Tối ưu hóa sự chuyển nạp gen ở lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265<br /> <br /> TỐI ƯU HÓA SỰ CHUYỂN NẠP GEN Ở LAN Dendrobium Sonia<br /> QUA TRUNG GIAN VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens<br /> Nguyễn Xuân Dũng1*, Dương Hoa Xô1, Chu Hoàng Hà2<br /> 1<br /> <br /> Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, *nguyenxuandung294@gmail.com<br /> 2<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam<br /> <br /> TÓM TẮT: Trong nghiên cứu này, sự chuyển nạp gen được thiết lập trên protocorm like bodies (PLBs) ở<br /> hoa lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa vector pCambia<br /> 1301 có mang gen GUS và gen kháng kanamycin. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự chuyển nạp gen bao<br /> gồm môi trường tái sinh và tăng trưởng PLBs, nồng độ acetosyringone (AS); thời gian đồng nuôi cấy;<br /> chủng Agrobacterium; nồng độ kháng sinh diệt khuẩn (cefotaxime) và sàng lọc mô chuyển gen<br /> (hygromycin) đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với 0,5<br /> mg/l hay 0,3 mg/l BA thích hợp cho sự tái sinh PLBs từ lát cắt mô thân. Hiệu quả chuyển gen (tỷ lệ PLBs<br /> biểu hiện gen GUS) cao nhất đạt được khi PLBs được lây nhiễm và đồng nuôi cấy với Agrobacterium trên<br /> môi trường chứa 100 µM AS trong 3 ngày (với chủng EHA105 và C58) hay 4 ngày (với chủng<br /> LBA4404). Cefotaxime 300 mg/l và hygromycin 7-15 mg/l thích hợp cho sự diệt khuẩn và sàng lọc PLBs<br /> chuyển gen.<br /> Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dendrobium Sonia, chuyển nạp gen, tái sinh PLBs.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Lan Dendrobium Sonia, một dòng lai giữa<br /> lan Dendrobium Caesar và Dendrobium Tomie<br /> Drake [14], được trồng phổ biến ở Việt Nam<br /> cho mục đích sản xuất hoa cắt cành. Cho đến<br /> nay, nhu cầu của thị trường đối với hoa lan<br /> Dendrobium Sonia vẫn không ngừng gia tăng,<br /> vì vậy, việc nghiên cứu chuyển gen nhằm cải<br /> thiện chất lượng loài lan này là một vấn đề có ý<br /> nghĩa quan trọng. Có hai phương pháp chuyển<br /> gen thường được sử dụng trên hoa lan đó là sử<br /> dụng súng bắn gen và vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens. Trong đó, phương pháp chuyển<br /> gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium<br /> hiện đang được quan tâm do tính hiệu quả của<br /> nó. Đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen qua<br /> trung gian vi khuẩn Agrobacterium trên lan<br /> Dendrobium [1, 2, 3, 8, 15], và một số loài lan<br /> khác như Hồ điệp [6, 9, 12], Vanda [12],<br /> Cattleya [16], Oncidium [7, 11], Cymbidium [4]<br /> MSC<br /> <br /> được công bố trên thế giới. Tuy nhiên, các<br /> nghiên cứu chuyển gen sử dụng vi khuẩn<br /> Agrobacterium trên lan Dendrobium Sonia hầu<br /> như chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam.<br /> Việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển<br /> gen vào loài lan này là thật sự cần thiết, tạo tiền<br /> đề cho các nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứu<br /> này tiến hành tối ưu hóa một số nhân tố chính<br /> ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen qua trung<br /> gian vi khuẩn Agrobacterium trên lan<br /> Dendrobium Sonia như môi trường tái sinh và<br /> tăng trưởng PLBs, nồng độ AS, thời gian đồng<br /> nuôi cấy, chủng vi khuẩn, nồng độ kháng sinh<br /> diệt khuẩn và sàng lọc mô chuyển gen.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Đoạn thân (giả hành) của cây lan<br /> Dendrobium Sonia trồng tại vườn ươm của<br /> Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố<br /> Hồ Chí Minh được sử dụng làm vật liệu.<br /> GUS first exon Catalase intron<br /> <br /> LB<br /> <br /> RB<br /> HYR(R)<br /> <br /> CAM35S<br /> <br /> LAC Z<br /> <br /> 35S pro<br /> <br /> GUS<br /> <br /> NOS<br /> <br /> Hình 1. Cấu trúc vùng T-DNA trên vector pCambia 1301<br /> 257<br /> <br /> Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa Xo, Chu Hoang Ha<br /> <br /> Sử dụng các chủng vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens LBA4404, EHA105, C58 mang<br /> vector pCambia 1301 với vùng T-DNA chứa<br /> gen GUS và gen kháng hygromycin (hình 1).<br /> Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tái sinh<br /> tạo PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân lan<br /> Dendrobium Sonia nuôi cấy in vitro<br /> Đoạn thân ở vị trí giữa hai chồi ngủ của cây<br /> lan Dendrobium Sonia in vitro (cao 3-5 cm)<br /> được tách và cắt thành những lát mỏng (0,5<br /> mm) theo hướng vuông góc với chiều dài đoạn<br /> thân. Các lát cắt mỏng sau đó được đặt nuôi cấy<br /> trên môi trường MS [10] có bổ sung chất điều<br /> hòa sinh trưởng BA ở các nồng độ từ 0,1-0,3<br /> mg/l kết hợp lần lượt với NAA ở các nồng độ từ<br /> 0,5-5 mg/l. Mẫu cấy được đặt ở điều kiện ánh<br /> sáng 2.500±500 lux, nhiệt độ 25±2oC, ẩm độ<br /> 50±5%. Theo dõi sự phát sinh PLBs sau 4 tuần<br /> nuôi cấy. Thí nghiệm được lập lại 3 lần với số<br /> lượng 3 bình/công thức/lần lập lại.<br /> Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tăng sinh<br /> và phát triển PLBs<br /> Các PLBs (đường kính khoảng 1,0 mm) của<br /> lan Dendrobium Sonia được nuôi cấy trên môi<br /> trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 0,1;<br /> 0,3 và 0,5 mg/l kết hợp lần lượt với NAA ở<br /> nồng độ 1,0 mg/l. Mẫu cấy được nuôi cấy ở<br /> điều kiện ánh sáng 2.500±500 lux, nhiệt độ<br /> 25±2oC, ẩm độ 50±5%. Theo dõi sự tăng trưởng<br /> của PLBs sau 10 tuần nuôi cấy.<br /> Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng<br /> AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn<br /> lên khả năng chuyển gen vào PLBs<br /> Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen<br /> Vi khuẩn được tăng sinh qua đêm trong môi<br /> trường LB (3 ml) có bổ sung 50 mg/l<br /> kanamycin và 50 mg/l rifamicin, ở 28oC, tốc độ<br /> lắc 250 vòng/phút. Mẫu vi khuẩn sau khi tăng<br /> sinh, sẽ được kiểm tra OD để đảm bảo giá trị<br /> OD nằm trong khoảng từ 0,6-1, sau đó tiến hành<br /> li tâm thu sinh khối vi khuẩn ở 8.000 vòng/phút<br /> trong 10 phút. Sinh khối vi khuẩn thu được sau<br /> khi li tâm được pha loảng với môi trường MS<br /> lỏng (cùng thể tích tăng sinh) có bổ sung chất<br /> cảm ứng AS (Acetosyringone) ở các nồng độ 0,<br /> 50, 100, 200 và 300 M.<br /> Chuẩn bị PLBs và thực hiện đồng nuôi cấy<br /> 258<br /> <br /> Tiến hành tách riêng từng PLBs từ các cụm<br /> PLBs có nguồn gốc từ lát thân cắt mỏng của cây<br /> lan Dendrobium Sonia in vitro. Việc tách các<br /> PLBs được thực hiện trong môi trường MS<br /> lỏng. PLBs sau khi tách được ngâm trong môi<br /> trường MS có bổ sung chất cảm ứng AS ở các<br /> nồng độ 0, 50, 100, 200 và 300 M trong 15<br /> phút ở 25oC. Sau đó, PLBs được chuyển sang ủ<br /> tiếp tục trong môi trường MS có bổ sung AS ở<br /> các nồng độ tương tự nhưng có bổ sung thêm vi<br /> khuẩn (đã thực hiện trong phần chuẩn bị vi<br /> khuẩn) trong 30 phút ở cùng nhiệt độ. Sau khi ủ,<br /> PLBs được làm khô nhẹ bằng cách đặt trên giấy<br /> thấm và chuyển sang đồng nuôi cấy trên môi<br /> trường MS rắn có bổ sung AS ở các nồng độ<br /> tương tự như môi trường ủ trong 1, 2, 3, 4 và 5<br /> ngày. Các đĩa petri đồng nuôi cấy được đặt nuôi<br /> trong tối ở nhiệt độ 252oC, ẩm độ 505%. Thí<br /> nghiệm được tiến hành đồng thời với 3 chủng vi<br /> khuẩn Agrobacterium khác nhau: C58, EHA105<br /> và LBA4404.<br /> Đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua<br /> nhuộm GUS<br /> Sau khi đồng nuôi cấy, PLBs được nhuộm<br /> GUS với quy trình được cải tiến theo Jeffeson et<br /> al. (1987) [5]. Theo đó, PLBs được chuyển vào<br /> các eppendorf có chứa thuốc nhuộm GUS, ủ ở<br /> nhiệt độ 37oC trong 72 giờ. Sau đó, loại bỏ<br /> thuốc nhuộm, ngâm mẫu với ethanol 70% cho<br /> đến khi diệp lục mất hoàn toàn (ít nhất sau 4<br /> giờ). Cuối cùng, đánh giá sự biểu hiện màu của<br /> PLBs và chụp ảnh dưới kính hiển vi soi nổi.<br /> Khảo sát nồng độ kháng sinh cefotaxime thích<br /> hợp để loại vi khuẩn từ PLBs sau khi đồng nuôi<br /> cấy với vi khuẩn<br /> Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn (chủng<br /> LBA4404) 3 ngày, PLBs được rửa 3 lần với<br /> nước cất vô trùng và rửa tiếp 1 lần với môi<br /> trường MS lỏng có bổ sung kháng sinh<br /> cefotaxime nồng độ 0, 300, 500 và 700 mg/l.<br /> Sau khi rửa, làm khô nhẹ bề mặt PLBs bằng<br /> giấy thấm và đặt nuôi cấy trên môi trường MS<br /> rắn có bổ sung cefotaxime ở các nồng độ tương<br /> tự như môi trường lỏng. Các đĩa petri đồng nuôi<br /> cấy được đặt nuôi ở trong điều kiện ánh sáng<br /> 2.500500 lux, nhiệt độ 252oC, độ ẩm 505%.<br /> Ghi nhận tình trạng nhiễm khuẩn của mẫu cấy<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265<br /> <br /> dựa vào sự hiện diện và kích thước của vòng<br /> khuẩn bao quanh PLBs.<br /> Khảo sát nồng độ kháng sinh hygromycin thích<br /> hợp cho việc sàng lọc PLBs sau chuyển gen<br /> Các PLBs đơn được nuôi cấy trên môi<br /> trường MS rắn có bổ sung kháng sinh<br /> hygromycin ở các nồng độ 0, 5, 7, 10 và 15<br /> mg/l. Mẫu cấy được đặt nuôi trong điều kiện<br /> ánh sáng 2.500500 lux, nhiệt độ 252oC, ẩm<br /> độ 505%.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Sự tái sinh PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân<br /> lan Dendrobium Sonia in vitro<br /> Sau 6 tuần nuôi cấy, trên tất cả 15 môi<br /> trường đều có sự hình thành cấu trúc mới từ cát<br /> lát cắt mỏng đoạn thân ban đầu. Tuy nhiên, có<br /> <br /> sự khác biệt đáng kể về khả năng tạo PLBs trên<br /> các loại môi trường. Trong 5 môi trường có sự<br /> hiện diện của BA 0,1 mg/l kết hợp lần lượt với<br /> NAA 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l, lát cắt tạo<br /> PLBs nhưng PLBs lại có xu hướng tăng trưởng<br /> thành chồi (NAA 0,5; 1,0; 2,0 và 3,0 mg/l)<br /> (hình 2-a, b, c, d) hay chỉ gia tăng về kích thước<br /> (phồng lên) so với ban đầu (NAA 5 mg/l) (hình<br /> 2-e). Tương tự, ở các môi trường có sự hiện<br /> diện của BA 0,3 mg/l kết hợp lần lượt với NAA<br /> 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l, lát cắt chỉ tạo mô<br /> sẹo (hình 2-f, g, i, j) hay cụm chồi (hình 2-h). Ở<br /> các môi trường có sự hiện diện của BA 0,5 mg/l<br /> kết hợp lần lượt với NAA 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và<br /> 5,0 mg/l, lát cắt tạo PLBs và tiếp tục nhân lên<br /> về số lượng ở trường hợp NAA 0,5 và 1,0 mg/l<br /> (hình 2-k, m) trong khi ở 3 trường hợp còn lại<br /> (NAA 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l), lát cắt cũng chỉ tạo<br /> mô sẹo hay chồi (hình 2-m, n, o).<br /> <br /> a<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> d<br /> <br /> e<br /> <br /> f<br /> <br /> g<br /> <br /> h<br /> <br /> i<br /> <br /> j<br /> <br /> k<br /> <br /> l<br /> <br /> m<br /> <br /> n<br /> <br /> o<br /> <br /> Hình 2. Sự hình thành PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ<br /> sung chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA ở các nồng độ khác nhau<br /> a, b, c, d, e: MS bổ sung 0,1 mg/l BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l NAA;<br /> f, g, h, i, j: MS bổ sung 0,3 mg/l BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l NAA;<br /> k, l, m, n, o: MS bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l NAA.<br /> <br /> Như vậy, trong 15 loại môi trường được thử<br /> nghiệm, môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l<br /> kết hợp với NAA 0,5 hay 1,0 mg/l thích hợp<br /> nhất cho việc tạo PLBs từ lát cắt mỏng đoạn<br /> thân lan Dendrobium Sonia. Các môi trường có<br /> tỷ lệ auxin/cytokinin quá cao (từ 4 đến 50 lần)<br /> <br /> đều không thích hợp cho sự tạo PLBs. Tỷ lệ<br /> auxin/cytokinin từ 1 đến 2 lần có lẽ phù hợp<br /> nhất cho mục đích tạo PLBs trong nghiên cứu<br /> này. Sự tái sinh thành công PLBs từ mô thân là<br /> một hướng tiếp cận khá mới, giúp đa dạng hóa<br /> nguồn vật liệu phục vụ cho việc thu nhận PLBs.<br /> 259<br /> <br /> Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa Xo, Chu Hoang Ha<br /> <br /> Sự tăng sinh và phát triển PLBs Dendrobium<br /> Sonia in vitro<br /> Sau 10 tuần nuôi cấy, ở tất cả các môi<br /> trường đều có sự tăng sinh PLBs từ một PLBs<br /> ban đầu thành khối với nhiều PLBs. Các môi<br /> trường có bổ sung BA và NAA giúp PLBs tăng<br /> sinh mạnh hơn so với đối chứng (MS cơ bản).<br /> Trong đó, môi trường có bổ sung 0,3 mg/l BA<br /> và 1,0 mg/l NAA cho kết quả tốt nhất. Với cùng<br /> lượng PLBs được cấy vào (5 PLBs), số lượng<br /> <br /> và khối lượng PLBs thu được trên môi trường<br /> này cao hơn so với các môi trường còn lại (hình<br /> 3, bảng 1). Sự hiện diện của auxin đơn lẻ hay<br /> kết hợp với cytokinin trong môi trường nuôi cấy<br /> là một trong những nhân tố quan trọng nhất đối<br /> với sự tăng sinh PLBs. Điều này đã được ghi<br /> nhận trong nghiên cứu của Atichart et al. (2007)<br /> [1] khi NAA 0,5 mg/l được bổ sung vào môi<br /> trường nuôi cấy đã tạo ra sự tăng sinh PLBs cao<br /> nhất.<br /> <br /> a<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> d<br /> <br /> Hình 3. Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa<br /> sinh trưởng BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 10 tuần nuôi cấy<br /> a: MS; b: MS+0,1 mg/l BA+1,0 mg/l NAA; c: MS+0,3 mg/l BA+1,0 mg/l NAA;<br /> d: MS+0,5 mg/l BA+1,0 mg/l NAA<br /> <br /> Bảng 1. Sự thay đổi trọng lượng PLBs lan Dendrobium Sonia trên các môi trường.<br /> Công thức<br /> Trọng lượng PLBs (g)<br /> MS<br /> 1,50±0,15a<br /> MS + 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA<br /> 2,34±0,10ab<br /> MS + 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA<br /> 8,47±0,29c<br /> MS + 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA<br /> 3,15±0,01b<br /> *Các giá trị trong cột với chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 0,05.<br /> <br /> Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng AS,<br /> thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn<br /> lên khả năng chuyển gen vào PLBs<br /> Nhìn chung, cả ba chủng vi khuẩn<br /> Agrobacterium được sử dụng trong nghiên cứu<br /> này là C58, EHA 105 và LBA 4404 đều có thể<br /> 260<br /> <br /> thực hiện việc chuyển gen vào PLBs của lan<br /> Dendrobium Sonia. Tuy nhiên, có sự khác biệt<br /> đáng kể về nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian<br /> đồng nuôi cấy cũng như hiệu quả chuyển gen<br /> đối với từng trường hợp.<br /> Trường hợp chủng C58<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265<br /> <br /> Ở các thời điểm 1 và 2 ngày đồng nuôi cấy,<br /> hầu như không có sự khác biệt về tỷ lệ mẫu<br /> dương tính GUS giữa các nồng độ AS, sự khác<br /> biệt chỉ xuất hiện sau 3, 4 và 5 ngày. Trong đó,<br /> tỷ lệ mẫu dương tính GUS cao nhất (71,67±<br /> 2,36) đạt được ở thời điểm 3 ngày với cả hai<br /> trường hợp có (100 µM) và không có AS. Thời<br /> gian đồng nuôi cấy ngắn (1-2 ngày) cho hiệu<br /> quả chuyển gen không ổn định với độ biến động<br /> lớn giữa các lần lặp lại (thể hiện ở kết quả có sai<br /> <br /> số lớn), trong khi đó việc kéo dài thời gian đồng<br /> nuôi cấy (4-5 ngày) lại làm giảm hiệu quả<br /> chuyển gen (bảng 2). Có lẽ để thực hiện việc<br /> chuyển gen vào mô thực vật vi khuẩn cần có<br /> một khoảng thời gian chuẩn bị ban đầu trước<br /> khi phát huy tối đa hiệu quả của chúng; và sự<br /> biểu hiện gen trong mô thực vật bị ảnh hưởng<br /> đáng kể do việc nuôi cấy kéo dài dưới áp lực<br /> xâm nhiễm của vi khuẩn.<br /> <br /> Bảng 2. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy<br /> với chủng vi khuẩn Agrobacterium C58<br /> Nồng độ Số mẫu xử lý<br /> Tỷ lệ mẫu dương tính GUS (%)<br /> AS (µM) chuyển gen<br /> 1 ngày<br /> 2 ngày<br /> 3 ngày<br /> 4 ngày<br /> 5 ngày<br /> 46,67±24,94a 76,67±18,86a 78,33±2,36b<br /> 55,42±3,58b<br /> 57,22±2,08b<br /> 0<br /> 10<br /> 46,67±24,94a 60,00±8,16a<br /> 58,33±2,36a 41,67±6,24ab<br /> 41,67±6,24a<br /> 50<br /> 10<br /> a<br /> a<br /> b<br /> a<br /> 40,00±32,66 56,67±20,55<br /> 71,67±2,36<br /> 26,67±4,71<br /> 51,67±6,24ab<br /> 100<br /> 10<br /> a<br /> a<br /> a<br /> ab<br /> 53,33±24,94 61,67±10,80<br /> 60,00±0,00<br /> 43,89±4,37<br /> 45,00±7,07ab<br /> 200<br /> 10<br /> a<br /> a<br /> a<br /> ab<br /> 33,33±9,43<br /> 41,67±23,92<br /> 63,33±6,24<br /> 50,0±24,49<br /> 48,33±2,36ab<br /> 300<br /> 10<br /> Chú thích: như bảng 1.<br /> <br /> Trường hợp chủng Agrobacterium EHA105<br /> <br /> Trường hợp chủng LBA4404<br /> <br /> Tương tự với trường hợp chủng C58, không<br /> có sự khác biệt về hiệu quả chuyển gen giữa các<br /> nồng độ AS ở thời điểm 1 và 2 ngày đồng nuôi<br /> cấy. Ở thời điểm 4 và 5 ngày, có sự khác biệt<br /> giữa các nồng độ AS nhưng không rõ ràng, tỷ lệ<br /> mẫu dương tính GUS biến động ngẫu nhiên<br /> không tuân theo quy luật. Trái lại, ở thời điểm 3<br /> ngày, tỷ lệ mẫu dương tính GUS biến động theo<br /> quy luật cụ thể; theo đó việc bổ sung AS ở nồng<br /> độ thấp (50 µM) hay quá cao (200-300 µM) đều<br /> không tạo ra được sự khác biệt về hiệu quả<br /> chuyển gen. Tỷ lệ mẫu dương tính GUS có sự<br /> khác biệt và đạt giá trị cao nhất (75,00±4,08) ở<br /> nồng độ AS 100 µM (bảng 3).<br /> <br /> Trái lại, với hai trường hợp trên, ở 4 thời<br /> điểm đồng nuôi cấy từ 1 đến 4 ngày đều có sự<br /> khác biệt rõ ràng về hiệu quả chuyển gen giữa<br /> các nồng độ AS. Tỷ lệ mẫu dương tính GUS tăng<br /> dần theo nồng độ AS, đạt giá trị cao nhất ở nồng<br /> độ 100 µM (73,33±2,36) và sau đó giảm xuống ở<br /> nồng độ 200 µM). Ở thời điểm 5 ngày, tỷ lệ mẫu<br /> dương tính GUS mặc dù vẫn có sự khác biệt giữa<br /> các nồng độ AS nhưng lại biến thiên ngẫu nhiên<br /> không theo quy luật. Ở cùng nồng độ AS<br /> 100 µM, tỷ lệ này tăng dần theo thời gian đồng<br /> nuôi cấy, đạt giá trị cao nhất ở thời điểm 4 ngày<br /> và giảm xuống sau 5 ngày (bảng 4).<br /> <br /> Bảng 3. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy<br /> với chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA105<br /> Nồng độ Số mẫu xử lý<br /> Tỷ lệ mẫu dương tính GUS (%)<br /> AS (µM) chuyển gen<br /> 1 ngày<br /> 2 ngày<br /> 3 ngày<br /> 4 ngày<br /> 5 ngày<br /> 53,33±9,43a<br /> 60,00±0,00a<br /> 51,67±2,36a 51,67±8,50a 46,67±12,47b<br /> 0<br /> 10<br /> 36,67±12,47a 58,33±2,36a<br /> 50,00±8,16a 70,00±4,08b<br /> 31,67±2,36ab<br /> 50<br /> 10<br /> a<br /> a<br /> b<br /> ab<br /> 60,00±28,28<br /> 68,33±8,50<br /> 75,00±4,08<br /> 60,00±8,16<br /> 36,67±12,47ab<br /> 100<br /> 10<br /> a<br /> a<br /> a<br /> ab<br /> 53,33±41,10<br /> 56,67±2,36<br /> 46,67±4,71<br /> 54,17±8,25<br /> 53,33±9,43b<br /> 200<br /> 10<br /> a<br /> a<br /> a<br /> ab<br /> 26,67±9,43<br /> 68,33±8,50<br /> 44,44±4,16<br /> 54,44±4,16<br /> 20,00±0,00a<br /> 300<br /> 10<br /> Chú thích: như bảng 1, 2.<br /> <br /> 261<br /> <br />