Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư" được nghiên cứu nhằm: Thiết kế và tổng hợp được khoảng 50 acid hydroxamic mới mang khung quinazolin hướng ức chế enzym HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư; Đánh giá tác dụng ức chế enzym HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Dược học: Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN THANH HIẾU THIẾT KẾ VÀ TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG QUINAZOLIN HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ Chuyên ngành: Hóa dược Mã số: 62720403 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2023
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội. Người hướng dẫn KH: PGS. TS. Phạm Thế Hải GS. TS. Sang-Bae Han Phản biện 1: ……………………………………………………... ……………………………………………………... Phản biện 2: ……………………………………………………... ……………………………………………………... Phản biện 3: ……………………………………………………... ……………………………………………………... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: ………………………………………………………………. ……………………………………………………………………….. Vào hồi ………… giờ ………. Ngày …… tháng ……. năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện trường ĐH Dược HN
I. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Thiết kế cấu trúc dựa trên mục tiêu phân tử đang trở thành hướng đi chủ yếu trong nghiên cứu thuốc điều trị ung thư. Enzym histon deacetylase (HDAC) là mục tiêu phân tử quan trọng, nhiều hợp chất mới đã được phát hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế HDAC, nổi bật nhất là nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic với bốn thuốc đã được cấp phép điều trị. Dẫn chất hydroxamic có khung cấu trúc chung gồm ba phần: (1) nhóm gắn kẽm là acid hydroxamic, (2) cầu nối là mạch hydrocarbon thân dầu, và (3) nhóm nhận diện bề mặt là cấu trúc vòng thơm giàu electron. Khung quinazolin giàu điện tử rất phù hợp với vai trò là nhóm nhận diện bề mặt. Cấu trúc này có mặt trong nhiều hợp chất mang hoạt tính đa dạng và được ứng dụng trong thiết kế kháng sinh mới, thuốc chống viêm, giảm đau, thuốc tác động lên hệ thần kinh hoặc tế bào ung thư theo các cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, tác dụng ức chế HDAC chưa có nhiều nghiên cứu khảo sát. Luận án “Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư” được thực hiện nhằm tìm kiếm các chất ức chế HDAC mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư. 2. Mục tiêu luận án (1) Thiết kế và tổng hợp được khoảng 50 acid hydroxamic mới mang khung quinazolin hướng ức chế enzym HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư. (2) Đánh giá tác dụng ức chế enzym HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được. 3. Những đóng góp mới của luận án Về thiết kế cấu trúc, tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc: Đã thiết kế và tổng hợp được 55 dẫn chất acid hydroxamic mang khung quinazolin mới hướng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư, những dẫn chất này chưa được công bố trong các tài liệu trước đó. Về đánh giá tác dụng sinh học: Tất cả dẫn chất được đánh giá tác dụng ức chế HDAC theo phương pháp huỳnh quang; tác dụng kháng 1
tế bào ung thư trên ba dòng tế bào SW620, PC3 và NCI-H23 theo phương pháp SRB. Kết quả, cả 55 chất có khả năng ức chế HDAC, một số chất có tác dụng tương đương hoặc mạnh hơn SAHA, 54/55 chất có hoạt tính ức chế tế bào đáng kể, 50/55 chất gây độc ba dòng tế bào mạnh hơn SAHA, hai chất IVb và IVc có độc tính tế bào mạnh nhất (gấp 30 lần SAHA). Phân tích liên quan cấu trúc – tác dụng sử dụng kết quả docking phân tử của các chất với HDAC khẳng định các cấu trúc tốt cho hoạt tính: khung quinazolin hoặc quinazolin-4(3H)- on, mang nhóm thế kích thước nhỏ ở các vị trí 2, 6 và/hoặc 7 cho phần nhận diện bề mặt; cấu trúc benzamid, cinnamamid hoặc heptanamid cho phần cầu nối. Kết quả dự đoán một số thông số dược động học – độc tính của vài chất có hoạt tính nổi bật cho thấy VIIIc là chất có tiềm năng nhất cho các nghiên cứu tiếp theo để phát triển thành thuốc. Về phương pháp nghiên cứu: Việc sử dụng linh hoạt kỹ thuật docking phân tử ở các giai đoạn thiết kế cấu trúc và bàn luận về liên quan cấu trúc – tác dụng khi thực hiện luận án là một công cụ hữu hiệu gắn kết giữa cơ sở lý thuyết với kết quả thực nghiệm, giúp luận án đạt được mục tiêu đề ra là tìm kiếm các cấu trúc tiềm năng. 4. Bố cục luận án Luận án có 149 trang, bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (1 trang); Tổng quan (41 trang); Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu (12 trang); Kết quả nghiên cứu (50 trang); Bàn luận (43 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án (1 trang). Luận án có 179 tài liệu tham khảo (15 trang), 292 phụ lục (177 trang). II. NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1. TỔNG QUAN Chương Tổng quan đã trình bày về: - Histon deacetylase (HDAC) và các chất ức chế histon deacetylase (HDACi): HDAC và vai trò đối với ung thư; Cấu trúc chung của HDACi, các chất ức chế chọn lọc HDAC nhóm I và HDAC6. - Quinazolin và dẫn chất: Cấu trúc, hoạt tính sinh học, các phương 2
pháp tổng hợp quinazolin và dẫn chất. - Protein docking và ứng dụng trong thiết kế thuốc. Chương 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, trang thiết bị Cấu trúc của các chất dự kiến, cấu trúc tinh thể tia X của HDAC2, HDAC6. Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi có xuất xứ từ Đức, Trung Quốc. Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng trong tổng hợp hữu cơ. Máy tính, các phần mềm, ứng dụng tin sinh học. Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máy điện di. Dịch chiết HDAC (HeLa), các dòng tế bào ung thư người. 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu - Thiết kế cấu trúc: Thiết kế cấu trúc của các acid hydroxamic mới mang khung quinazolin hướng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư dựa vào cấu trúc của các chất dẫn đường, sử dụng quinazolin làm hợp phần chính cho phần nhận diện bề mặt. Dự đoán tương tác của các chất dự kiến với mô hình cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym HDAC2 bằng phương pháp docking protein. - Tổng hợp và xác định cấu trúc: Tổng hợp acid hydroxamic mới mang khung quinazolin có cấu trúc đã được thiết kế và được dự đoán là có tương tác tốt với HDAC2, sử dụng các phản ứng cơ bản của tổng hợp hữu cơ. Tinh chế. Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR). - Đánh giá hoạt tính sinh học: Đánh giá tác dụng ức chế HDAC tổng chiết từ tế bào HeLa của các chất tổng hợp bằng phương pháp định lượng huỳnh quang, tác dụng kháng ung thư trên một số dòng tế bào ung thư người bằng phương pháp SRB. Phân tích liên quan cấu trúc – tác dụng của các dẫn chất, sử dụng kết quả docking phân tử. Dự đoán đặc tính dược động học – độc tính của một số chất có tác dụng sinh học nổi bật bằng một số công cụ tin sinh học. 3
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả thiết kế cấu trúc, dự đoán tương tác, tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc Khung cấu trúc dự kiến của các chất và kết quả thiết kế cấu trúc các dãy chất theo 3 nhóm (gồm 3 bước) được thể hiện trên Hình 3.1. Hình 3.1. Kết quả thiết kế cấu trúc của các dẫn chất. Bảng 3.1. Năng lượng liên kết dự đoán của các chất với HDAC2. Dãy chất Năng lượng Dãy chất Năng lượng liên kết liên kết (kcal/mol) (kcal/mol) Ia-h -27,25 ÷ -20,19 Va-i -24,29 ÷ -17,31 IIa-d -25,19 ÷ -18,99 VIa-c -20,52 ÷ -17,43 IIIa-d -19,59 ÷ -18,90 VIIa-i -20,37 ÷ -18,08 IVa-i -24,45 ÷ -16,87 VIIIa-i -23,85 ÷ -18,13 SAHA -19,58 Kết quả dự đoán khả năng tương tác với HDAC2 cho thấy hầu hết các cấu trúc dự kiến có tương tác tốt với enzym (năng lượng liên kết thấp hơn hoặc tương đương SAHA, Bảng 3.1). Đây là cơ sở để luận án tổng hợp các dẫn chất theo cấu trúc thiết kế, tinh chế và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất trên các mô hình in vitro. Kết quả tổng hợp hóa học Các dẫn chất được tổng hợp theo các qui trình sau: 4
Dãy chất Ia-h Dãy chất IIa-d Dãy chất IIIa-d Dãy chất IVa-i và Va-i Dãy chất VIa-c 5
Dãy chất VIIa-i Dãy chất VIIIa-i Luận án đã tổng hợp được 55 chất, đều ở thể chất rắn (Phụ lục 1). Phụ lục 1. Tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học của các dẫn chất. Dãy chất Màu Hiệu suất (%) tnc (℃) Ia-h Trắng/Vàng 62 ÷ 75 171 ÷ 225 IIa-d Vàng 66 ÷ 73 184 ÷ 232 IIIa-d Vàng 65 ÷ 69 201 ÷ 227 IVa-i Trắng/Vàng 59 ÷ 73 172 ÷ 212 Va-i Trắng/Vàng 56 ÷ 72 174 ÷ 215 VIa-c Trắng 62 ÷ 67 185 ÷ 219 VIIa-i Vàng 65 ÷ 78 185 ÷ 221 VIIIa-i Vàng 65 ÷ 77 187 ÷ 224 Kết quả phân tích dữ liệu phổ Các kết quả phân tích dữ liệu phổ để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất được trình bày trong Chương 4. Bàn luận. 3.2. Kết quả thử tác dụng ức chế enzym, độc tính tế bào và dự đoán một số thông số dược động học – độc tính Các kết quả thử hoạt tính sinh học và dự đoán các thông số dược động học – độc tính (ADMET) của các dẫn chất được trình bày trong Chương 4. Bàn luận. 6
Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Bàn luận về tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc 4.1.1. Tổng hợp hóa học Phản ứng Niementowski ngưng tụ tạo vòng quinazolin-4(3H)- on: Là phản ứng đầu tiên trong qui trình tổng hợp các chất dãy I, III- V, VII-VIII, dựa trên phản ứng Niementowski (Sơ đồ 4.1). Giai đoạn đầu là sự ngưng tụ loại một phân tử nước giữa dẫn chất acid 2- aminobenzoic và formamid, xảy ra ở nhiệt độ thấp nhờ xúc tác của chính acid, tạo chất trung gian imin. Nhờ nhiệt độ cao, cặp điện tử tự do trên nguyên tử N của formamid ban đầu tấn công vào carbon của nhóm chức carboxylic, sự trao đổi proton loại một phân tử nước và hỗ biến keto-enol sẽ tạo ra vòng quinazolin-4(3H)-on. Formamid là chất tham gia đồng thời là dung môi. Giai đoạn tạo liên kết amid cần nhiệt độ cao, tuy nhiên, nhiệt độ quá cao có thể phân hủy sản phẩm, giảm hiệu suất. Vì vậy phản ứng được thực hiện ở 120- 130 ℃, xảy ra hoàn toàn trong 5 – 6 giờ, cho hiệu suất cao (85-96 %). Sản phẩm dẫn chất quinazolin-4(3H)-on bị kết tủa khi rót hỗn hợp phản ứng vào nước lạnh, vì vậy NaHCO3 được thêm vào để tạo muối của acid 2-aminobenzoic dư tan trong nước, giúp loại bỏ tạp dễ dàng. Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng Niementowski ngưng tụ tạo vòng quinazolin-4(3H)-on. Phản ứng tạo vòng 2-methylquinazolin-4(3H)-on qua trung gian benzoxazinon: Là phản ứng đầu tiên trong qui trình tổng hợp dãy II và VI. Phản ứng one-pot gồm 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: Ngưng tụ loại nước giữa quinazolin-4(3H)-4-on và anhydrid acetic, tạo trung gian 2- methyl-4H-benzo[d][1,3]oxazin-4-on. Anhydrid acetic là tác nhân 7
đồng thời là xúc tác, phản ứng xảy ra hoàn toàn sau khi đun hồi lưu trong 1 - 2 giờ. Giai đoạn 2: Amoni acetat được thêm vào hỗn hợp phản ứng (giai đoạn 1) với lượng dư (khoảng 2 đương lượng so với acid anthranilic ban đầu) để tạo liên kết amid mới thay cho liên kết este của nhân oxazin-4-on, tạo khung quinazolin-4(3H)-on. Nhiệt độ cần duy trì ở 80 – 100 ℃. Theo dõi tiến trình để kết thúc phản ứng ở thời điểm phù hợp (khoảng 3 giờ). NaHCO3 được thêm vào hỗn hợp sản phẩm để loại bỏ tạp acid acetic sinh ra trong phản ứng. Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng tạo vòng 2-methylquinazolin-4(3H)-on qua trung gian benzoxazinon. Phản ứng N-alkyl hóa khung quinazolin-4(3H)-on: Để tổng hợp ester trung gian của dãy chất I-VI, theo cơ chế thế ái nhân (Sơ đồ 4.3). Tác nhân alkyl hóa là alkyl-, allyl- hay benzyl- halogenid. Quinazolin- 4(3H)-on có tính ái nhân yếu, cần được hoạt hóa bằng một base yếu. Theo các tài liệu tham khảo, phản ứng thực hiện trong môi trường base, sử dụng muối carbonat (Na2CO3, K2CO3, Cs2CO3), hydrid (LiH, NaH, CaH2), triethanolamin (TEA), … làm xúc tác, dung môi aceton, DMF, DMA, MeCN, NMP hay DMSO. Luận án lựa chọn và sử dụng K2CO3 làm xúc tác, dung môi aceton hoặc DMF, tác nhân alkyl hóa là các alkyl- hoặc benzoyl- bromid. Thêm một lượng nhỏ KI để tăng tốc 8
độ và hiệu suất phản ứng. Sau khi khảo sát, các phản ứng được tiến hành ở 50-60 ℃ trong 24 giờ. Sơ đồ 4.3. Cơ chế phản ứng N-alkyl hóa quinazolin-4(3H)-on. Đối với quinazolin-4(3H)-on, phản ứng alkyl hóa bằng tác nhân alkyl bromid có thể xảy ra ở N1, N3 hoặc OH tùy theo điều kiện phản ứng. Các kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon, đối chiếu với các tài liệu tham khảo giúp khẳng định chắc chắn các dẫn chất đã tổng hợp trong luận án đều là sản phẩm N3-alkyl hóa. Phản ứng C4-amin hóa khung quinazolin-4(3H)-on: Là phản ứng để tổng hợp các chất trung gian của các dãy VII -VIII (Sơ đồ 4.4). Sơ đồ 4.4. Cơ chế phản ứng C4-amin hóa khung quinazolin-4(3H)-on. 9
Phản ứng one-pot tạo liên kết C-N theo cơ chế thế ái nhân giữa hợp chất vòng có hỗ biến keto – enol với tác nhân ái nhân có chứa amin, cần môi trường base để chuyển dạng keto (dạng lactam) của các dị vòng thơm sang dạng enol (dạng phenol) ái nhân hơn. Tương tự phản ứng N-alkyl hóa quinazolin-4(3H)-on, có thể sử dụng các xúc tác base như DBU, TEA, muối carbonat, dung môi MeCN, DMF, aceton. Xúc tác kim loại (như Pd, Cu, Ni), hoặc các chất có cấu trúc là muối của phospho (như BOP, PyBOP, BroP, PyBroP) làm tăng tốc độ phản ứng. Dựa vào các tài liệu tham khảo và kết quả khảo sát, các điều kiện được luận án sử dụng là DBU và PyBOP (khoảng 1,3 đương lượng PyBOP và 3 đương lượng DBU so với quinazolin-4(3H)-on), dung môi acetonitril, nhiệt độ phòng (PyBOP không bền với nhiệt), trong khoảng 24 giờ. Sản phẩm có độ tinh khiết tốt, hiệu suất 83 -94 %. Phản ứng N-acyl hóa tạo acid hydroxamic: Là phản ứng cuối cùng của mỗi qui trình tổng hợp để tạo acid hydroxamic (Sơ đồ 4.5). Sơ đồ 4.5. Cơ chế phản ứng N-acyl hóa tạo acid hydroxamic. Phản ứng acyl hóa theo cơ chế thế ái nhân vào nhóm amin, chỉ có thể xảy ra trong môi trường kiềm mạnh (pH > 10). Hydroxylamin là tác nhân quan trọng, dạng tự do không bền, dễ phân hủy, dễ gây nổ và khó bảo quản, vì vậy được dùng dưới dạng muối HCl (khoảng 10 đương lượng so với ester). Dạng muối được chuyển hoàn toàn thành dạng base tự do trong dung dịch NaOH bão hòa. NaOH dư còn tạo muối natri của acid hydroxamic mới tạo thành, giúp sản phẩm tan hết trong dịch phản ứng, nhưng có thể làm ester bị thủy phân thành acid 10
carboxylic rất khó để loại bỏ. Vì vậy, phản ứng thực hiện ở nhiệt độ thấp (0 ℃, sử dụng hỗn hợp đá muối), đồng thời nhỏ từ từ dung dịch NaOH bão hòa đã được làm lạnh vào bình phản ứng (tránh nhiệt độ tăng đột ngột làm phân hủy hydroxylamin tự do), các yếu tố nhiệt độ và pH được kiểm tra và duy trì. Theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và thuốc thử hiện màu sắt (III) clorid để xác định thời điểm kết thúc phản ứng, thu được sản phẩm có hiệu suất khá cao (78 - 96 %). 4.1.2. Khẳng định cấu trúc Tất cả các dẫn chất đã thiết kế sau khi tổng hợp và tinh chế được đo các phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR để xác định cấu trúc. Các chất trung gian trong quá trình tổng hợp IVa, Va và VIa là 3.8a, 3.9a và 3.10a cũng được đo phổ khối lượng. 4.1.2.1. Phổ hồng ngoại Dựa vào các kết quả trên phổ đồ và đối chiếu với các giá trị tham khảo từ tài liệu, có thể biện luận một số nhóm chức như sau: Khoảng từ 3566-3326 cm-1 có sự xuất hiện của vân hấp thụ khá rõ nét và tù tương ứng với dao động hóa trị của liên kết O-H trong nhóm chức acid hydroxamic; Khoảng từ 3329-3140 cm-1 cũng thể hiện dao động hóa trị liên kết N-H trong nhóm chức acid hydroxamic và nhóm chức amid; Khoảng từ 3099-2997 cm-1 có thể giúp nhận biết dao động hóa trị của liên kết C-H sp2 và 2999-2806 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C- H sp3; Khoảng từ 1695-1624 cm-1 xuất hiện đỉnh hấp thụ với cường độ mạnh và sắc nét giúp nhận biết được dao động hóa trị của liên kết C=O của nhóm chức amid và nhóm chức acid hydroxamic; Khoảng từ 1651-1614 cm-1 xuất hiện đỉnh hấp thụ với cường độ mạnh và sắc nét giúp nhận biết được dao động hóa trị của liên kết C=N của nhóm chức imin trong khung quinazolin; Khoảng từ 1616-1520 cm-1 có thể nhận ra dao động hóa trị của liên kết C=C của vòng benzen và mạch alken. Phổ đồ của 27/55 chất có dao động hóa trị của C=N trong khoảng 1651-1614 cm-1. Cầu nối alkyl được khẳng định nhờ dao động hóa trị bất đối xứng CH2 (2999-2913 cm-1) và dao động hóa trị đối xứng CH2 (2883-2806 cm-1). Các dữ liệu phổ IR giúp sơ bộ xác định khung cấu 11
trúc của các chất mới tổng hợp được có vòng thơm, alken, cầu nối alkyl, các nhóm chức carbonyl, imin, amid và acid hydroxamic. 4.1.2.2. Phổ khối lượng Phổ khối lượng là dữ liệu quan trọng để khẳng định cấu trúc của chất tổng hợp, dựa trên việc xác định khối lượng phân tử và khối lượng của các mảnh ion trên phổ đồ, đối chiếu với khối lượng phân tử và số khối của các mảnh phân tử trong cấu trúc của chất dự kiến. Trên phổ đồ khối lượng của tất cả dẫn chất được tổng hợp, pic có cường độ cao nhất tương ứng với giá trị pic ion phân tử của các chất, bao gồm pic [M+H]+ với chế độ đo positive và [M-H]- với chế độ đo negative. Như vậy, phổ khối lượng là cơ sở để khẳng định các chất tổng hợp được trong luận án đều có công thức phân tử đúng như thiết kế ban đầu. 4.1.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân * Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR a. Phổ cộng hưởng từ proton của dãy chất Ia-h, IIa-d và IIIa-d Khung cấu trúc của dãy chất IIa-d tương tự dãy Ia-h, chỉ khác ở nhóm thế methyl ở vị trí C3 trên khung quinazolin-4(3H)-on, khung cấu trúc của dãy chất IIIa-d tương tự dãy Ia-h nhưng có thêm vinylen ở phần cầu nối. Vì vậy, trên phổ đồ 1H-NMR của các dẫn chất dãy I - III, xuất hiện các pic tương ứng với các proton của khung quinazolin- 4(3H)-on, của cầu nối methylen, nhân benzen, vinylen và acid hydroxamic với độ dịch chuyển, độ bội của tín hiệu phù hợp với cấu trúc dự kiến, cụ thể: + Khung quinazolin-4(3H)-on có các proton ở vị trí 2ʺ, 5ʺ, 6ʺ, 7ʺ và 8ʺ được xác định rõ ràng trên phổ đồ. Đặc điểm của các tín hiệu có thể khác nhau phụ thuộc vào sự xuất hiện và đặc điểm của các nhóm thế ở các vị trí 2ʺ, 6ʺ và 7ʺ: - Proton ở vị trí 2ʺ (H-2ʺ) trên phổ đồ của 12 dẫn chất Ia-h và IIIa- d đều có tín hiệu cộng hưởng dạng singlet với độ dịch chuyển ổn định, khoảng 8,64-8,47 ppm. Các dẫn chất IIa-d có nhóm thế ở vị trí 2ʺ nên không có tín hiệu này trên phổ đồ. 12
- Proton vị trí 5ʺ (H-5ʺ ) có độ dịch chuyển khoảng 8,84 - 7,91 ppm. Tín hiệu cộng hưởng của H-5ʺ ở dạng singlet, doublet, hoặc doublet- doublet. Dạng singlet xuất hiện ở các chất mang nhóm thế -CH3, - OCH3, -F và -Cl tại 6ʺ gồm Ic, Ie, Ig, Ih, IIc và IIIc. Ở những hợp chất này, H-5ʺ mặc dù có thể tương tác ghép cặp với H-7ʺ nhưng do hằng số ghép cặp nhỏ nên hình dạng pic thu được trên phổ đồ là singlet. Dạng doublet, doublet-doublet có ở tín hiệu cộng hưởng của các chất còn lại do các chất này có tương tác giữa H-5ʺ với H-6ʺ và H- 7ʺ. Giữa H-5ʺ và H-6ʺ có tương tác với ortho nên hằng số tách lớn (Jortho = 7,50 – 8,75 Hz), H-5ʺ và H-7ʺ có tương tác meta nên hằng số tương tác nhỏ (Jmeta = 1,00 – 2,50 Hz). Dẫn chất có nhóm thế hút điện tử mạnh (7ʺ-F, chất IIId) có hiện tượng chồng phổ, vì vậy, các pic của H-5ʺ và H-6ʺ quan sát được trên phổ đồ ở dạng multiplet. - Proton vị trí 6ʺ (H-6ʺ) chỉ xuất hiện trên phổ đồ của các chất không có nhóm thế ở 6ʺ, độ dịch chuyển khoảng 7,84 – 7,36 ppm, tín hiệu cộng hưởng dạng doublet, triplet hoặc triplet-doublet. Đối với các chất có nhóm thế ở 7ʺ (chất Ib, Id, If, IIb và IIIb), tín hiệu cộng hưởng của H-6ʺ có dạng doublet do có tương tác với H-5ʺ (Jortho = 8,00 – 9,00 Hz). Tín hiệu cộng hưởng dạng triplet hoặc triplet-doublet ở các dẫn chất còn lại, do H6ʺ có tương tác với H-5ʺ, H-7ʺ và H-8ʺ, với các Jortho = 7,50 – 8,00 Hz và Jmeta = 0,50 Hz (hoặc Jmeta rất nhỏ, không đo được). - Proton vị trí 7ʺ (H-7ʺ) chỉ xuất hiện trên phổ đồ của các chất không có nhóm thế ở 7ʺ (chất Ia, Ic, Ig, Ih, IIa, IIc, IId, IIIa và IIIc), với độ dịch chuyển trong khoảng hẹp 7,85 – 7,45 ppm. Tín hiệu cộng hưởng có dạng doublet, doublet-doublet, doublet-triplet hoặc triplet- doublet, do H-7ʺ có tương tác với H-6ʺ, H-8ʺ và H-5ʺ, với Jortho = 6,50 – 9,00 Hz và Jmeta = 1,00 – 2,50 Hz. - Proton ở vị trí 8ʺ (H-8ʺ) có độ dịch chuyển khoảng 7,85 - 7,14 ppm. Tín hiệu cộng hưởng của H-8ʺ có thể ở dạng singlet đối với các chất có nhóm thế ở 7ʺ (chất Ib, Id, Ie, If, IIb và IIIb), ở dạng doublet hoặc multiplet đối với các chất còn lại do H-8ʺ tương tác với H-7ʺ và H-6ʺ, với Jortho = 8,00 – 10,00 Hz và Jmeta nhỏ. 13
- Các nhóm thế R khác nhau trên khung quinazolin có các tín hiệu cộng hưởng của các proton tương ứng. Nhóm -CH3 có tín hiệu dạng singlet của 3 proton,  = 2,48 - 2,43 ppm; nhóm -OCH3 có tín hiệu dạng singlet của 3 proton ở vùng trường thấp hơn,  = 3,91 - 3,87 ppm. + Hai proton trong cầu nối methylen của tất cả các chất đều có tín hiệu cộng hưởng dạng singlet, độ dịch chuyển khoảng 5,25-5,22 ppm (dãy Ia-h), 5,51-5,40 ppm (dãy IIa-d) và 5,23-5,20 ppm (dãy IIa-d). + Vòng benzen trong phần cầu nối có dạng thế 1,4 tạo thành hai cặp proton đối xứng ở vị trí 2ʹ, 6ʹ và 3ʹ, 5ʹ; các proton này cũng được xác định rõ ràng trên phổ đồ của tất cả dẫn chất. H-2ʹ và H-6ʹ có độ dịch chuyển khá ổn định, khoảng 7,92 - 7,53 ppm, tín hiệu cộng hưởng có dạng đặc trưng doublet do tương tác tương ứng với H-3ʹ và H-5ʹ, JH-2ʹ, H-3ʹ (ortho) và JH-6ʹ, H-5ʹ (ortho) từ 7,50 đến 8,50 Hz. Tương tự, cặp (H-3ʹ và H-5ʹ có độ dịch chuyển khoảng 7,72 - 7,26 ppm, tín hiệu cộng hưởng dạng doublet, JH-2ʹ-H-3ʹ (ortho) và JH-6ʹ-H-5ʹ (ortho) từ 8,00 đến 8,50 Hz. + Cầu nối vinylen (-CH=CH-) có chứa 2 proton không tương đương về mặt từ tính nên tín hiệu cộng hưởng của 2 proton này có độ dịch chuyển khác nhau trên phổ đồ của các chất dãy III. Proton H-2 có độ dịch chuyển khoảng 6,52 - 6,44 ppm, dạng doublet, JH-2, H-3 = 15,50 - 16,00 Hz. Proton H-3 có độ dịch chuyển khoảng 7,55 - 7,44 ppm, dạng doublet, JH-2-H-3 16,00 Hz. Giá trị hằng số ghép cặp của hai proton H2, H3 dao động khoảng 15,50 - 16,00 Hz, đặc trưng cho cấu hình trans của liên kết đôi -CH=CH-. Do đó, có thể kết luận tất cả 4 dẫn chất của dãy III được tổng hợp đều ở cấu hình E. Điều này hoàn toàn phù hợp với nguyên liệu ban đầu sử dụng và chứng minh quá trình tổng hợp không làm thay đổi cấu hình của liên kết đôi này. + Hai proton của hợp phần hydroxamic (-NH-OH) cũng có vị trí rõ ràng trên phổ đồ của hầu hết các chất, với tín hiệu cộng hưởng đặc trưng dạng singlet. Trong đó, nhóm -NH- gần nhóm C=O hơn nhóm - OH, bị ảnh hưởng nhiều hơn bởi hiệu ứng hút điện tử của nhóm carbonyl, vì vậy, trên phổ đồ, proton của nhóm -NH- cộng hưởng ở vùng trường yếu hơn và proton của nhóm OH cộng hưởng ở vùng 14
trường mạnh hơn. Proton của -NH- có độ dịch chuyển khoảng 11,21 - 11,15 ppm (dãy I-II) và 10,78 - 10,75 ppm (dãy III), giá trị này của proton –OH trong khoảng 9,07 - 9,01 ppm. Tuy nhiên, do đặc điểm linh động, dễ bị trao đổi hoặc hỗ biến, hai proton không xuất hiện trên phổ đồ của dẫn chất có gắn thêm một nhóm thế đẩy điện tử mạnh là fluoro ở vị trí 7ʹ của khung quinazolinon (chất IIId). b. Phổ cộng hưởng từ proton của dãy chất IVa-i, Va-i và VIa-c + Các proton trên khung quinazolin-4(3H)-on, acid hydroxamic và các nhóm thế của các dẫn chất dãy IV-VI có tín hiệu cộng hưởng tương đồng với các proton ở các vị trí tương ứng đã biện luận đối với dãy chất I-III. + Các proton trong cầu nối alkyl có vân phổ đặc trưng dạng triplet hoặc multiplet với độ dịch chuyển trong khoảng 4,50 – 1,93 ppm. c. Phổ cộng hưởng từ proton của dãy chất VIIa-i và VIIIa-i + Khung quinazolin có các proton ở vị trí 2’, 5’, 6’, 7’, 8’, các nhóm thế R và hợp phần hydroxamic (-NH-OH) được xác định rõ ràng trên phổ đồ, tương tự các chất dãy I-VI. Do đặc điểm linh động, dễ bị trao đổi hoặc hỗ biến, proton –NH– không xuất hiện trên phổ đồ của dẫn chất có gắn thêm một nhóm thế đẩy điện tử mạnh (chất VIIIi). + Proton của nhóm thế amin ở cầu nối (-NH-) có vị trí rõ ràng trên phổ đồ của hầu hết các chất, với vân phổ đặc trưng dạng singlet, độ dịch chuyển 8,99 – 8,08 ppm. Một số chất có vân phổ dạng triplet hoặc multiplet do proton này có các tương tác ortho với proton của cầu nối alkyl hoặc methylen, với hằng số tách dao động 5,25 – 11,50 Hz. + Các proton trong cầu nối alkyl của tất cả dẫn chất dãy VII có vân phổ đặc trưng dạng triplet hoặc multiplet với độ dịch chuyển trong khoảng 3,66 – 1,93 ppm, tương tự các chất dãy IV-VII. + Hai proton trong cầu nối methylen của các chất VIIIa-i có vân phổ dạng doublet do có tương tác với proton của –NH-, với = 4,93 – 4,80 ppm, Jortho = 5,50 – 16,00 Hz. 15
+ Vòng benzen trong cầu nối của tất cả dẫn chất dãy VIII có dạng thế 1,4 tạo thành hai cặp proton đối xứng ở vị trí 2, 6 và 3, 5; được xác định rõ ràng trên phổ đồ, tương tự các chất dãy I-III. * Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13C-NMR + Khung phân tử của sáu dãy chất I-III đều có 2 nguyên tử carbon trong nhóm carbonyl, vì vậy phổ đồ xuất hiện 2 tín hiệu cộng hưởng ở vùng trường thấp nhất với độ chuyển dịch hóa học khoảng 169,57 - 154,58 ppm. Hai dãy chất VII và VIII có khung quinazolin-4(3H)-on được thay bằng quinazolin, vì vậy phổ đồ chỉ có 1 tín hiệu cộng hưởng ở vùng trường thấp nhất với  = 169,62 – 162,94 ppm. + Các carbon của khung quinazolin, vòng benzen và -CH=CH trong phần cầu nối đều có vị trí cộng hưởng ở khoảng giữa, từ 165,72 – 100,25 ppm. Các dẫn chất có nhóm thế fluoro còn xảy ra tương tác của nguyên tử F với các carbon lân cận, làm tách đôi một số pic. + Các carbon của phần cầu nối methylen và alkyl có độ chuyển dịch hóa học nằm ở vùng trường cao hơn, khoảng 66,98 – 24,81 ppm. + Phổ đồ của các chất cũng đều cho tín hiệu cộng hưởng của các carbon có ở các nhóm thế trên khung quinazolin: nhóm –CH3 có  = 25,03 – 20,79 ppm; nhóm –OCH3 có  = 57,25 – 55,69 ppm. Các kết quả phân tích phổ đã khẳng định cả 55 dẫn chất mới được tổng hợp trong luận án đều có cấu trúc đúng như thiết kế ban đầu 4.2. Bàn luận về liên quan cấu trúc – tác dụng của các dẫn chất 4.2.1. Hoạt tính sinh học của các dãy chất IVa-i, Va-i và VIa-c Dữ liệu trong Bảng 4.1 cho thấy tất cả các chất có hoạt tính ức chế HDAC và độc tính mạnh trên cả ba dòng tế bào thử nghiệm, một số có hoạt tính tương đương hoặc mạnh hơn SAHA. Nghiên cứu docking phân tử cho thấy các chất đều có liên kết tốt với enzym HDAC2, nhiều chất có liên kết chặt chẽ với enzym hơn SAHA, giúp giải thích vì sao một số chất có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng. Các dẫn chất N- hydroxycinnamamid (IIIb-d) có hoạt tính ức chế HDAC và độc tính tế bào mạnh nhất. Các kết quả này khẳng định cấu trúc quinazolin- 4(3H)-on có thể được sử dụng với vai trò là nhóm nhận diện bề mặt 16
trong cấu trúc của các chất ức chế HDAC. Các nhóm thế khác nhau trên khung quinazolin có ảnh hưởng không nhiều đến hoạt tính của các dẫn chất. Hai hợp phần N-hydroxybenzamid và N- hydroxycinnamamid trong cầu nối cũng mang lại hoạt tính tốt cho các dẫn chất. Những kết quả này là cơ sở để luận án thiết kế và tổng hợp các chất nhóm 2 (dãy IV-VI). Bảng 4.1. Kết quả ức chế HDAC và gây độc tế bào của các dẫn chất Ia-h, IIa-d và IIIa-d. Ức chế Độc tính tế bào (IC50, M) HDAC /Dòng tế bào Chất R LogP (IC50, M) SW620 PC3 NCI-H23 Ia -H 1,15 0,41 5,18 5,85 5,72 Ib 7-CH3 1,70 0,91 3,65 4,59 4,85 Ic 6-CH3 1,70 0,49 2,94 2,46 2,26 Id 7-OCH3 1,24 1,01 4,61 3,5 4,46 Ie 6,7-(OCH3)2 0,80 0,37 0,96 0,82 0,65 If 7-F 1,35 0,86 1,92 1,92 1,85 Ig 6-F 1,35 1,50 6,06 3,89 3,54 Ih 6-Cl 1,80 0,61 1,27 0,73 1,30 IIa -H 2,31 1,19 2,81 2,98 3,88 IIb 7-CH3 2,86 0,62 0,46 0,84 1,18 IIc 6-CH3 2,86 0,71 1,15 0,87 0,71 IId 6-Cl 2,51 0,76 0,73 0,64 0,92 IIIa -H 1,24 0,22 1,50 1,12 1,49 IIIb 7-CH3 1,79 0,15 0,63 0,81 0,99 IIIc 6-CH3 1,79 0,09 0,87 0,81 1,16 IIId 7-F 1,88 0,17 0,65 0,62 0,70 SAHA 1,44 0,23 2,8 2,99 3,14 4.2.2. Hoạt tính sinh học của các dãy chất IVa-i, Va-i, VIa-c Dãy chất IV-VI được tổng hợp dựa trên thiết kế cấu trúc có phần nhận diện bề mặt là quinazolin-4(3H)-on giống dãy chất III, thay cinnamamid trong cầu nối bằng mạch alkyl có độ dài tương đương (dãy IV, VI) hoặc dài hơn 1C (dãy V). Kết quả, 21 dẫn chất tổng hợp đều có khả năng ức chế HDAC và độc tính tế bào mạnh, nhiều chất có hoạt lực tương đương, một số chất ức chế HDAC và gây độc tế bào 17
mạnh hơn SAHA. Docking phân tử cho thấy các chất đều có liên kết tốt với HDAC2, nhiều chất có liên kết chặt chẽ với enzym hơn SAHA, góp phần giải thích hoạt tính mạnh hơn SAHA của một số chất. Các kết quả này tiếp tục khẳng định quinazolin-4(3H)-on có nhóm thế kích thước nhỏ trên khung phù hợp cho thiết kế cấu trúc phần nhận diện bề mặt của HDACi. Các nhóm thế trên vòng quinazolin có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt tính của các dẫn chất. Phần cầu nối có cấu trúc mạch alkyl 6 carbon tốt hơn cho hoạt tính enzym. Những kết quả này là cơ sở cho việc thiết kế và tổng hợp các dãy chất VII-VIII (nhóm 3). Bảng 4.3. Kết quả ức chế HDAC và gây độc tế bào của các dẫn chất IVa-i, Va-i và VIa-c. Ức chế Độc tính tế bào (IC50, M) HDAC /Dòng tế bào Chất R LogP (IC50, M) SW620 PC3 NCI-H23 IVa -H 1,16 0,52 0,28 0,21 0,38 IVb 7-CH3 1,71 0,30 0,16 0,13 0,16 IVc 6-CH3 1,71 0,56 0,13 0,10 0,10 IVd 7-OCH3 1,24 0,28 0,56 0,50 0,56 IVe 6,7-(OCH3)2 0,81 0,23 1,49 1,23 1,29 IVf 7-F 1,36 0,52 1,33 1,20 1,37 IVg 6-F 1,36 0,55 1,17 1,20 1,63 IVh 6-Cl 1,81 0,22 0,25 0,53 0,19 IVi 7-NO2 0,98 0,57 1,26 1,73 1,38 Va -H 1,65 0,96 1,09 0,96 1,15 Vb 7-CH3 2,20 0,50 1,10 1,13 1,23 Vc 6-CH3 2,20 0,91 1,04 1,07 1,13 Vd 7-OCH3 1,73 0,09 0,93 1,05 1,11 Ve 6,7-(OCH3)2 1,30 2,20 2,37 2,50 2,78 Vf 7-F 1,85 1,46 1,86 1,00 1,06 Vg 6-F 1,85 0,78 0,75 0,31 0,40 Vh 6-Cl 2,30 0,29 0,65 0,33 0,50 Vi 7-NO2 1,47 0,49 0,89 1,00 1,03 VIa -H 2,32 0,82 1,12 1,78 0,92 VIb 6-CH3 2,87 0,16 0,63 0,57 0,44 VIc 6-Cl 2,52 0,16 >14 >14 >14 SAHA 1,44 0,26 3,40 3,67 3,29 18