Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của hai loài Giảo cổ lam Gynostemma sp. tại Việt Nam

Chia sẻ: Trần Văn Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là Mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học và xác định đặc điểm vi học hai loài Giảo cổ lam nghiên cứu. Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài Giảo cổ lam đã xác định tên khoa học. Đánh giá độc tính cấp và một số tác dụng sinh học (tác dụng hạ glucose máu, bảo vệ gan, chống oxy hóa của dịch chiết dược liệu và tác dụ

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của hai loài Giảo cổ lam Gynostemma sp. tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN THỊ KIỀU MY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HAI LOÀI GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA SP. TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2020
Công trình được hoàn thành tại: - Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội. - Viện Hóa học, Viện Hóa sinh biển, Viện công nghệ sinh học, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội. - Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Dược Hà Nội. Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Phạm Thanh Kỳ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Trường Đại học Dược Hà Nội vào hồi giờ ngày tháng năm . Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam. - Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội.
A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Giảo cổ lam (Jiaogulan) được biết đến như một loại thực phẩm từ đầu thế kỷ XV ở Trung Quốc, nhưng phải đến năm 1976, khi nghiên cứu về các chất thay thế đường cho bệnh nhân tiểu đường, các nhà khoa học Nhật Bản mới phát hiện ra các saponin trong Giảo cổ lam giống với các saponin trong Nhân sâm. Từ đó tới nay, những nghiên cứu về Giảo cổ lam đã có rất nhiều kết quả khẳng định giá trị của loài cây này. Xuất hiện ở nhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam, Giảo cổ lam hiện nay thực tế được khai thác từ một số loài thuộc chi Gynostemma Blume, với các tên gọi khác nhau: Cổ yếm, ngũ diệp sâm, thất diệp đởm, cây trường sinh …. Những saponin có cấu trúc dammaran phát hiện trong cây Giảo cổ lam (Gypenosid) là các hoạt chất được quan tâm nghiên cứu có các tác dụng nổi bật như hạ lipid, hạ đường huyết, điều tiết khả năng miễn dịch, chống ung thư, chống độc, chống oxy hóa... Tại Việt Nam, qua các khảo sát ban đầu chi Gynostemma Blume cũng đa dạng về loài, dưới loài. Thực tế trong nhân dân các địa phương vẫn dùng lẫn các loài trong chi này với cùng công dụng của loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino, ảnh hưởng tới chất lượng và độ an toàn trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ dược liệu Giảo cổ lam. Đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của hai loài Giảo cổ lam Gynostemma sp. tại Việt Nam” được thực hiện nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng có hiệu quả hơn các loài trong chi Gynostemma Blume ở Việt Nam. 2. Mục tiêu của luận án - Mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học và xác định đặc điểm vi học hai loài Giảo cổ lam nghiên cứu. - Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài Giảo cổ lam đã xác định tên khoa học. - Đánh giá độc tính cấp và một số tác dụng sinh học (tác dụng hạ glucose máu, bảo vệ gan, chống oxy hóa của dịch chiết dược liệu và tác dụng trên một số dòng tế bào ung thư của các chất phân lập được). 1
3. Những đóng góp mới của luận án 3.1. Về thực vật: Đã mô tả đặc điểm hình thái kết hợp phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các mẫu Giảo cổ lam, so sánh với Genbank, xác định 2 mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu trong luận án của nghiên cứu sinh có tên khoa học là: + Gynostemma guangxiense X.X.Chen & D.H.Qin. + Gynostemma burmanicum King ex Chakrav var. molle C.Y.Wu. Đã mô tả đặc điểm hiển vi (bao gồm vi phẫu thân, lá và các đặc điểm bột dược liệu) của hai loài nghiên cứu. 3.2. Về thành phần hóa học: Từ loài Gynostemma guangxiense X.X. Chen & D.H. Qin. (Giảo cổ lam Quảng Tây) lần đầu tiên công bố đã phân lập được 6 chất là quercetin, (22E)- stigmasta- 5,22- dien- 3yl- hexopyranoside và 4 saponin là: ginsenosid Rb3, quinquenosid L3 và 2 saponin mới đặt tên là Gynosid VN1, Gynosid VN2. Từ loài Gynostemma burmanicum King ex Chakrav. var. molle C.Y.Wu (Giảo cổ lam Miến điện) đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 13 chất, trong đó có 3 saponin mới (đặt tên là Gypenosid B1, Gypenosid B2 và Ginsenosid B3), 6 saponin đã biết. Cũng từ loài này đã phân lập được một hợp chất mới trong tự nhiên là dẫn chất của tetrahydroxyfuran (đặt tên là Burmanon), cùng với uracil, acid coumaric, 2-(4-hydroxyphenyl)propane-1,3-diol. Như vậy tổng số có 13 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài Gynostemma burmanicum King ex Chakrav. var. molle C.Y.Wu, trong đó có 4 chất mới lần đầu tiên công bố trong tự nhiên. 3.3. Về độc tính và tác dụng sinh học - Lần đầu tiên công bố LD50 của G. guangxiense là 125,5g dược liệu/kg chuột, LD50 của G. burmanicum là 146,5g dược liệu/kg chuột. - Đã đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao phân đoạn nước chiết từ G.guangxiense (Gg) và G.burmanicum (Gb) . Kết quả mẫu thử Gg và Gb với liều tương đương 10gdl/kg, có tác dụng hạ glucose máu với mức hạ glucose máu lần lượt là 30.87 ± 3.72% (p
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa của cao phân đoạn nước chiết từ hai loài nghiên cứu thông qua chỉ số hoạt độ AST, ALT ở các lô uống thuốc thử thấp hơn rõ rệt so với lô mô hình, làm giảm có ý nghĩa thống kê nồng độ MDA so với lô mô hình (p
B. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1. TỔNG QUAN Tổng hợp và phân tích vị trí phân loại chi Gynostemma Blume, họ Bí (Cucurbitaceae). Tập hợp và trình bày một cách hệ thống các kết quả nghiên cứu tới nay về thực vật, thành phần hóa học, tác dụng sinh học và công dụng của một số loài trong chi Gynostemma Blume trên thế giới và ở Việt Nam. Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu Mẫu Giảo cổ lam Quảng Tây (Gynostemma guangxiense X.X.Chen & D.H.Qin.) thu hái tại tỉnh Yên Bái vào tháng 3-5 các năm 2013-2018. Mẫu Giảo cổ lam Miến Điện (Gynostemma burmanicum King ex Chakrav var. molle C.Y.Wu.) thu hái Bắc Cạn vào tháng 3,4 và tháng 7,8 năm 2013-2018. - Các hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam. Các dòng tế bào, thuốc thử sinh học và chuột thí nghiệm đạt tiêu chuẩn nghiên cứu. 2.2. Phương pháp giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu Giám định tên khoa học của 2 mẫu nghiên cứu dựa trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, thực vật, đối chiếu với khóa phân loại và tiêu bản mẫu chuẩn lưu ở các phòng tiêu bản, so sánh đặc điểm phân tích cấu trúc DNA với genBank. 2.3. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 2.3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ của G. guangxiense và G. burmanicum Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học đặc hiệu. 2.3.2. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hợp chất trong dược liệu Chiết xuất các chất trong dược liệu bằng phương pháp ngâm chiết với ethanol, thu hồi dung môi được cao thô. Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột nhiều lần. Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào phân tích dữ liệu phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng 4
từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) kết hợp đối chiếu với tài liệu đã công bố. 2.4. Đánh giá độc tính cấp và một số tác dụng sinh học 2.4.1. Độc tính cấp của G.guangxiense và G.burmanicum Đánh giá độc tính cấp theo hướng dẫn của Tổ chức y tế Thế giới và tính giá trị LD50 theo phương pháp của Litchfied – Wilcoxon (1949). 2.4.2. Tác dụng gây độc tế bào của các chất phân lập được Đánh giá tác dụng gây độc tế bào theo phương pháp MTT theo tác giả Mosmann (1983). 2.4.3. Tác dụng bảo vệ gan- chống oxy hóa Đánh giá tác dụng bảo vệ gan- chống oxy hóa bằng phương pháp định lượng enzym AST, ALT, xác định khối lượng gan tương đối, quan sát mô bệnh học, đồng thời xác định nồng độ MDA trong dịch đồng thể tế bào gan chuột nhắt trắng trên mô hình gây độc bằng PAR liều 400 mg/kg thể trọng. Mẫu thử là cao chiết phân đoạn nước của loài G. guanxiense (Gg) và của G. burmanicum (Gb) với 2 mức liều tương ứng 4g và 20 g dược liệu /kg chuột. 2.4.3. Tác dụng hạ glucose máu Đánh giá tác dụng hạ glucose máu bằng phương pháp định lượng glucose máu chuột nhắt trắng trên mô hình gây tăng glucose máu bằng tiêm màng bụng STZ (pha trong đệm citrat pH=4,5) một liều duy nhất 150mg/kg. Chỉ những chuột có glucose máu  8,5mmol/L (được coi là đã gây tăng glucose máu) được chọn để đưa vào nghiên cứu. Định lượng glucose máu ở các thời điểm ngay trước khi cho dùng thuốc và sau khi dùng thuốc 2 giờ bằng máy định lượng glucose máu tự động. Tỷ lệ % hạ glucose máu của chuột sau khi uống mẫu thử so với trước khi uống mẫu thử và so sánh tỷ lệ % hạ glucose máu trung bình của lô chuột uống mẫu thử với lô chứng là căn cứ để đánh giá tác dụng hạ glucose máu của mẫu thử. Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ R. Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Về thực vật: - Đã mô tả đặc điểm hình thái của 2 mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu. Mẫu nghiên cứu: G1 thu ở Yên Bái, G2 thu ở Hòa Bình, G7 thu ở Ninh Bình. 5
Quan sát thực địa và phân tích hình thái, cả 3 mẫu nghiên cứu đều có đặc điểm chung như sau: Dây leo. Thân mảnh, nhẵn trừ có lông thẳng, màu trắng, mọc thành đám nhỏ ở mỗi nốt, có sọc nổi và rãnh nông. Tua cuốn ở nách lá, dạng sợi, đầu tua cuốn chẻ hai. Lá mọc cách, có 3 - 5 lá chét. Cây đơn tính khác gốc. Hoa đực mọc thành chùm kép ở nách lá, dài 5 - 9 cm, chia khoảng 8 - 15 nhánh. Hoa cái ít hoa trên một chùm hoặc chùm kép ở nách lá. Quả mọng màu xanh, khoảng 5.5 x 3 mm, có 2 hoặc 3 thùy. Hạt 2 hoặc 3, gần hình cầu, đường kính khoảng 2.7 mm, có u nhọn trên bề mặt. Cây có hoa, quả từ tháng 7 đến tháng 3 năm sau. Cây mọc ở nơi ẩm trong rừng, trên núi đá vôi, độ cao từ 50 – 700m. Mẫu nghiên cứu: G3- thu hái tại Bắc Kạn Quan sát thực địa và phân tích hình thái, mẫu G3 có đặc điểm: Dây leo. Thân có góc – rãnh, có lông tơ dày đặc ở các nốt. Lá kép, 3- 5 lá chét, cả hai mặt có lông, mép khía tai bèo. Tua cuốn 2 nhánh. Quả xanh hình cầu, đường kính 5-10 mm, có lông thưa. Hạt thường 3, màu nâu đen, hình tim, dày khoảng 3 mm. - Đã phân tích đặc điểm sinh học phân tử của 2 mẫu Giảo cổ lam, so sánh với Genbank. Trên cây phát sinh chủng loại, mẫu G3 chung nhánh với thứ G. burmanicum var. molle với bootstrap 56% và giữa G. burmanicum var. molle và G. burmanicum var. burmanicum khác nhau ở 03 nucleotide đặc trưng (Hình 3.1). Các mẫu G1, G2 và G7 cùng chung nhánh với loài G. guangxiense với giá trị bootstrap 90%. Loài G. guangxiense có mối quan hệ gần gũi với G. compressum với giá trị bootstrap 98% và chúng khác nhau ở 07 nucleotide (Hình 3.2). Hình 3. 1.Nucleotid sai khác trên vùng gen ITS-rDNA giữa thứ G. burmanicum var. molle (molle) và thứ G. burmanicum var. burmanicum (burmanicum) 6
Hình 3. 2. Nucleotid sai khác (chữ đậm) trên vùng gen ITS-rDNA giữa loài G. guangxiense (guangxiense) và loài G. compressum (compressum) Từ kết quả phân tích DNA và kết hợp với đặc điểm hình thái đã khẳng định 2 mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu trong luận án của nghiên cứu sinh có tên khoa học là: + Gynostemma guangxiense X.X.Chen & D.H.Qin. + Gynostemma burmanicum King ex Chakrav var. molle C.Y.Wu. - Đã mô tả đặc điểm hiển vi (bao gồm vi phẫu thân, lá và các đặc điểm bột dược liệu) của 2 loài nghiên cứu. 3.2. Về thành phần hóa học: - Đã định tính xác định trong 2 loài G. guangxiense và G. burmanicum có 7 nhóm chất hóa học gồm saponin, flavonoid, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, sterol và polysaccharid. - Chiết xuất Bột thô 2 loài G. guangxiense và G. burmanicum được ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với ethanol 70%, rút dịch chiết sau mỗi 48h. Gộp dịch chiết 3 lần, cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm đến còn 1/3 thể tích, để lắng qua đêm, gạn rồi lọc lấy dịch lọc. Chiết lần lượt với n-hexan, ethyl acetat. Mỗi dung môi lắc 3 lần, gộp các dịch chiết thu được, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn phân đoạn chiết n-hexan, cắn ethylacetat, và cắn nước. - Phân lập các hợp chất của 2 loài theo hình 3.12 và 3.13. 7
Hình 3.12. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ G. burmanicum King ex Chakrav. var. molle C.Y. Wu Từ loài Gynostemma burmanicum King. ex Chakrav. var. molle C.Y.Wu. đã phân lập được 13 chất, trong đó có 1 hợp chất mới là dẫn chất của tetrahydrofuran gọi tên là Burmanon, uracil, acid coumaric, 2-(4-hydroxyphenyl) propan-1,3-diol; 9 saponin gồm Gypenosid XIII, Ginsenosid F2, Gypenosid IX, Ginsenosid Rb3, Ginsenosid Rg5, 20(S) Ginsenosid Rg3 và 3 saponin mới đặt tên là Gypenosid B1, Gypenosid B2 và Ginsenosid B3. (Bảng 3.3) Cắn EtOAc GGE= 50g Gradient 100% D-100%M GE1.1 GE1.2 GE1.3 GE1.4 CC Sephadex MeOH CC D- M 95/5 KMV1 KMV2 Hình 3.13. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. guangxiense X.X.Chen & D.H.Qin. 8
Cắn nước GPL 173g Gradient 100%D-100%M GPL1.1 GPL1.4 GPL1.5 GPL1.6 GPL1.9 CC Sephadex CC D-M-W 1/1/0,1 M-W 1/1 CC D-M 10/1 GPL9.1 CC RP18 M-W 2,5/1 GPL3.7 GPL7.1 GPL7.3 CC RP18 M-W CC D-M-W GPL10.4 GPL10.8 5/1/0,1 CC D-M-W CC D-M-W GPL4.10 2,5/1/0,1 2/1/0,1 GPL7.5 GPL12.1 GPL12.3 Hình 3.13. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. guangxiense X.X.Chen & D.H.Qin. Hợp chất GPWB3.8: 2-(4-hydroxyphenyl) propan-1,3-diol 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): H 6.76 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, H-5), 7.09(2H, d, J = 7.5 Hz, H-2, H-6), 2.89 (1H, m, H-7), 3,72 (2H, dd, J = 6.5, 10.5 Hz, OCH2), 3.82 (2H, dd, J = 7.0, 10.5 Hz, OCH2) 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): C 132.8 (C-1), 130.1 (C-2,6), 116.2 (C-3,5), 157.1 (C-4), 51.1 (C-7), 65.2 (OCH2) Hợp chất GPWB 3.9: uracil. Chất bột màu trắng. 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): H 5.63 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5), 7.40 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-8). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): C 153.5 (C-2), 167.3 (C-4), 101.7 (C-5), 143.4 (C-6). GPWB 4.6. Chất mới (5,5'- (((2-(4- hydroxyphenyl) propan-1,3- diyl) bis(oxy) bis(methylen) bis (4- hydroxydihydrofuran- 2 (3H) – on), đề nghị gọi tên là Burmanon. Chất dầu màu vàng. HR-ESI-MS m/z: 397,1508 [M+H]+, công thức phân tử C19H24O9. 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): H 2.40 (2H, dd, J = 3.0, 18.0 Hz, Hb-3, 3′), 2.88 (1H, m, H-7″), 2.90 (2H, dd, J = 7.0, 18.0 Hz, Ha-3, 3′), 3.70 (2H, d, J = 3.5 Hz, Hb-6, 6′), 3.74 (2H, m, Hb-8, 8′), 3.77 (2H, d, J = 3.5 Hz, Ha-6, 6′), 3.82 (2H, m, Ha- 8, 8′), 4.39 (2H, m, H-5, 5′), 4.45 (2H, m, H-4, 4′), 6.75 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2″, 6″), 7.08 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3″, 5″). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): C 178.6 (C-2, 2′), 39.1 (C-3, 3′), 69.7 (C-4, 4′), 90.1 (C- 5, 5′), 62.5 (C-6, 6′), 65.2 (C-8, 8′), 157.0 (C-1″), 116.2 (C-2″, 5″), 130.1 (C-3″, 6″), 132.8 (C- 4″), 51.1 (C-7″). 9
GPWB 5.14 (Acid p. coumaric) Chất bột vô định hình 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): H 6.32 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-8), 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3, 5), 7.44 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6), 7.56 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-8). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): C 127.5 (C-1), 130.8 (C-2,6), 116.7 (C-3,5), 160.8 (C-4), 145.5 (C-7), 115.8 (C-8), 171.2 (C-9). GPWB 5.15 (Gypenosid XIII) Chất bột vô định hình không màu. ESI-MS: m/z =777.5 [M+Na]+ -C41H70O12. 1H-NMR (bảng 3.1), 13C-NMR (bảng 3.2). GPWB 5.16 (Ginsenosid Rg5) Chất bột vô định hình không màu. C41H70O12. 1H-NMR (bảng 3.1), 13C- NMR (bảng 3.2). GPWB 6.5 (Ginsenosid F2) Chất bột vô định hình màu trắng. ESI-MS: m/z= 807,5 [M+Na]+, C42H72O13. 1H-NMR (bảng 3.1), 13C-NMR (bảng 3.2). GPWB 6.6 (20(S)- Ginsenosid Rg3)Chất bột vô định hình màu trắng. ESI- MS: mz/ 807,5 [M+Na]+, C42H72O13. 1H-NMR (bảng 3.1), 13C-NMR (bảng 3.2). GPWB 8.5 (Chất mới)- đề xuất gọi tên là Gypenosid B1. Chất bột vô định hình không màu. HR-ESI-MS: m/z= 899,5334 [M-H]- tính toán lý thuyết C47H79O16 là 899,5338, do đó có công thức phân tử C47H80O16. Phổ 1H NMR ở vùng trường mạnh xuất hiện 8 nhóm methyl tại H 0.86 (3H, s, H-29), 0.91 (3H, s, H-19), 0.93 (3H, s, H-30), 1.01 (3H, s, H-18), 1.06 (3H, s, H-28), 1.25 (3H, s, H-21), 1.63 (3H, s, H-27), và 1.70 (3H, s, H-26), vùng trường yếu hơn trong khoảng 3.18 - 4.49 là những tín hiệu proton của phân tử đường và các nhóm oxy methin. Trong đó có 3 proton anome của các phân tử đường tại H 4.30 (d, J = 7.5 Hz), 4.43 (d, J = 7.5 Hz), và 4.49 (d, J = 7.5). Phổ 13C NMR kết hợp phổ HSQC cho thấy phân tử xuất hiện 47 carbon, trong đó có 30 carbon của khung dammaran, còn lại là 17 carbon của 3 phân tử đường. Vị trí những phân tử đường được xác định dựa trên phổ HMBC, trên phổ xuất hiện tương tác: H-1′ với C-3, cho biết một phân tử đường gắn lên vị trí C-3 của khung dammaran. H-1‴ tương tác với C-6″, H-1″ tương tác với C-20. Bằng phương pháp thuỷ phân và xác định đường trên thiết bị GCMS cho phép xác định sự có mặt của đường xylose và glucose. Vậy phân tử đường xylose được gắn vào vị trí C-6″ của phân tử đường glucose và phân tử đường glucose được gắn vào vị trí C-20 của khung dammaran. 10
So sánh hợp chất này với hợp chất gypenosid IX đã công bố, cho thấy sự giống nhau giữa hai chất, chỉ khác nhau là trên khung dammaran của GPWB8.5 vị trí C-12 là nhóm CH2, còn trên gypenoside IX là nhóm OH. Qua những dữ liệu phổ phân tích trên và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất GPWB8.5 được xác định là 3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O[-β-D- xylopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl] 20(S)-dammar-24-en-3β,20-diol. GPWB 8.9 (Chất mới)- đề xuất gọi tên là Gypenosid B2. Chất bột vô định hình màu vàng. HR-ESI-MS: m/z= 885,5215 [M-H]- (tính toán lý thuyết C46H77O16 = 885,5211), cho công thức phân tử C46H78O16. 1H-NMR (bảng 3.1), 13C-NMR (bảng 3.2). GPWB 8.10 (Gypenosid IX). Chất bột vô định hình không màu. 1 H-NMR (bảng 3.1), 13C-NMR (bảng 3.2). GPWB 11.3 (chất mới)- dammar-24-en-3β,20S-diol-12-on-3-[-β-D- glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-[-β-D-xylopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranosyl], đề nghị gọi tên là Ginsenosid B3 HR-ESI- MS: m/z 1075,5689 [M-H]- (tính toán lý thuyết C53H87O22 = 1075,5663), cho công thức phân tử C53H88O22. 1H-NMR (bảng 3.1), 13C-NMR (bảng 3.2). GPWB 11.5(Ginsenosid Rb3) Chất bột vô định hình màu trắng. ESI-MS: m/z = 1101.6 [M+ Na]+. C53H90O22. 1H-NMR (bảng 3.1), 13C-NMR (bảng 3.2). Bảng 3.1. Dữ liệu 13C-NMR của các saponin phân lập từ G. burmanicum C 5.15 5.16 6.5 6.6 8.5 8.9 8.10 11.3 11.5 1 39.9 40.3 40.2 40.2 40.3 40.2 40.2 39.9 40.2 2 27.9 27.2 27.1 27.2 27.2 27.2 27.1 27.1 27.2 3 79.5 91.2 90.6 91.2 90.8 90.4 90.6 90.9 91.3 4 40.2 40.5 40.3 40.5 40.4 40.3 40.3 40.5 40.5 5 57.2 57.5 57.5 57.5 57.7 57.5 57.5 57.4 57.5 6 19.4 19.2 19.2 19.2 19.2 19.2 19.2 19.3 19.2 7 35.8 36.1 35.8 35.9 36.5 35.8 35.8 35.5 35.8 8 40.9 41.2 41.0 40.9 41.6 40.9 40.9 41.1 40.9 9 51.0 51.9 51.0 51.3 52.1 51.1 51.1 56.3 51.1 10 38.1 38.0 37.9 37.9 38.0 37.9 37.9 38.5 37.9 11 30.8 32.3 31.0 32.0 22.7 30.8 30.8 40.8 30.8 12 71.6 74.1 71.9 72.1 26.0 71.6 71.6 215.5 71.7 13 49.6 51.4 49.8 49.8 43.5 49.7 49.6 57.2 49.7 14 52.3 51.8 52.4 52.5 51.5 52.4 52.3 57.5 52.4 15 31.5 33.4 31.6 32.1 32.2 31.5 31.5 33.0 31.5 16 27.2 29.4 27.1 27.3 28.8 27.3 27.2 25.0 27.2 11
17 52.8 51.2 53.1 55.1 48.9 52.9 52.8 43.1 52.9 18 16.3 16.1 16.2 16.1 16.1 16.3 16.3 16.3 16.3 19 16.6 16.8 16.7 16.7 16.9 16.7 16.7 16.7 16.6 20 84.9 140.4 84.9 74.4 83.8 84.9 84.9 82.6 84.9 21 22.4 12.9 22.8 26.5 21.5 22.4 22.4 22.7 22.4 22 36.7 124.5 36.6 36.3 40.8 36.7 36.7 40.5 36.7 23 23.8 27.9 24.2 23.2 23.6 23.8 23.8 24.5 23.8 24 126.0 124.1 125.8 126.1 126.3 126.0 126.0 126.0 126.0 25 132.1 132.1 132.2 132.2 131.7 132.1 132.1 131.9 132.1 26 25.9 25.8 25.8 25.8 25.9 25.9 25.9 25.9 25.9 27 18.0 17.7 17.9 17.6 18.0 18.0 18.0 17.8 18.0 28 28.6 28.3 28.4 28.3 28.4 28.4 28.4 28.3 28.4 29 16.1 16.7 16.8 16.8 16.8 16.8 16.8 16.6 16.7 30 17.4 17.2 17.2 17.1 17.1 17.4 17.4 17.1 17.4 3-glc 3-glc 3-glc 3-glc 3-xyl 3-glc 3-glc 3-glc 1′ 105.3 106.7 105.3 106.6 107.3 106.6 105.3 105.3 2′ 81.1 75.4 81.1 75.6 75.4 75.1 81.2 81.1 3′ 77.6 78.2 77.6 77.6 77.9 77.6 77.4 77.4 4′ 71.5 71.7 71.6 71.6 71.2 71.6 71.5 71.6 5′ 78.5 77.6 78.5 77.4 66.7 77.4 78.5 78.5 6′ 63.1 62.5 63.1 62.8 62.7 63.1 63.1 2’-glc 2’-glc 2’-glc 2’-glc 1″ 104.5 104.5 104.5 104.5 2″ 76.3 76.3 76.3 76.3 3″ 77.8 77.9 77.8 77.9 4″ 71.9 71.9 71.9 71.9 5″ 78.2 78.3 77.6 77.7 6″ 62.8 62.8 62.8 62.8 20-glc 20-glc 20-glc 20-glc 20-glc 20-glc 20-glc 1‴ 98.3 98.3 98.6 98.0 98.0 98.4 98.0 2‴ 75.1 75.6 75.5 75.2 75.9 75.5 75.2 3‴ 78.5 78.3 78.4 78.5 78.5 78.6 78.6 4‴ 71.3 71.2 71.5 71.4 71.3 71.4 71.4 5‴ 76.5 77.9 76.2 76.6 76.5 76.2 76.6 6‴ 70.0 68.2 70.1 70.0 70.4 70.0 70.0 6‴-xyl 6‴-xyl 6‴-xyl 6‴-xyl 6‴-xyl 6‴-xyl 1‴′ 105.4 105.5 105.4 105.4 105.5 105.5 2‴′ 74.7 74.7 74.7 74.7 74.7 74.8 3‴′ 77.4 78.2 77.4 78.2 78.3 78.3 4‴′ 71.0 71.1 71.1 71.1 71.1 71.1 5‴′ 66.6 66.7 66.6 66.7 66.7 66.7 12
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H- NMR của các saponin phân lập từ G.burmanicum C 5.15 5.16 6.5 6.6 8.5 8.9 8.10 11.3 11.5 1 1.76m 1.73 m 1.75 m 1.74 m 1.71m 1.70 m 1.71m 1.60m 1.75 m 1.01 m 1.06 m 1.04 m 1.05 m 1.00 m 0.97m 0.97 m 1.03 m 1.03 m 2 1.68 m 2.00 m 1.98 m 2.01 m 1.95 m 1.80 m 1.92 m 1.99 m 2.00 m 1.62 m 1.74 m 1.73 m 1.75 m 1.72 m 1.68 m 1.40 m 1.74 m 1.91 m 3 3.16 m 3.21 m 3.19 m 3.20 m 3.18 m 3.10 m 3.14 m 3.20 m 3.20 m 4 - - - - - - - - - 5 0.80 d 0.82 d 0.80 d 0.76 d 0.76 d 0.82 d 0.80 d 0.77 d (11.0) 0.81 d (11.0) (11.0) (11.5) (11.0) (11.0) (11.0) (11.0) (11.0) 6 1.58 m 1.58 m 1.60 m 1.60 m 1.56 m 1.54 m 1.54 m 1.66 m 1.58 m 1.51 m 1.49 m 1.52 m 1.50 m 1.49 m 1.46 m 1.46 m 1.57 m 1.52 m 7 1.57 m 1.55 m 1.59 m 1.56 m 1.58 m 1.54 m 1.54 m 1.55 m 1.57 m 1.31 m 1.34 m 1.33 m 1.33 m 1.30 m 1.28 m 1.27 m 1.42 m 1.31 m 8 - - - - - - - - - 9 1.45 m 1.47 m 1.49 m 1.48 m 1.40 m 1.41 m 1.42 m 1.73 m 1.46 m 10 - - - - - - - - - 11 1.81 m 1.77 m 1.85 m 1.57 m 1.53 m 1.77 m 1.77 m 2.43 m 1.81 m 1.26 m 1.24 m 1.24 m 1.07 m 1.29 m 1.27 m 1.22 m 2.13 m 1.27 m 12 3.74 m 3.62 m 3.68 m 3.55 m 1.74 m 3.70 m 3.70 m - 3.74 m 13 1.76 m 1.81 m 1.77 m 1.76 m 1.74 m 1.71 m 1.71 m 3.32 m 1.76 m 14 - - - - - - - - - 15 1.60 m 1.68 m 1.62 m 1.85 m 1.49 m 1.55m 1.56 m 1.82 m 1.60m 1.06 m 1.12 m 1.08 m 1.27 m 1.04 m 1.02 m 1.02 m 1.16 m 1.06 m 16 1.91 m 1.88 m 1.95 m 1.89 m 1.85 m 1.79 m 1.87 m 1.92 m 1.75 m 1.34 m 1.46 m 1.41 m 1.33 m 1.33 m 1.30 m 1.75 m 1.35 m 13
17 2.29 m 2.61 m 2.31 m 2.04 m 1.97 m 2.26 m 2.27 m 2.52 m 2.31 m 18 1.02 s 1.07 s 1.04 s 1.03 s 1.01 s 0.98 s 0.98 s 1.28 s 1.02s 19 0.93 s 0.94 s 0.95 s 0.94 s 0.91 s 0.90 s 0.90 s 1.01 s 0.94 s 20 - - - - - - - - - 21 1.38 s 1.65 s 1.36 s 1.17 s 1.25 s 1.34 s 1.34 s 1.13 s 1.38 s 22 1.80 m 5.29 t 1.83 m 1.51 m 1.58 m 1.77 m 1.77 m 1.66 m 1.81 m 1.55 m (6.0) 1.65 m 1.40 m 1.30 m 1.50 m 1.50 m 1.54 m 23 2.16 m 2.03 m 2.14 m 2.12 m 2.03 m 2.15 m 2.68 t 2.10 m 2.07 m 2.06 m 1.16 m 2.02 m 2.02 m 2.06 m 24 5.15 m 5.10 m 5.13 m 5.16 m 5.11 m 5.11 t (7.0) 5.11 t (7.0) 5.12 m 5.15 t (7.5) 25 - - - - - - - - - 26 1.71 s 1.68 s 1.70 s 1.70 s 1.70 s 1.67 s 1.67 s 1.70 s 1.71 s 27 1.65 s 1.63 s 1.64 s 1.64 s 1.63 s 1.61 s 1.61 s 1.64 s 1.65 s 28 0.98 s 1.09 s 1.07 s 1.09 s 1.06 s 1.02s 1.03 s 1.10 s 1.09 s 29 0.80 s 0.88 s 0.87 s 0.88 s 0.86 s 0.83 s 0.83 s 0.90 s 0.88 s 30 0.94 s 0.93 s 0.95 s 0.93 s 0.93 s 0.90 s 0.90 s 0.76s 0.94 s oses 3-glc 3-glc 3-glc 3-glc 3-xyl 3-glc 3-glc 3-glc 4.45 d 4.34 d 4.44 br d 1′ 4.46 d (7.5) 4.34 d (7.5) 4.24d (7.5) 4.31 br d 4.44 br d (7.0) (7.0) 2′ 3.57 m 3.10 t (8.5) 3.58 m 3.30 m 3.16 m 3.17 m 3.58 m 3.58 m 3′ 3.28 m 3.33 m 3.28 m 3.26 m 3.27 m 3.24 m 3.33 m 3.33 m 4′ 3.30 m 3.28 m 3.30 m 3.31 m 3.47 m 3.26 m 3.30 m 3.30 m 5′ 3.57 m 3.26 m 3.57 m 3.31 m 3.16 m 3.29 m 3.57 m 3.57 m 3.79 dd 3.81 m 3.84 m 3.83 m 3.83 3.85 m 3.83 m 6′ (12.5, 2.5) 3.65 dd 3.64 dd 3.62 m 3.63 m 3.67 m 3.63 m 3.64 m (12.0, 5.5) (12.0, 5.5) 2’-glc 2’-glc 2’-glc 2’-glc 14
4.69 d 4.69 1″ 4.69 d (7.5) 4.69 d(7.5) (8.0) d(7.5) 2″ 3.23 m 3.24 m 3.24 m 3.24 m 3″ 3.38 m 3.36 m 3.36 m 3.36 m 4″ 3.23 m 3.22 m 3.26 m 3.22 m 5″ 3.26 m 3.25 m 3.29 m 3.29 m 3.86 m 3.86 m 3.86 m 3.87 m 6″ 3.67 m 3.66 m 3.67 m 3.66 m 20-glc 20-glc 20-glc 20-glc 20-glc 20-glc 20-glc 4.62 d 4.55 d 4.46 br d 4.59 d 1‴ 4.59 d (7.5) 4.49 d (7.5) 4.55 d (8.0) (8.0) (8.0) (7.5) 2‴ 3.15m 3.21 m 3.32 m 3.11 m 3.11 m 3.13 m 3.14 m 3‴ 3.36 m 3.37 m 3.36 m 3.33 m 3.33 m 3.36 m 3.36 m 4‴ 3.36 m 3.32 m 3.38 m 3.31 m 3.32 m 3.37 m 3.35 m 5‴ 3.42 m 3.22 m 3.38 m 3.38 m 3.38 m 3.38 m 3.42 m 4.00 m 4.03 dd 4.01 dd 3.86 dd 4.00 d(11.0) 4.00 d(11.0) 4.00 m 3.77 m (11.5, 2.0) 6‴ (21.5, 2.0) (12.0, 2.5) 3.76 m 3.73 m 3.72 m 3.75 dd 3.76 m 3.66 m (11.5, 5.5) 6‴-xyl 6‴-xyl 6‴-xyl 6‴-xyl 6‴-xyl 6‴-xyl 4.31 d 4.32 d 1‴′ 4.32 d (7.5) 4.30 d (7.5) 4.28 d (7.5) 4.28 br d (7.5) (7.0) 2‴′ 3.23 m 3.23 m 3.19 m 3.19 m 3.24 m 3.21 m 3‴′ 3.33 m 3.36 m 3.29 m 3.32 m 3.35 m 3.35 m 4‴′ 3.50 m 3.50 m 3.44 m 3.44m 3.50 m 3.50 m 3.87 m 3.87 m 3.84 m 3.87 m 3.86 m 5‴′ 3.81 m 3.21 m 3.21 m 3.17 m 3.21 m 3.20 m 15
Bảng 3.3. Các chất phân lập được từ G. burmanicum GPWB5.15- Gypenosid XIII GPWB 4.6- Burmanon GPWB5.16 GPWB6.5 Ginsenosid Rg5 Ginsenosid F2 GPWB8.5 GPWB6.6 Chất mới 20(S)-GinsenosidRg3 Gypenosid B1 GPWB8.9 GPWB8.10 Chất mới Gypenosid IX Gypenosid B2 16
GPWB11.3 Chất mới Ginsenosid B3 GPWB11.5. Ginsenosid Rb3 GPWB5.14 GPWB3.8 acid p-coumaric GPWB3.9- Uracil 2-(4-hydroxyphenyl)propane-1,3-diol - Từ loài Gynostemma guangxiense X.X. Chen & D.H. Qin. đã phân lập 6 chất là quercetin, (22E)- stigmasta- 5,22- dien- 3yl- hexopyranoside và 4 saponin (ginsenosid Rb3, quinquenosid L3 và 2 saponin mới đặt tên là Gynosid VN1, Gynosid VN2) (Bảng 3.5) KMV1 (Quercetin) Tinh thể hình kim màu vàng. ESI- MS: m/z 301 [M-H]-, C15H10O7. 1 H-NMR: (500 MHz, CD3OD): H 6,19 (1H, d, J=2Hz, H6), 6.39, (1H, d, J= 1.5 Hz, H8), 7.75 (1H,s, H-2′), 6.89 (1H, dd, J= 8.5Hz, 3.5Hz, H-5′), 7.65 (1H, dd, J=8 Hz, 1.5Hz, H-6′). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): C 148,01 (C-2), 137,22 (C-3), 177,32 (C-4), 162,47(C-5), 99,24 (C-6), 165,54(C-7), 94,42 (C-8), 158,22 (C-9), 104,52 (C- 10), 124,15 (C-1′), 116,01 (C-2′), 146,20 (C-3′), 148,75 (C-4′), 116,23 (C-5′), 121,69 (C-6′). KMV2: (22E)- stigmasta- 5,22- dien- 3yl- hexopyranosid Tinh thể hình kim màu trắng. ESI- MS: m/z 597 [M+Na]+, C35H58O6. 1 H- NMR: (500MHz, CD3OD) H 3,67 (1H, s, H3), 5,37 (1H, d, J=5Hz, H6), 0.71 (3H,s, H-18), 1,02 (3H, s, H-19), 0,85 (3H, d, J= 6,5Hz, H-21), 5,16 (1H, dd, J= 15 Hz, 6.5Hz, H-22), 5,03 (1H, dd, J= 15 Hz, 6.5 Hz, H-23), 0,81 (d, 3H, J= 7.5Hz, H-28); 0.80 ( d, 3H, J= 7Hz, H-29); 4,42 (d, 1H, J= 7.5Hz, H-1′). 13 C- NMR: (125MHz, CD3OD) C 37,49 (C-1), 32,12 (C-2), 79,37 (C-3), 40,71 (C-4), 140,55 (C-5), 122,3 (C-6), 29,81 (C-7), 32,12 (C-8), 50,46 (C-9), 36,95 (C-10), 21,27 (C-11), 38,91 (C-12), 42,45 (C-13), 57,09 (C-14), 24,54 (c-15), 29,11 (C15), 56,21 (C-17), 12,19 (C-18), 19,10 (C-19), 39,89 (C-20), 21,34 (C- 21), 138,55 (C-22), 129,54 (C-23), 51,50 (C-24), 32,12 (C-25), 21,28 (C-26), 19,46 (C-27), 25.59 (C-28), 12.33 (C-29), 101.37 (C-1′), 73.80 (C-2′), 76.69 (C- 3’), 70.45 (C-4’), 76.05 (C-5’), 62.08 (C-6’). 17
GPL4.10 (Chất mới)- (20S,24R)-epoxydammarane-12,25- diol-3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid- Gynosid VN1. Chất bột màu trắng. HR-ESI-MS m/z 771.4874 [M + H]+ công thức phân tử là C41H70O13. 1H-NMR và 13C- NMR (bảng 3.4). GPL 7.5 (chất mới)- (20S,24R)-epoxydammaran-12,25-diol- 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→6)]-β- D-glucopyranosid- Gynosid VN2. HR-ESI-MS m/z 917.5485 [M+ H]+ (tính toán lý thuyết C47H82O17 = 917.5474), C47H81O17. 1H- NMR và 13C- NMR (bảng 3.4). GPL12.1. Quinquenosid L3 Chất bột màu trắng. ESI- MS: m/z 993,2 [M+H]+, C47H80O18. 1H- NMR và 13C- NMR (bảng 3.4). GPL12.3 (Ginsenoside Rb3) Chất bột màu trắng. 1H-NMR và 13C- NMR (bảng 3.4). 18