2010) Công Hàm lư ng t bào (tb/ml) Môi trư ng nuôi nhân th c pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 7,5 9 10 10 1 Ex-Cell 14420 + 10% FBS 6,9 x 10 3,6 x 10 1,2 x 10 9 10 10 2 Ex-Cell 14420 5,6 x 10 3,2 x 10 1,0 x 10 3 Schneider 0146+ 10% FBS 1,4 x 109 2,1 x 1010 0,8 x 1010 9 10 10 4 Schneider 0146 1,0 x 10 1,3 x 10 0,7 x 10 phát tri n t t môi trư ng Ex- Cell 14420 3. Môi trư ng thích h p cho nuôi nhân tt im t 3,02 x 1010 t bào/ml, sau ó t bào sâu khoang là môi trư ng Schneider 0146 t m t Ti n hành ánh giá kh năng phát tri n 1,46 x 1010 t bào/ml. V i các môi trư ng sinh kh i t bào các môi trư ng khác IPL-41; TNM- FH và môi trư ng TC-100 nhau không có 10% huy t thanh b tr cho hi u qu nhân sinh kh i t bào th p FBS. K t qu theo dõi nêu b ng 3 cho hơn, v i m t t bào tương ng là 1,60 x th y nhi t nuôi nhân là 270C t bào 109 ; 1,68 x 109 và 0,96 x 109 t bào/ml. B ng 3. M t t bào các môi trư ng nuôi nhân khác nhau (Vi n BVTV, 2010) Công th c thí nghi m Môi trư ng nuôi nhân M t đ t bào sau 6 ngày nuôi nhân (t bào/ml) 10 1 Ex- Cell 14420 3,02 x 10 c 10 2 Schneider 0146 1,46 x 10 d 9 3 IPL- 41 1,60 x 10 b 4 TNM- FH 1,68 x 109 b 9 5 TC-100 0,96 x 10 a Như v y, trong s 5 lo i môi trư ng tham b tr FBS thì hàm lư ng t bào t m c gia thí nghi m, khi nhân nuôi t bào Ex- cao nh t, t t i 4,2 x 1010 t bào trong 1 Cell 14420 nhi t 270C thì môi trư ng Ex- mililit, t l t bào s ng t t i 97,2% và Cell 14420 cho hi u qu nhân sinh kh i t t l t bào có hình d ng tiêu chuNn t bào t t nh t. Sau ó là môi trư ng Schneider t i 82,3%. 0146. Còn các môi trư ng IPL-41; TNM-FH 2. V i môi trư ng nuôi nhân là Ex- và TC-100 cho hi u qu th p hơn h n. K t Cell 14420 có ho c không b sung FBS thì qu thí nghi m này cũng ch ng t vi c b sau 6 ngày i u ki n pH = 6,5 t hàm sung huy t thanh b tr là c n thi t giúp cho lư ng t bào tương ng là 6,9 x 109 và 5,9 quá trình phát tri n sinh kh i c a t bào sâu x 109 t bào/ml. N hưng môi trư ng pH = khoang t hi u qu cao như c a Granados và 7,0 thì hàm lư ng t bào t t i 3,6 x 1010 Mc Kenna (1995) ã ch rõ. khi có b sung 10% FBS và t 3,2 x 1010 t bào/ml n u không b sung 10% FBS và IV. KÕT LUËN khi pH = 7,5 thì m t t bào gi m i, ch 1. Khi nuôi nhân t bào trên môi t 1,2 x 10 và 1,0 x 1010 t bào/ml 10 trư ng Ex-Cell 14420 có ch a 10% ch t (tương ng).
3. Trong s 5 lo i môi trư ng tham gia edited; Wiley- Liss, N ew York. 397 thí nghi m, thì môi trư ng Ex- Cell 14420 t pages. cao nh t, t i m t 3,02 x 1010 t bào/ml. Sau ó là môi trư ng Schneider 0146, t 6. Granados R.R. and Mc Kenna K.A. 1,46 x 1010 t bào/ml. Các môi trư ng IPL- 1995. Insect cell culture methods and 41; TN M- FH và môi trư ng TC-100 cho their use in virus research. Baculorvirus hi u qu nhân sinh kh i t bào th p hơn, v i expression systems and biopesticides. m t t bào tương ng là 1,60 x 109 ; 1,68 x Editors: Shuler M.L., Wood H.A., 109 và 0,96 x 109 t bào/ml. Granados R.R., Hammer D.A. Wiley - TÀI LI U THAM KH O Liss, Inc. N ew York. 1995. Pg. 13-40. 1. Vi n B o v th c v t. 2001. Báo cáo 7. Maiorella B., Inlow D., Shauger A. Ad t ng k t tài khoa h c c p Nhà nư c Harano D. 1988. Large scale insect cell KHCN.02.07B (1996-2000): Nghiên culture for recombinant protein c u áp d ng công ngh vi sinh (vi production. Biotechnology Journal. N o. khuNn, vi n m, virut) s n xu t ch 6 (1988). Pg. 1406-1410 phNm sinh h c BVTV trong phòng tr 8. Weiss S.A., Smith G.C., Kalter S.S. and sâu h i cây tr ng. 134 trang. Vaughn J.L. 1981. Improved method for 2. Vi t H. T., C m .V. và nnk. 2002. M t the production of insect cell cultures in s k t qu nghiên c u v N PV (N uclear large volume. In Vitro Jounal. N o. 17. Polyhedrosis Virus) và kh năng s Pg. 495- 502. d ng trong phòng tr sâu h i cây tr ng. Tuy n t p công trình nghiên c u b o v Ngư i ph n bi n: TS. Nguy n Văn V n th c v t 2000- 2002. N XB N ông nghi p, Hà N i, Trang 113- 130. 3. Agathos S. . 1994. Large scale insect cell production. Book: Inscet Cell Biotechnology by Editors: Maramorosch K. and Mclntosh. CRC Press, Tokyo. Pg. 89- 103. 4. Elanchezyan K. 2009. Insect cell culture and biotechnology. Current Biotica. Vol.3. N o.3. 2009. Tamil N adu Agriculturl University Publising House. Pg. 458- 489. 5. Freshney R. 1987. Culture of animal cell. Manual of basic technique. Second
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7