TINH SẠCH ÁI LỰC MIỄN DỊCH

Chia sẻ: Thành Trực | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

158
lượt xem 31
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kháng thể là các gamma globulin có trong huyết thanh của động vật có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó. Kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin), viết tắt là Ig, vì khi chạy điện di miễn dịch thì kháng thể nằm ở vùng globulin.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: TINH SẠCH ÁI LỰC MIỄN DỊCH

IMMUNOAFFINITY PURIFICATION TINH SẠCH ÁI LỰC MIỄN DỊCH -----o0o----- I. Giới thiệu chung 1. Kháng thể 1.1. Định nghĩa (1) Kháng thể là các gamma globulin có trong huyết thanh của động vật có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó. Kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin), viết tắt là Ig, vì khi chạy điện di miễn dịch thì kháng thể nằm ở vùng globulin. Hình 1: Điện di protit huyết tương 1.2. Cấu trúc của kháng thể miễn dịch (1), (2) Tất cả các kháng thể là một phân tử đối xứng, đều có cấu trúc giống nhau gồm 4 chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ ký hiệu là L và 2 chuỗi nặng ký hiệu là H, giống nhau đôi một, gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S). 1
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION (a) (b) 2
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION (c) (d) Hình 2 (a,b,c,d): Cấu trúc của một phân tử kháng thể 3
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION 1.2.1. Chuỗi nhẹ L (light) Mỗi chuỗi nhẹ là một chuỗi polypeptid cấu tạo bởi khoảng 214 axit amin, được đánh số thứ tự từ đầu NH2 đến đầu COOH và được chia thành hai vùng: - Vùng hằng định C (constant: hằng định): nằm ở sau, có loại và trình tự axxit amin không thay đổi. - Vùng thay đổi V (variable: thay đổi): nằm phía trước, có loại và trình tự axit amin thay đổi tùy theo từng loại kháng thể. Đặc biệt, trong vùng V có một vùng mà loại và trình tự axit amin rất hay thay đổi gọi là vùng siêu biến. Mỗi loại kháng thể đơn dòng có một vùng siêu biến khác nhau.Có hai loại chuỗi nhẹ khác nhau: chuỗi kappa và chuỗi lamda. Trong phân tử kháng thể hai chuỗi nhẹ giống nhau (hai chuỗi kappa hoặc hai chuỗi lamda). 1.2.2. Chuỗi nặng H (heavy) Chuỗi nặng có cấu tạo tương tự chuỗi nhẹ: chuỗi polypeptid gồm khoảng 440 axit amin, được đánh số thứ tự từ đầu NH2 đến đầu COOH và được chia thành ba hoặc bốn vùng tùy theo từng chuỗi nặng: các vùng C gồm CH1, CH2, CH3 (và CH4), vùng V và vùng siêu biến. Mỗi loại kháng thể đơn dòng có một vùng siêu biến khác nhau. Có 5 loại chuỗi nặng khác nhau: chuỗi gamma, chuỗi alpha, chuỗi muy, chuỗi delta và chuỗi epsilon. Trong phân tử kháng thể hai chuỗi nặng giống nhau. 1.2.3. Sự liên kết giữa các chuỗi Hai chuỗi nặng nối với nhau bằng các cầu nối disulfua (S - S), số cầu nối disulfua thay đổi tùy từng chuỗi. Chuỗi nhẹ nối với chuỗi nặng cũng bằng các cầu nối disulfua. Trên chuỗi nặng, giữa CH1 và CH2 là vùng bản lề. Nhờ vùng bản là này mà phân tử kháng thể có thể khép lại hoặc mở ra 0-180 độ làm cho phân tử kháng thể dễ dàng gắn với các quyết định kháng nguyên tương ứng. 1.2.4. Các mảnh của kháng thể Các men tiêu đạm như papain, pepsin có thể cắt phân tử kháng thể ra thành các mảnh. Papain cắt phân tử kháng thể ngay trước vùng bản lề cho ra 2 mảnh Fab và 1 mảnh Fc. Pepsin cắt phân tử kháng thể sau cùng bản lề cho ra 1 mảnh F (a’b’) 2 và một mảnh Fc’.F (fragment: mảnh), ab (antigen binding: gắn kháng nguyên), c (cristallisable: kết tinh được) 1.2.5. Vị trí kết hợp kháng nguyên, hóa trị kháng thể Hai vùng siêu biến của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể tạo thành vị trí kết hợp với quyết định kháng nguyên tương ứng. Mỗi phân tử kháng thể nguyên vẹn có hai vị trí kết hợp, gọi là hóa trị hai. Mảnh Fab có một hóa trị, mảnh F(a’b’) 2 có hóa trị hai.Do phân tử kháng thể có hóa trị hai, kháng nguyên có nhiều quyết định kháng 4
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION nguyên, nên phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể có thể tạo thành mạng lưới Marrack. 1.2.6. Các lớp kháng thể - Tên của các lớp: Kháng thể dịch thể được chia thành năm lớp: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Tên của lớp dựa theo tên của chuỗi nặng. Bảng 1. Tên các chuổi nặng và chuổi nhẹ của các lớp Ig Các lớp còn được chia thành dưới lớp: IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 trong đó các chuỗi nặng lần lượt là gamma 1, gamma 2, gamma 3, gamma 4. IgA: IgA1, IgA2 tùy theo chuỗi nặng là alpha 1 và alpha 2. - Đặc điểm về cấu trúc của các lớp: ● IgG ở dạng monome đơn phân tử, trọng lượng là 150000 (chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda là 25000, chuỗi nặng gamma là 50000). ● IgA có 2 dạng: dạng monome đơn phân tử, trọng lượng là 160000, dạng dime nhị phân thường có trong dịch tiết gọi là IgA tiết (slgA, secretoire: tiết). ● Igm thường ở dạng ngũ phân trọng lượng là 900000. ● IgD ở dạng đơn phân tử trọng lượng 175000. ● IgE ở dạng đơn phân tử trọng lượng là 190000. Các immunoglobulin khác nhau về chuỗi nặng: về tỉ lệ % gluxit và đặc biệt là khác nhau ở đoạn Fc liên quan đến chức năng của từng immunoglobulin. 5
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION Bảng 2: Tính chất của các lớp kháng thể 1.3. Đặc điểm, chức năng của kháng thể (1) 1.3.1. Đặc điểm của kháng thể 1.3.1.1. Tính kháng thể Tính kháng thể là khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng, đặc hiệu có nghĩa là kháng thể do kháng nguyên nào kích thích tạo ra thì chỉ kết hợp với 6
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION kháng nguyên ấy mà thôi. Tính kháng thể là đặc điểm quan trọng nhất của kháng thể.Tuy nhiên đôi khi xảy ra phản ứng chéo giữa kháng thể và kháng nguyên không tương ứng do kháng nguyên này có cấu trúc gần giống với kháng nguyên đã kích thích tạo ra nó. Phản ứng chéo cho hình ảnh dương tính giả trong phản ứng miễn dịch. Vị trí gắn với kháng nguyên nằm ở đoạn Fab, giữa các CDR của mỗi cặp chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Như vậy mỗi phân tử kháng thể nguyên vẹn có hai vị trí gắn với kháng nguyên, gọi là có hóa trị hai. Kháng thể dạng dime có hóa trị 4, kháng thể dạng pentame có hóa trị 10. Nhờ kháng thể có hóa trị hai trở lên mà kết hợp kháng nguyên- kháng thể có thể tạo ra được mạng lưới Marrack. Đoạn F(a’b’)2 cũng có hóa trị hai nên có thể được sử dụng thay thế phân tử kháng thể nguyên vẹn trong một số phản ứng miễn dịch khi cần tránh những tác dụng riêng của đoạn Fc. 1.3.1.2. Tính kháng nguyên - Tính kháng nguyên của phân tử kháng thể là khả năng kích thích cơ thể khác tạo ra kháng thể kháng lại chính nó. Lý do là phân tử kháng thể bản chất là một loại protit có trọng lượng phân tử đủ lớn, đủ tiêu chuẩn là một kháng nguyên đối với cơ thể khác. Kháng thể kháng lại kháng thể được gọi là anti-lg. - Phân biệt 3 nhóm kháng nguyên trên phân tử kháng thể: + Nhóm kháng nguyên isotyp: Các quyết định kháng nguyên isotyp giống nhau ở mọi cá thể trong cùng một loài và nằm trên vùng hằng định của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ.Các lớp dưới kháng thể IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD và IgE có các quyết định kháng nguyên isotyp khác nhau. + Nhóm kháng nguyên allotyp: Các quyết định kháng nguyên allotyp giống nhau ở một số cá thể trong cùng một loài và nằm rải rác trên vùng hằng định của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. + Nhóm kháng nguyên idiotyp: Các quyết định kháng nguyên idiotyp đặc trưng cho từng cá thể và nằm trên vùng thay đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Mỗi quyết đinh kháng idiotyp được gọi là idiotop, tập các idiotop gọi là idiotyp. 1.3.2. Chức năng của kháng thể 1.3.2.1. Chức năng do vùng hằng định Fc đảm nhiệm - Cố định bổ thể: Phân tử kháng thể thuộc các lớp và dưới lớp IgM, IgG1, IgG2, IgG3 sau khi kết hợp với kháng nguyên thì sự tương tác giữa các đoạn Fc của chúng làm bộc lộ vị trí cố định bổ thể trên CH2, nhờ đó thành phần C1q của bổ thể đến bám vào, dẫn đến hoạt hóa bổ thể theo con đường cổ điển (xem phần Bổ thể). - Truyền qua rau thai: Do đặc điểm cấu tạo của đoạn Fc của phân tử kháng thể thuộc lớp IgG, nhất là dưới lớp IgG1, IgG3, IgG4, kháng thể có thể được truyền từ mẹ 7
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION qua thai nhi, tạo đáp ứng miễn dịch thụ động cho trẻ sơ sinh trong khoảng sáu tháng đầu tiên. - Gắn trên bề mặt tế bào: Các phân tử kháng thể thuộc các lớp và dưới lớp IgE, IgG1, IgG3, IgG4 có khả năng gắn trên bề mặt các tế bào mast và bạch cầu ái kiềm thông qua các receptor đối với đoạn Fc của chúng (FcR). Do vậy khi có kháng nguyên đến kết hợp với kháng thể trên bề mặt các tế bào này thì sẽ dẫn tới hai quá trình: (1) quá trình giải phóng các chất sinh học có sẵn trong các hạt của tế bào như histamin, serotonin; (2) quá trình tổng hợp từ phospholipit màng tế bào tạo ra các chất như là PAF, leucotrien, prostaglandin, thromboxan gây quá mẫn nhanh (xem chương Rối loạn miễn dịch). - Gây hiện tượng opsonin hóa (opsonisation): Các đại thực bào và bạch cầu đa nhân trung tính có receptor đối với đoạn Fc của các kháng thể thuộc lớp IgG và IgM. Khi các kháng thể này kết hợp với các kháng nguyên vi khuẩn, thì các đoạn Fc của chúng thu hút các FcR của đại thực bào và bạch cầu đa nhân trung tính, làm cho những tế bào thực bào này dễ tiếp cận vi khuẩn hơn. Cũng theo cơ chế trên, các tế bào NK (natural killer: tế bào giết tự nhiên) nhờ có FcR đối với đoạn Fc của lớp kháng thể IgG nên dễ tiếp cận và tiêu diệt tế bào đích hơn. Hiện tượng này gọi là hiệu ứng ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity: độc tế bào phụ thuộc kháng thể). 1.3.2.2. Chức năng do vùng thay đổi V đảm nhiệm - Nhận diện kháng nguyên: Chức năng này đã được trình bày trong phần tính kháng thể. Thông qua phản ứng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng mà kháng nguyên (1) trung hòa kháng nguyên hòa tan như độ tố vi khuẩn; (2) ngưng kết thành các thành phần hữu hình như vi khuẩn; (3) ngăn cản vi khuẩn bám vào màng nhầy niêm mạc đường hô hấp và tiêu hóa (tác dụng của slgA). - Truyền tín hiệu: Sự nhận diện kháng nguyên tạo tín hiệu cho lympho B tái phân bố các kháng thể bề mặt mở đầu cho quá trình trình diện kháng nguyên của lympho B. 8 Hình 3: Vị trí các điểm chức năng trên phân tử IgG
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION Mỗi chuỗi nhẹ có 2 gấp khúc và mỗi chuỗi nặng có 4 gấp khúc. Mỗi gấp khúc có khoảng 60 axit amin. Edelman (1970) cho rằng chức năng vùng gấp khúc VH và VL là hợp tác với nhau để tạo nên bề mặt của vị trí kết hợp với kháng nguyên. Các vùng gấp khác làm nhiệm vụ trung gian cho các chức năng của kháng thể (gắn với bổ thể, gắn với thụ thể của các tế bào thực bào). (3) 1.4. Kháng thể đơn dòng (2) Trong tự nhiên, kháng nguyên có nhiều nhóm quyết định (kháng nguyên đa giá), do đó sẽ kích thích cơ thể tạo thành không phải một mà là một phức hợp kháng thể. Muốn nhận một loại kháng thể trong phức hợp ấy thì phải tiến hành tách tinh khiết. Năm 1975 Milstein và Kohler đã tiến hành lai bằng con đường dung hợp tế bào ung thư tuỷ và tế bào lympho B. Tế bào ung thư có khả năng phân chia nhanh nhưng không tạo thành kháng thể, ngược lại tế bào B có khả năng hình thành kháng thể nhưng không có khả năng phân chia vì chúng là tế bào tận cùng của quá trình biệt hoá. Tế bào lai có được ưu điểm của cá hai tế bào trên: vừa phân chia rất nhanh vừa có khả năng tổng hợp kháng thể. Tiến hành pha loãng liên tục trong giếng của phiến nhựa vi lượng cho đến khi mỗi giếng chỉ có một tế bào. Từ một tế bào đơn chỉ sản xuất một dòng kháng thể thuần khiết. Do vậy kháng thể đơn dòng là kháng thể do một dòng tế bào B sinh ra để chống lại một quyết định kháng nguyên. Kỹ thuật kháng thể đơn dòng đã được áp dụng rộng rãi để thay thế dần một số phương pháp huyết thanh thông thường như xác định hocmon trong đánh giá chức năng nội tiết, xác định protein chấn đoán ung thư, xác định nồng độ thuốc trong máu với độ nhạy cao gấp nhiều lần so với các biện pháp thông thường. Có thể đưa thuốc đến tận mục tiêu cần tiêu diệt như là tên lửa đạo đạn. Thuốc sẽ được phóng thích liên tục để diệt các tế bào ung thư. Kỹ thuật đơn dòng cũng được dùng để xác địng doping trong thể thao. 2. Kháng nguyên 2.1. Định nghĩa (3) Kháng nguyên (antigen) là tất cả các chất, đôi khi kể cả thành phần cấu tạo của cơ thể, khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức một quá trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp những phân tử đặc biệt gọi là kháng thể (dịch thể hay kháng thể tế bào) và chúng có đặc tính liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đó. Tóm lại, kháng nguyên là chất gây ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và phản ứng với các sản phẩm của đáp ứng đó. Bằng chứng độc nhất nói lên một chất đúng là một kháng nguyên khi chứng minh được có đáp ứng miễn dịch chống lại nó. 9
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION 2.2. Các đặc tính của kháng nguyên (1) 2.2.1.Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên Tính sinh miễn dịch của một kháng nguyên phụ thuộc vào các yếu tố sau : 2.2.1.1. Tính “lạ” của kháng nguyên Một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch càng cao khi sự khác biệt giữa cơ thể nhận va kháng nguyên càng nhiều hay nói cách khác kháng nguyên càng “lạ” với cơ thê nhận bao nhiêu thi khả năng kích thích tạo kháng thể càng mạnh bấy nhiêu. Ví dụ: Albumin của gà hay chim có tính sinh miễn dịch cao hơn albumin bò khi cùng đưa vào cơ thể loài dê. Tuy nhiên cần lưu ý rằng các kháng nguyên protein của cơ thê này cũng có thể kích thích một cơ thê khác cùng loài sản xuất kháng thể nếu kháng nguyên protein đủ lạ đối với protein của cơ thể nhận. Hơn nữa trong một số trường hợp bệnh lý thì thành phần của chính cơ thê cũng có thể gây ra đáp ứng tạo kháng thể chống lại nó, ngươi ta gọi những thành phần này là “tự kháng nguyên”. 2.2.1.2. Cấu tạo hóa học của kháng nguyên Các kháng nguyên thuộc loại protein và polysaccarid có tính sinh miễn dịch cao khi dùng dưới dạng hòa tan và cả khi chúng nằm trong một cấu trúc phức hợp, ví dụ vỏ vi khuẩn. Các kháng nguyên là lipid, steroid và axit nucleic có tính sinh miễn dịch yếu hoặc không có tính sinh miễn dịch. Kháng nguyên càng phức tạp về cả cấu tạo lẫn kích thước thì chúng càng có thể kích thích một đáp ứng miễn dịch mạnh. Ví dụ: các kháng nguyên hữu hình (vi khuẩn, virus ,các tế bào). Các phân tử protein lớn (hemoxyamin) cũng có tính kháng nguyên mạnh. Trên cấu trúc của kháng nguyên có những vị trí chịu trách nhiệm chính trong việc kích thích tạo kháng thể và kết hợp với kháng thể khi xảy ra phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể. Những vị trí này được gọi là những quyết định kháng nguyên (determinant antigen) hay epitop. Kháng nguyên càng phức tạp càng có nhiều epitop, do đó tính sinh miễn dịch càng cao. Ngòai thành phần hóa học ra, cấu trúc lập thể và khả năng tích điện của các phân tử kháng nguyên cũng có ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch. Có lẽ sự tích điện có vai trò trong việc chọn lọc các tế bào lympho có thụ thể đặc hiệu tương ứng. Còn cấu trúc lập thể có ảnh hưởng đến mức độ chuyên hóa của kháng nguyên trong cơ thể nhân (khi bị chuyên hóa các kháng nguyên sẽ để lộ thêm các quyết định kháng nguyên). 2.2.1.3. Cách gây miễn dịch và liều kháng nguyên Hầu hết các kháng nguyên hữu hình (vi khuẩn, hồng cầu, viris hoặc các polymer lớn) khi đưa vao cơ thể nhận bằng đường tĩnh mạch hoặc tiêm bắp với liều khác nhau 10
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION đều có thể dễ dàng kích thích tạo kháng thể. Trong khi đó, nhiều kháng nguyên là protein hòa tan phải có một quy trinh gây miễn dịch thích hợp hoặc phải cần một chất hỗ trợ mới gây được đáp ứng tốt. Chất hỗ trợ đó được gọi là tá chất, loại thường được dùng là tá chất Freund gồm hỗn dịch vi khuẩn lao chết trộn trong nước và dầu. Một số nghiên cứu cho thấy tá chất có tác dụng làm tăng chức năng của đại thực bào và tế bào lympho T hỗ trợ. 2.2.1.4. Khả năng đáp ứng của cơ thê Đây là một yếu tố quan trọng : cùng một kháng nguyên nhưng các cơ thể khác nhau có những đáp ứng ở nhiều mức độ khác nhau. Vì thế Landsteiner đã phân biệt hai khái niệm: tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch, trong đó: Tính sinh miễn dịch = Tính kháng nguyên + Khả năng đáp ứng của cơ thể nhận 2.3. Tính đặc hiệu của kháng nguyên Tính đặc hiệu của một đáp ứng miễn dịch là do: - Mỗi kháng nguyên có một cấu trúc đặc hiệu riêng. - Khả năng nhận biết một cách đặc hiệu của các tế bào lympho do có thụ thể cho từng loại kháng nguyên. Tính đặc hiệu của kháng nguyên không phải do toàn bộ cấu trúc của cả phân tử kháng nguyên quyết định mà do những quyết định kháng nguyên (epitop ) quyết định. Epitop có hai chức năng: - Kích thích cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên đó. - Làm vị trí để kháng thể hoặc tế bào lympho T mẫn cảm có thể gắn vào một cách đặc hiệu. Một kháng nguyên protein phức tạp có thể có nhiều quyết định kháng nguyên khác nhau do đó mà nó có thể kích thích tạo ra nhiều loại kháng thể khác nhau cùng một lúc. Tùy theo kháng nguyên có thể phản ứng cùng lúc với một hoặc nhiều kháng huyết thanh chứa kháng thể do nó tạo ra mà người ta gọi là kháng nguyên đơn giá hay kháng nguyên đa gía . (Trong các phản ứng huyết thanh học chỉ có các kháng nguyên đa giá mới có khả năng tạo ra mạng lưới kết tủa hoặc ngưng kết với các kháng thể tương ứng ). Phản ứng chéo (Cross - reaction): Tính đặc hiệu của kháng nguyên rất cao tuy vậy trong thực tế hai kháng nguyên khác nhau có thể có phản ứng chéo với nhau. Nguyên nhân của phản ứng chéo là do trên hai kháng nguyên này có hai epitop giống nhau hoặc ít nhất là tương tự nhau. Phản ứng chéo dễ xảy ra với các kháng nguyên polysaccharid và cũng xảy ra với các kháng nguyên protein (vi dụ: albumin trứng gà và albumin trứng vịt ). Trong thừc nghiệm chúng ta có thể loại trừ phản ứng chéo bằng phương pháp hấp thụ. Ví dụ: ta biết kháng huyết thanh kháng A thường cho phản ứng chéo với kháng nguyên B nên khi làm phản ứng tìm kháng nguyên A thì kết quả dễ sai lạc do tìm 11
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION nhầm cả B. Như vậy trước khi tìm A ta cho ủ kháng huyết thanh kháng A với kháng nguyên B, những phân tử nào cho phản ứng chéo sẽ tạo phức hợp vơi B. Sau đó loại bỏ phức hợp này bằng ly tâm ta sẽ có kháng huyết thanh kháng A tinh khiết không còn phản ứng chéo vơi B. II. Tinh sạch ái lực miễn dịch 1. Mục đích (4) Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu. Trên thực tế có nhiều phương pháp khác nhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí ái lực (Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch ( Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo ( Cross-linking). Phương pháp kết tủa miễn dịch dựa vào phản ứng kháng nguyên với kháng thể. ở đây người ta dùng chất mang (Sepharose) gắn với protein A tương tác với kháng thể để kết tủa phức hệ kháng nguyên kháng thể đồng thời kéo theo các protein khác tương tác với protein nghiên cứu (kháng nguyên). Các protein kết tủa cùng sẽ được tách ra để nghiên cứu (Harlow,E.,P.Whyte and S.J.Elledge.1993:Cell,75:805-816). Mục đích của phương pháp tinh sạch ái lực miễn dịch: - Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh - Kiểm tra sự có mặt của KN 2. Tính chất yêu cầu của kháng thể Kháng thể phải tinh khiết. 3. Các bước tiến hành (3) 3.1. Gắn kháng thể lên giá (5) 3.1.1. Sử dụng phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (affinity Chromatography). Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand) vào chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương tác đặc hiệu với nó. Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh. Trong trường hợp hai chất kháng nguyên và kháng thể có ái lực liên kết đặc hiệu với nhau, người ta thay thế vị trí chất gắn vào giá thể giữa kháng nguyên và kháng thể để nghiên cứu từng loại giống như cơ chất, chất ức chế và enzyme đặc hiệu của chúng. Hay nói cách khác dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một enzyme hoặc protein ta nghiên cứu. Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục vụ cho lọc gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel Sepharose. * Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex. Đó là các loại DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu điểm của loại này là 12
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme. Trường hợp CM - sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO- Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có protein enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột. Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch. 3.1.2. Gắn kháng thể hoặc kháng nguyên lên giá bằng phương pháp Elisa (7) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: (1) Kháng nguyên - antigen chưa biết được gắn trên một bề mặt. (2) Kháng thể - antibody biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. (3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng thể - kháng nguyên. Sự hiện diện của phức hợp kháng thể - kháng nguyên sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa 13
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể - kháng nguyên có thể xảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng nguyên thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với KN sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng thể - kháng nguyên. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. 3.1.3. Một số cách thực hiện gắn kháng thể hoặc kháng nguyên lên giá (7) 3.1.3.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính: - Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. - Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn. - Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. - Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. - Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme). - Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. 14
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION - Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này. 3.1.3.2. Sandwich ELISA: Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp): (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể (2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các kháng thể đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán (6) Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp ở bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. (8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể. 3.1.3.3. ELISA cạnh tranh (1) "Ủ" kháng thể không được đánh dấu với kháng nguyên. (2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên. (3) Rửa đĩa, kháng thể không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng kháng nguyên càng lớn, lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh". (4) Thêm kháng thể thứ cấp kháng thể của kháng thể ở bước 1). Kháng thể thứ cấp gắn với enzym. (5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu. Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu. Một số trường hợp, enzym được gắn với kháng nguyên chứ không phải kháng thể. 15
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION 3.2. Phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể (3) 3.2.1. Cơ chế kết hợp kháng nguyên - kháng thể Sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các lực liên kết lý hóa sau: * Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Wander-Wals. * Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ giữa nhóm amin và nhóm carboxyl. * Lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau * Lực kỵ nước Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không phải là một phản ứng hóa học hoàn toàn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần kháng nguyên và kháng thể. 3.2.2. Phản ứng ngưng kết - Agglutination test 3.2.2.1. Nguyên lý Đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (ví dụ như xác vi khuẩn). Khi găp kháng thể đặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp. Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Khi cho kháng nguyên hữu hình trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Các phản ứng ngưng kết thường đơn giản, dễ làm, có độ nhạy cao, không tốn kém, được sử dụng rộng rãi, nhưng có nhược điểm là khó đạt trình độ chính xác cao, thường hay cho phản ứng dương tính giả. 16
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION Hình 4: Phản ứng ngưng kết A - Không xẩy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một xác vi khuẩn B - Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các xác vi khuẩn C - Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM 17
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION 3.2.2.2. Các loại phản ứng ngưng kết 3.2.2.2.1. Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính Là phản ứng có tính chất định tính, thường sử dụng kháng nguyên đã biết và nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết thanh. Dùng một phiến kính, nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau đó nhỏ vào một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, sau đó vài phút đọc kết quả, nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng, thì kết hợp kháng nguyên kháng thể tạo thành đám ngưng kết, nếu kháng nguyên được nhuộm màu, thì đám ngưng kết có màu cụm lại, xung quanh nhạt màu hơn. 3.2.2.2.2. Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm Là phản ứng vừa có tính định tính vừa có thể định lượng được hàm lượng kháng thể. Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống cho vào một lượng không đổi huyết thanh có độ pha loãng khác nhau theo cơ số 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16..) hoặc theo cơ số 10 (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000..) sau đó cho vào mỗi ống nghiệm một lượng tương đương kháng nguyên, để ở nhiệt độ thích hợp theo yêu cầu của phản ứng, sau 30 phút hoặc vài giờ đọc kết quả và tính được hiệu giá ngưng kết. Hiệu giá ngưng kết là độ pha loãng cao nhất mà ở đó vẫn xảy ra hiện tượng ngưng kết. 3.2.2.2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động Khi dùng một kháng nguyên hòa tan để phát hiện một kháng thể tương ứng trong phản ứng ngưng kết, phải cần đến tế bào mang, người ta thường dùng hồng cầu, hạt chất dẻo như hạt latex, bentonit. Nguyên lý: Làm cho kháng nguyên hòa tan trở thành kháng nguyên hữu hình, bằng cách gắn kháng nguyên vào hồng cầu, như vậy hồng cầu đóng vai trò là giá đỡ cho kháng nguyên, khi kháng nguyên đã gắn trên hồng cầu thì kháng nguyên đó trở thành kháng nguyên hữu hình và phản ứng ngưng kết xảy ra dễ dàng. Có nhiều phương pháp để gắn kháng nguyên hòa tan trên bề mặt hồng cầu. Có thể xử lý bằng các hóa chất như a xít tanic, benzidin, các muối crom, glutaraldehyd.. các hóa chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu và nhóm chức còn lại gắn với kháng nguyên. 18
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION Khi có phản ứng xảy ra, nghĩa là khi có kháng thể tương ứng với kháng nguyên, thì các kháng thể sẽ nối các kháng nguyên lại và các kháng nguyên đã gắn với hồng cầu hoặc đã hấp phụ vào các hạt chất dẻo, tạo nên sự ngưng kết nhìn thấy rõ ràng. Hình 5: Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động 3.2.3. Phản ứng kết tủa (Precipitation test) Nguyên lý: Giống phản ứng ngưng kết, chỉ khác là kháng nguyên trong phản ứng này là kháng nguyên hòa tan được trộn với kháng thể dịch thể tương ứng, cũng là chất hòa tan trong huyết thanh. Nếu thiếu hoặc thừa một trong 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra, sự kết tủa biểu hiện bằng chất cặn màu sáng trắng dễ quan sát được. Phản ứng kết tủa cũng cần có một số điều kiện như: nhiệt độ, pH, các ion môi trường điện giải.. 3.2.3.1. Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng 3.2.3.1.1. Phản ứng kết tủa vòng Là phản ứng có tính chất định tính. Dùng ống nghiệm loại nhỏ, cho kháng nguyên hòa tan vào trước, sau đó dùng pipet đã hút huyết thanh có kháng thể tương ứng, để đầu mút pipet vào sát đáy ống nghiệm rồi nhỏ từ từ cho kháng thể vào, với một lượng tương đương, kháng thể sẽ đội kháng nguyên lên (vì là kháng nguyên hòa tan nên nhẹ hơn kháng thể). Để yên trong vòng 15-20 phút sẽ thấy xuất hiện vòng kết tủa màu trắng ở chỗ tiếp xúc giữa lớp kháng nguyên và kháng thể, nếu kháng nguyên và kháng thể tương ứng (hình 6a). 19
IMMUNOAFFINITY PURIFICATION Người ta thường dùng kháng thể dịch thể chuẩn đã biết để chẩn đoán kháng nguyên chưa biết với điều kiện kháng nguyên đó phải được chiết xuất thành dung dịch hòa tan. Phản ứng kết tủa vòng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh nhiệt thán, gọi là phản ứng kết tủa của Ascoli (hình 6b). Hình 6a. Phản ứng kết tủa vòng Hình 6b. Phương pháp làm phản ứng Ascoli 20