Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của loài giun móc truyền lây Ancylostoma ceylanicum

Vietnam J. Agri. Sci. 2019, Vol. 17, No. 3: 196-203 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2019, 17(3): 196-203<br /> www.vnua.edu.vn<br /> <br /> <br /> TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE<br /> TRONG PHÂN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME CATHEPSIN D ASPARTIC PROTEASE<br /> CỦA LOÀI GIUN MÓC TRUYỀN LÂY Ancylostoma ceylanicum<br /> Dương Đức Hiếu1*, Bùi Khánh Linh1, Nguyễn Thu Hương2, Lê Đức Vĩnh3,<br /> Nguyễn Thị Hoàng Yến1, Nguyễn Thị Hồng Chiên1, Nguyễn Văn Phương1<br /> 1<br /> Khoa Thú y, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam<br /> 2<br /> Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TW<br /> 3<br /> Đại học Y Dược Phạm Ngọc Thạch<br /> *<br /> Tác giả liên hệ: ddhieu@vnua.edu.vn<br /> <br /> Ngày nhận bài: 02.04.2019 Ngày chấp nhận đăng: 01.06.2019<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> <br /> Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định sự tồn tại của loài giun móc chó truyền lây Ancylostoma ceylanicum<br /> trên người tại Việt Nam, đồng thời phân tích đặc điểm đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme<br /> cathepsin D aspartic protease của A.ceylanicum, một trong những loại enzyme thủy phân đóng vai trò quan trọng<br /> trong vòng đời phát triển của giun móc (Williamson et al., 2004). Bằng phương pháp KOD-PCR, sự tồn tại của loài<br /> giun móc chó truyền lây Ancylostoma ceylanicum trên người và chó tại Việt Nam được khẳng định. Kết quả so sánh<br /> các trình tự phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của A.ceylanicum cho thấy xuất hiện<br /> nhiều đột biến điểm tại vùng Exon 7, 8, 9. Đặc biệt, 3 đột biến điểm không đồng nghĩa (1 điểm đột biến trên vùng<br /> exon 7 và 2 điểm đột biến trên vùng exon 9) được xác định gây ra sự thay đổi về trình tự axitamin của aspartyl<br /> protease. Kết quả nghiên cứu về tính đa hình đơn nucleotide trên vùng gen mục tiêu này của chúng tôi là cơ sở khoa<br /> học cho việc phát triển các loại vacxin phòng bệnh giun móc hiệu quả sử dụng kháng nguyên cathepsin D aspartic<br /> protease tái tổ hợp.<br /> Từ khóa: Ancylostoma ceylanicum, tính đa hình đơn nucleotide, cathepsin D aspartic protease.<br /> <br /> <br /> Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in the Gene Segment Coding for Cathepsin D<br /> Aspartic Protease of Zoonotic Hookworm Ancylostoma ceylanicum<br /> <br /> ABSTRACT<br /> <br /> This study was conducted to determine the presence of the canine zoonotic hookworm species, Ancylostoma<br /> ceylanicum, in humans in Vietnam and to analyze the single nucleotide polymorphism in the gene segment encoding<br /> A. ceylanicum cathepsin D aspartic protease, one of the hydrolytic enzymes with an important role in the life cycle of<br /> hookworm. The existence of Ancylostoma ceylanicum in dogs and humans in Vietnam was confirmed by KOD-PCR.<br /> Comparative analysis of tthe sequences encoding A. ceylanicum cathepsin D aspartic protease revealed, some<br /> mutations in exon 7, 8, and 9. Three SNPs non-synonymous mutations (one from exon 7 and two from exon 9)<br /> caused the changes in amino acid sequences of aspatyl protease. Our results can be considered for futher studies<br /> on the development of effective vaccine against hookworm disease using recombinant cathepsin D aspartic protease<br /> as an antigen.<br /> Keywords: Ancylostoma ceylanicum, single nucleotide polymorphisms, cathepsin D aspartic protease.<br /> <br /> <br /> lãng quên tại vùng nhiệt đới, ước tính trên 700<br /> 1. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> triệu người tại các quốc gia đang phát triển bị<br /> Bệnh giun móc là một trong những căn nhiễm căn bệnh này (Hotez et al., 2004). Đặc<br /> bệnh truyền lây được Tổ chức Y tế thế giới biệt, Ancylostoma ceylanicum, loài giun móc<br /> WHO xếp vào danh mục những căn bệnh bị chó duy nhất có khả năng lây nhiễm và phát<br /> <br /> 196<br />  Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh,<br /> Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương<br /> <br /> triển thành dạng trưởng thành ở cơ thể người, 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> đã được ghi nhận với tỷ lệ nhiễm cao trên chó<br /> 2.1. Mẫu và nguồn gốc mẫu<br /> và người tại khu vực Đông Nam Á (Traub et<br /> al., 2008; Ngui et al., 2012a; Ngui et al., 2012b; Mẫu phân chó thu thập ngẫu nhiên tại các<br /> Conlan et al., 2012; Inpankaew et al., 2014), hộ nuôi chó tại Hà Nội và Bắc Ninh được chuyển<br /> trong đó có Việt Nam (Dinh et al., 2015; Duong về Phòng thí nghiệm Ký sinh trùng - Bộ môn Ký<br /> et al., 2018). Giun móc ký sinh trong ruột vật sinh trùng, Khoa Thú y, Học viện Nông Nghiệp<br /> chủ, lấy chất dinh dưỡng từ việc hút máu, ly Việt Nam để xét nghiệm. Mẫu ấu trùng giun móc<br /> giải hồng cầu, phân hủy huyết sắc tố người thu từ các bệnh nhân dương tính với trứng<br /> Hemoglobin (Hb) và các loại protein khác bằng giun móc được cung cấp bởi Viện Sốt rét - Ký<br /> con đường thủy phân protein (Williamson et sinh trùng - Côn trùng TW (NIMPE).<br /> al., 2004). Mebendazole và albendazole là<br /> 2.2. Phương pháp phù nổi Fullerborn<br /> những loại thuốc được sử dụng phổ biến trong<br /> việc tẩy giun. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã 5 gram mẫu phân chó được cho vào cốc sạch<br /> chỉ ra tính kháng thuốc trên nhóm giun truyền chứa khoảng 50-60 mL dung dịch nước muối<br /> qua đất, trong đó có loài giun móc Necator bão hòa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc<br /> americanus, do liên quan đến đột biến điểm di dung dịch qua lưới lọc và chuyển dung dịch sang<br /> truyền (Ambrose et al., 2018). Do vậy, việc ống fancol 15 cho đầy, đặt phiến kính lên. Sau<br /> phát triển các loại thuốc tẩy giun mới, cũng 15-20 phút trứng giun sẽ nổi lên bám vào phiến<br /> như vacxin được coi là cần thiết trong việc kính, lấy ra và soi dưới kính hiển vi quang học<br /> phòng chống căn bệnh này. Cathepsin D (x10) xác định trứng giun móc theo khóa định<br /> aspartic protease (aspartyl protease) là một danh Bowman, 2009.<br /> trong những loại enzyme thủy phân đóng vai<br /> 2.3. Phương pháp nuôi ấu trùng trên<br /> trò quan trọng trong việc phân hủy huyết sắc<br /> thạch agar<br /> tố trong quá trình tiêu hóa của giun móc<br /> trưởng thành (Williamson et al., 2002; Khoảng 5 gram mẫu phân chó dương tính<br /> Williamson et al., 2003a), cũng như phân hủy với trứng giun móc được chuyển lên bề mặt đĩa<br /> mô của vật chủ trong quá trình xâm nhập và di thạch agar (2%). Trứng giun móc được nuôi<br /> hành của ấu trùng (Brown et al., 1999; trong tủ ấm 27C và kiểm tra hàng ngày. Sau<br /> Williamson et al., 2003b; Jolodar et al., 2004). khoảng 2-3 ngày nuôi cấy, ấu trùng giun móc<br /> Do đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và được thu và bảo quản trong dung dịch cồn 70.<br /> phát triển của giun móc ở cơ thể vật chủ,<br /> aspartyl protease được nhiều nghiên cứu đánh 2.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số<br /> giá cao về tiềm năng ứng dụng trong việc phát Từng ấu trung giun móc riêng rẽ được rửa<br /> triển vacxin phòng bệnh giun móc (Loukas et sạch bằng dung dịch PBS-Tween20 (0,1%) và<br /> al., 2005). Việc đánh giá tính đa hình đơn chuyển vào ống Eppendorf chứa dung dịch đệm<br /> nucleotide (SNPs) là cần thiết, đặc biệt là lysis gồm Direct PCR Lysis Reagent (Tail)<br /> những đột biến điểm không đồng nghĩa (non- (VIAGEN Biotech, Canada), 1 M Dithiothreitol<br /> synonymous SNPs) dẫn đến sự sai khác trong và Proteinase K (QIAGEN, Hà Lan). Ủ hỗn hợp<br /> trình tự axit-amin có thể làm thay đổi cấu lysis trong 20 phút ở 60C, 10 phút ở 95C. DNA<br /> trúc, chức năng của protein và ảnh hưởng tới tổng số của ấu trùng giun móc được bảo quản<br /> hiệu quả của vacxin phòng bệnh. Trong nghiên trong tủ âm (-20C) đến khi dùng.<br /> cứu bước đầu này, phân đoạn gen (vùng Exon<br /> 2.5. Phương pháp KOD-PCR nhân vùng gen<br /> 7- Exon 8- Exon 9) mã hóa aspartyl protease<br /> mt cox1 và phân đoạn gen aspartyl protease<br /> của loài giun móc truyền lây A.ceylanicum<br /> được giải trình tự và phân tích tính đa hình Cặp mồi HPo1: 5`-TTACGTAGAAGGTCAA<br /> đơn nucleotide. TTTCTTTGG-3` và HPo2: 5`- CTACTTAACCTA<br /> <br /> 197<br /> Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của loài giun móc<br /> truyền lây Ancylostoma ceylanicum<br /> <br /> <br /> TACTCCGGCCTTC-3` được thiết kế dựa trên giây, kéo dài ở 68C - 45 giây), kết thúc kéo dài<br /> trình tự gen ty thể của A. ceylanicum 68C - 5 phút và giữ sản phẩm ở 4C. Sản phẩm<br /> AP017674.1 (NCBI) nhằm nhân phân đoạn gen PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di<br /> mt cox1 (983 bp). Phản ứng KOD- PCR được thực trên thạch agarose 1,5% chứa GelRed (Wako,<br /> hiện sử dụng KOD Fx Neo polymerase với chu kỳ Nhật Bản) trong 30 phút ở 100V trong dung dịch<br /> nhiệt như sau: 94C trong 2 phút, 35 chu kỳ lặp đệm 1X TAE.<br /> lại (94C - 10 giây, 63C - 30 giây, 68C - 1 phút),<br /> 68C - 5 phút và giữ sản phẩm ở 4C. Tính đặc 2.6. Phương pháp TA cloning<br /> hiệu của phản ứng KOD-PCR được kiểm tra sử<br /> Sản phẩm PCR của phản ứng nhân phân<br /> dụng mạch khuôn DNA của các loài giun móc A.<br /> đoạn gen aspartyl protease được tinh sạch bằng<br /> caninum, A. ceylanicum và N. americanus làm<br /> bộ kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN, Hà<br /> đối chứng. Căn cứ vào trình tự genome của A.<br /> Lan) và được gắn với plasmid pCR 2.1-TOPO<br /> ceylanicum JARK01001578.1 (NCBI), cặp mồi bằng TOPO TA Cloning kits (Thermo Fisher<br /> AceyAP3F: 5`-GGTGTTCGCTTTCTGGCTCA-3` Scientific, Mỹ). Sau đó, vector tách dòng gen<br /> và AceyAP3R: 5`-GGTCAATACGTAATCTTCAC được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α<br /> CCTTG-3` được thiết kế phủ vùng mã hóa Exon bằng phương pháp sốc nhiệt và được nuôi trong<br /> 7, 8, 9 của aspartyl protease gen. PCR master môi trường SOC trong tủ ấm lắc 37C. Sau 1 giờ<br /> mix trong 25 ul phản ứng gồm 12,5 ul dung dịch nuôi cấy, tế bào E.coli được cấy chuyển trên bề<br /> đệm 2x KOD Fx PCR, 5 ul 2 mM dNTP, 0,5 ul mặt thạch LB chứa Amplicilin (50 ug/mL) và<br /> KOD Fx Neo polymerase, 0,75 ul 10 uM mồi xuôi chất chỉ thị màu X-Gal, nuôi trong tủ ấm 37C<br /> và ngược, 1ul mạch khuôn DNA và nước cất tinh trong 12 giờ. Kiểm tra sự phát triển của khuẩn<br /> sạch. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như lạc, chọn lọc các khuẩn dương tính (màu trắng)<br /> sau: khởi đầu 94C trong 2 phút, 35 chu kỳ lặp và tiến hành phản ứng Colony PCR sử dụng cặp<br /> lại (biến tính 98C -10 giây, gắn mồi ở 63C - 30 mồi AceyAP3F và AceyAP3R.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Ghi chú: M: thang chuẩn DNA; giếng 1,2: mẫu ấu trùng giun móc từ chó; giếng 3,4: mẫu ấu trùng giun móc từ người<br /> <br /> Hình 1. (A) Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR sử dụng cặp mồi HPo1<br /> và HPo2 nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1 nhằm sàng lọc loài giun móc A.ceylanicum;<br /> (B) Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1 của A.ceylanicum<br /> trên gel Agarose 1,5%<br /> <br /> <br /> 198<br />  Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh,<br /> Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương<br /> <br /> <br /> 2.7. Phương pháp Sequencing PCR và giải Kết quả phân lập ấu trùng giun móc truyền<br /> trình tự gen lây A.ceylanicum từ chó và người bằng KOD-<br /> PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân phân đoạn<br /> Sản phẩm Colony PCR sau khi tinh sạch gen ty thể mt cox1 (983bp) được thể hiện ở hình<br /> được sử dụng là mạch khuôn cho phản ứng 1B. Kết quả điện di cho thấy một dải băng sáng<br /> Sequencing PCR bằng bộ kit BigDye rõ nét duy nhất ở mỗi làn chạy có kích thước<br /> Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Thermo 983bp. Như vậy, trong các mẫu ấu trùng giun<br /> Fisher Scientific, Mỹ). Chu trình nhiệt của phản móc thu được từ chó và người, chúng tôi đều<br /> ứng Sequencing PCR như sau: ủ 96C trong 1 phát hiện sự tồn tại và phân lập thành công loài<br /> phút, 25 chu kỳ lặp lại (biến tính 96C - 10 giây, giun móc chó truyền lây A.ceylanicum trên cả 2<br /> gắn mồi ở 50C - 5 giây, kéo dài ở 60C - 4 phút) vật chủ (người và chó).<br /> và giữ sản phẩm ở 4C. Sản phẩm Sequencing<br /> PCR được tinh sạch bằng hạt từ tính - Magnetic 3.2. Tách dòng gen aspartyl protease của<br /> Bead Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Ancylostoma ceylanicum bằng vector tách<br /> Mỹ) và chuyển vào đĩa PCR 96 giếng. Trình tự dòng TA cloning<br /> gen được giải mã sử dụng phương pháp Sanger<br /> Sequencing bằng hệ thống máy giải trình tự gen Với các mẫu DNA tổng số của ấu trùng giun<br /> ABI Prism 3100 genetic analyzer (Applied móc A.ceylanicum sau khi định danh bằng phản<br /> Biosystems, Mỹ). ứng KOD-PCR, chúng tôi tiếp tục sử dụng làm<br /> mạch khuôn nhằm nhân phân đoạn gen<br /> 2.8. Xử lý số liệu aspartic protease mục tiêu có kích thước khoảng<br /> 810 bp (Hình 2).<br /> Toàn bộ kết quả trình tự gen được xử lý,<br /> Sau khi tinh sạch, 17 sản phẩm PCR nhân<br /> phân tích và so sánh bằng phần mềm 4Peak và<br /> phân đoạn gen mã hóa enzyme aspartyl<br /> MEGA7, đồng thời sử dụng hệ thống dữ liệu về<br /> protease của A.ceylanicum phân lập từ 11 mẫu<br /> trình tự gen, trình tự protein từ NCBI để tham<br /> ấu trùng giun móc từ chó và 6 mẫu từ người<br /> khảo.<br /> được lựa chọn gắn với vector tách dòng TOPO-<br /> TA cloning và biến nạp vào tế bào khả biến<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN E.coli DH5α. Ít nhất 12 khuẩn lạc dương tính<br /> 3.1. Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR (màu trắng) của từng mẫu được lựa chọn ngẫu<br /> và kết quả sàng lọc loài giun móc truyền lây nhiên (Hình 3A), kiểm tra bằng Colony PCR<br /> Ancylostoma ceylanicum thu tại Việt Nam (Hình 3B) và tiến hành giải trình tự gen.<br /> <br /> Tính đặc hiệu của phản ứng KOD-PCR 3.3. Tính đa hình đơn nucleotide trong<br /> phân biệt loài giun móc truyền lây A. phân đoạn gen mã hóa enzyme aspartyl<br /> ceylanicum được kiểm tra bằng các mẫu DNA protease của Ancylostoma ceylanicum<br /> đối chứng được tách chiết từ giun móc trưởng<br /> thành của các loài A. caninum, A. ceylanicum và Sau khi phân tích kết quả giải trình tự gen<br /> N. americanus đã được định loài bằng hình thái và BLAST trên NCBI, chúng tôi xác định được 22<br /> học. Kết quả thể hiện ở hình 1A cho thấy với điểm SNPs trên phân đoạn gen mã hóa enzyme<br /> mẫu A.ceylanicum chỉ cho 1 dải băng duy nhất aspartyl protease của loài giun móc chó truyền<br /> có kích thước như dự đoán ở vị trí 983bp, với lây A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam.<br /> mẫu A.caninum thu được nhiều dải băng không Kết quả ở bảng 1 cho thấy, số lượng SNPs ở<br /> đặc hiệu và không có kết quả dương tính nào với vùng Exon 8 là nhiều nhất, tuy nhiên các đột<br /> mẫu N. americanus. Như vậy, phản ứng KOD- biến điểm này đều là đột biến điểm đồng nghĩa<br /> PCR sử dụng cặp mồi HPo1 và HPo2 đảm bảo và không hề ảnh hưởng tới sự sai khác về trình<br /> tính đặc hiệu khi phân loại loài giun tự axit-amin của aspartic protease. Trong khi<br /> móc A.ceylanicum. đó, 3 đột biến điểm (1 SNP tại vùng Exon 7 và 2<br /> <br /> 199<br /> Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của loài giun móc<br /> truyền lây Ancylostoma ceylanicum<br /> <br /> <br /> SNPs tại vùng Exon 9) đều dẫn đến sự thay đổi et al., 2013). Một nghiên cứu của Barry et al.<br /> về axit amin. Cụ thể, codon ACA mã hóa (2006) về phân tích tính đa dạng trong kiểu gen<br /> Threonine tại vùng Exon 7 chuyển thành bộ ba mã hóa enzyme aspartyl protease của ký sinh<br /> ATA mã hóa Isoleucine (Hình 4). Tại vùng Exon trùng sốt rét Plasmodium falciparum cũng đã<br /> 9, CTC mã hóa Leucine thành CCC mã hóa chỉ ra nhiều điểm SNPs trên bề mặt cấu trúc<br /> Proline và CCT mã hóa Proline chuyển thành của protein này và có thể liên quan đến sự thay<br /> TCT mã hóa Serine (Hình 5). Tính đa hình đơn đổi vai trò đặc tính của enzyme. Thí nghiệm<br /> SNPs trên một số vùng gen chức năng khác của trên chuột cho thấy, kháng thể kháng enzyme<br /> loài giun móc cũng đã được nghiên cứu như aspartyl protease có thể làm giảm 16-26% số<br /> beta-tubulin gen mã hóa protein beta-tubulin, lượng ấu trùng L3 xâm nhập và di hành qua da<br /> một loại protein quan trọng tham gia vào quá chuột (Williamson et al., 2003b). Theo Loukas et<br /> trình phân chia tế bào. Cơ chế của các loại thuốc al. (2005), vắc xin chế tạo từ protein aspatyl<br /> tẩy giun phổ biến như albendazole hay protease tái tổ hợp sử dụng thử nghiệm đã làm<br /> mebendazole là kìm hãm quá trình hình thành giảm số lượng giun móc trong ruột chó và giảm<br /> thoi vô sắc từ beta-tubulin trong thời kỳ phân số lượng trứng bài thải ra môi trường so với<br /> bào, do vậy tiêu diệt được giun móc (Kwa et al., nhóm đối chứng, đồng thời làm giảm mất máu<br /> 1993; Kwa et al., 1994). Tuy nhiên, các đột biến và các biến đổi bệnh tích ở ruột của chó. Tuy<br /> điểm ở vị trí F167Y hoặc F200Y trên vùng gen nhiên, những nghiên cứu trong và ngoài nước về<br /> mã hóa beta-tubulin trên loài giun móc Necator tính đa hình trong kiểu gen cathepsin D<br /> americanus được xác định là marker chỉ thị cho aspartic protease của giun móc, về đột biến<br /> sự kháng thuốc tẩy giun. Sự tồn tại những đột điểm liên quan đến sự thay đổi cấu trúc và chức<br /> biến điểm này trong kiểu gen của giun móc đã năng của loại enzyme đó, về ảnh hưởng của sự<br /> được ghi nhận ở Ghana (Ambrose et al., 2018), thay đổi này đến hiệu quả của vắc xin phòng<br /> Bzazil (Furtado et al., 2014) và Kenya (Diawara bệnh còn rất hạn chế.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Ghi chú: M: thang chuẩn DNA<br /> <br /> Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn gen mã hóa enzyme aspartyl protease<br /> của A.ceylanicum trên gel Agarose 1,5%<br /> <br /> Bảng 1. Số lượng đột biến điểm (SNPs), đột biến điểm đồng nghĩa<br /> và đột biến điểm không đồng nghĩa phát hiện trên vùng Exon 7, Exon 8 và Exon 9<br /> của phân đoạn gen mã hóa enzyme aspartyl protease của A.ceylanicum<br /> Exon 7 Exon 8 Exon 9<br /> SNPs: 7 11 4<br /> Đột biến điểm đồng nghĩa (synonymous SNPs) 6 11 2<br /> Đột biến điểm không đồng nghĩa (non-synonymous SNPs) 1 2<br /> <br /> <br /> <br /> 200<br />  Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh,<br /> Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh khuẩn lạc của E.coli DH5α sau khi nuôi cấy trên thạch LB chứa<br /> Amplicilin và X-Gal (A) và kết quả Colony PCR (B). M: thang chuẩn DNA<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Ghi chú: A - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum không chứa đột biến điểm<br /> tại vùng Exon 7, B - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum xảy ra đột biến điểm<br /> tại vùng Exon 7<br /> <br /> Hình 4. Vị trí đột biến điểm không đồng nghĩa tại vùng Exon 7 của phân đoạn gen mã hóa<br /> enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam sau khi so sánh với<br /> trình tự gen (JARK01001578.1; AY181028.1) và protein (AAO22152.1) tham khảo từ NCBI<br /> <br /> <br /> trọng trong quá trình thủy phân hemoglobulin<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> và các loại protein trong đường tiêu hóa của<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác giun móc, tính đa hình đơn nucleotide được<br /> định sự tồn tại của loài giun móc truyền lây A. phân tích và xác định được 3 điểm SNPs không<br /> ceylanicum trên cả hai đối tượng vật chủ là đồng nghĩa làm thay đổi trình tự axitamin của<br /> người và chó ở Việt Nam dựa trên kết quả KOD- enzyme thủy phân này tại vùng Exon 7 và Exon<br /> PCR nhân phân đoạn gen ty thể mt cox1. Căn 9, cụ thể ở các vị trí ACA811ATA Thr265IIE,<br /> cứ vào kết quả phân tích trình tự phân đoạn gen CTC1030CCC Leu338Pro và CCT1036TCT<br /> mã hóa cathepsin D aspartic protease của loài Pro340Ser căn cứ theo trình tự tham khảo<br /> A.ceylanicum, một trong những enzyme quan AY181028.1 và AAO22152.1 từ NCBI.<br /> <br /> 201<br /> Tính đa hình đơn nucleotide trong phân đoạn gen mã hóa enzyme cathepsin D aspartic protease của loài giun móc<br /> truyền lây Ancylostoma ceylanicum<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Ghi chú: A - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum không chứa đột biến điểm<br /> tại vùng Exon 9, B - Trình tự phân đoạn gen enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum xảy ra đột biến điểm<br /> tại vùng Exon 9<br /> <br /> Hình 5. Các vị trí đột biến điểm không đồng nghĩa tại vùng Exon 9 của phân đoạn gen mã<br /> hóa enzyme aspartyl protease của A. ceylanicum phân lập tại Việt Nam sau khi so sánh với<br /> trình tự gen (JARK01001578.1; AY181028.1) và protein (AAO22152.1) tham khảo từ NCBI<br /> <br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO Brown A., Girod N., Billett E.E. & Pritchard D.I.<br /> (1999). Necator americanus (human hookworm)<br /> Ambrose R.O., Josephine E.Q., Peter S., Santosh G., aspartyl proteinases and digestion of skin<br /> Lisa M.H., Fabio P.D., Benjamin E., Adalgisa C., macromolecules during skin penetration. Am J<br /> Debbie H., Michael D.W. & Michael C. (2018). Trop Med Hyg. 60: 840-847.<br /> Genetic markers of benzimidazole resistance Bowman D.D., Georgi J.R. & Saunders. (2009).<br /> among human hookworms (Necator americanus) Georgis’ Parasitology for Veterinarians. 10th ed.,<br /> in Kintampo North Municipality, Ghana. The Elsevier.<br /> American Journal of Tropical Medicine and Conlan J.V., Khamlome B., Vongxay K., Elliot A.,<br /> Hygiene. https://doi.org/10.4269/ajtmh.18-0727. Pallant L., Sripa B., Blacksell S.D., Fenwick S. &<br /> Barry A.E., Leliwa-Sytek A., Man K., Kasper J.M., Thompson R.C. (2012). Soil-transmitted<br /> Hartl D.L. & Day K.P. (2006). Variable SNP helminthiasis in Laos: a community-wide cross-<br /> density in aspartyl-protease genes of the malaria sectional study of humans and dogs in a mass drug<br /> parasite Plasmodium falciparum. Gene. 376(2): administration environment. The American Journal<br /> 163-73. of Tropical Medicine and Hygiene. 86: 624-34.<br /> <br /> 202<br />  Dương Đức Hiếu, Bùi Khánh Linh, Nguyễn Thu Hương, Lê Đức Vĩnh,<br /> Nguyễn Thị Hoàng Yến, Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Văn Phương<br /> <br /> Diawara A., Halpenny C.M., Churcher T.S., Loukas A., Bethony J.M., Mendez S., Fujiwara R.T.,<br /> Mwandawiro C., Kihara J., Kaplan R.M., Streit Goud G.N., Ranjit N., Zhan B., Jones K., Bottazzi<br /> T.G., Idaghdour Y., Scott M.E., Basáñez M.G. & M.E. & Hotez P.J. (2005). Vaccination with<br /> Prichard R.K. (2013). Association between recombinant aspartic hemoglobinase reduces<br /> response to albendazole treatment and β-tubulin parasite load and blood loss after hookworm<br /> genotype frequencies in soil-transmitted infection in dogs. PLOS Medicine. 2: 295.<br /> helminthes. PLOS Neglected Tropical Diseases. Ngui R., Lim Y.A., Traub R., Mahmud R. & Mistam<br /> 7(5): 2247. M.S. (2012a). Epidemiological and genetic data<br /> Dinh N.N., Sze F.H., Van-Anh T.N., Trong V.N., Dien supporting the transmission of Ancylostoma<br /> V.N. & Rebecca J.T. (2015). Re-evaluation of the ceylanicum among human and domestic animals.<br /> species of hookworms infecting dogs in Central PLOS Neglected Tropical Diseases. 6: 1522.<br /> Vietnam. Parasites & Vectors. 8: 401.<br /> Ngui R., Ching L.S., Kai T.T., Roslan M.A., Lim Y.A.<br /> Duong D. H., Bui K. L., Nguyen T. H., Tran T. D., Eiji (2012b). Molecular identification of human<br /> N., Haruhiko M., Ayako Y. & Nariaki N. (2018). hookworm infections in economically<br /> Phylogenetic relationship between Ancylostoma disadvantaged communities in Peninsular<br /> ceylanicum populations found in dogs and humans Malaysia. The American Journal of Tropical<br /> in Vietnam. Vietnam Journal of Infectious Medicine and Hygiene. 86: 837-42.<br /> Diseases. 6: 53.<br /> Traub R.J., Inpankaew T., Sutthikornchai C., Sukthana<br /> Furtado L. F., Bello A.C., Dos Santos H.A., Carvalho<br /> Y. & Thompson R.C. (2008). PCR-based<br /> M.R., Rabelo E.M. (2014). First identification of<br /> coprodiagnostic tools reveal dogs as reservoirs of<br /> the F200Y SNP in the β-tubulin gene linked to<br /> zoonotic ancylostomiasis caused by Ancylostoma<br /> benzimidazole resistance in Ancylostoma caninum?<br /> ceylanicum in temple communities in Bangkok.<br /> Veterinary Parasitology. 206 (3-4): 313-316.<br /> Veterinary Parasitology. 155: 67-73.<br /> Hotez P.J., Brooker S., Bethony J.M., Bottazzi M.E.,<br /> Loukas A. & Xiao S. (2004). Hookworm infection, Williamson A.L., Brindley P.J., Abbenante G., Prociv<br /> The New England Journal of Medicine. 351: 799- P., Berry C., Girdwood K., Pritchard D.I., Fairlie<br /> 807. D.P., Hotez P.J., Dalton J.P. & Loukas A. (2002).<br /> Cleavage of hemoglobin by hookworm cathepsin<br /> Inpankaew T., Schar F., Dalsgaard A., Khieu V., D aspartic proteases and its potential contribution<br /> Chimnoi W., Chhoun C., Sok D., Marti H., Muth to host specificity. The FASEB Journal. 16:1458-<br /> S., Odermatt P. & Traub R.J. (2014). High<br /> 1460.<br /> prevalence of Ancylostoma ceylanicum hookworm<br /> infections in humans, Cambodia. Emerging Williamson A.L., Brindley P.J., Abbenante G., Datu<br /> Infectious Diseases. 20: 976-82. B.J., Prociv P., Berry C., Girdwood K., Pritchard<br /> Jolodar A., Fischer P., Buttner D.W., Miller D.J., D.I, Fairlie D.P., Hotez P.J., Zhan B. & Loukas A.<br /> Schmetz C. & Brattig N.W. (2004). Onchocerca (2003a). Hookworm aspartic protease, Na-APR-2,<br /> volvulus: expression and immunolocalization of a cleaves human hemoglobin and serum proteins in a<br /> nematode cathepsin D-like lysosomal aspartic host-specific fashionThe Journal of Infectious<br /> protease. Experimental Parasitology. 107: 145-156. Diseases. 187: 484-494.<br /> Kwa M.S., Kooyman F.N., Boersema J.H. & Roos Williamson A.L., Brindley P.J. & Loukas A. (2003b).<br /> M.H. (1993). Effect of selection for benzimidazole Hookworm cathepsin D aspartic proteases:<br /> resistance in Haemonchus contortus on beta- contributing roles in the host-specific degradation<br /> tubulin isotype 1 and isotype 2 genes Biochemical of serum proteins and skin macromolecules.<br /> and Biophysical Research Communications. 191: Parasitology. 126: 179-185.<br /> 413-419. Williamson A. L., Paolo Lecchi, Bejamin E.T,<br /> Kwa M.S., Veenstra J.G. & Roos M.H. (1994). Youngchol C., Peter J.H., James H.K, Lewwis<br /> Benzimidazole resistance in Haemonchus C.K., Mohammed S., Charles S.C. & Alex L.<br /> contortus is correlated with a conserved mutation (2004). A multi-enzyme cascade of hemoglobin<br /> at amino acid 200 in beta-tubulin isotype 1. proteolysis in the intestine of blood-feeding<br /> Molecular and Biochemical Parasitology. hookworms. Journal of Biological Chemistry. 279:<br /> 63:299-303. 35950-35957.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 203<br />