Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu cấu trúc của ulvan-một polysaccharide có trong rong lục và tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng nhằm góp phần hoàn thiện hướng nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển và mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Thành Thị Thu Thủy ----------------------------- 2: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Phản biện 1: … Quách Thị Minh Thu Phản biện 2: … Phản biện 3: …. NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA ULVAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ ULVA RETICULATA Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý … năm 2017. Mã sỗ: 62.44.01.19 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ Hà Nội – 2017 - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 2 MỞ ĐẦU nghiên cứu đang được quan tâm là điều chế các dẫn xuất của hợp chất thiên nhiên với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố cấu 1. Tính cấp thiết của luận án trúc đến hoạt tính sinh học, từ đó có thể tạo ra các chất có hoạt tính Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho sinh học cao hơn mẫu tự nhiên. nhiều ngành công nghiệp như dệt may, mỹ phẩm. Trên thế giới có Ở nước ta, polysaccharide chiết tách từ rong đỏ và rong nâu như khoảng 10 000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành carrageenan, alginate và fucoidan đã được nghiên cứu và thu được các rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophyte), rong kết quả tốt thì cho đến nay chưa có một công bố nào về nâu (Pheophyte) và rong đỏ (Rhodophyte). Nước ta có một vùng biển polysaccharide từ các loài thuộc ngành rong lục nói chung và ulvan từ nhiệt đới rộng với bờ biển dài hơn 3000 km bao bọc hết phía đông và chi Ulva nói riêng. nam đất nước, là nguồn cung cấp các loài rong biển phong phú và đa Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu " Nghiên dạng. cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva lactuca Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết và Ulva reticulata”, để nghiên cứu cấu trúc của ulvan-một các chất có hoạt tinh sinh học như lipid, protein, peptide, polysaccharide có trong rong lục và tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến polysaccharide, carotenoid, hợp chất phenolic, alkaloid. Tại Việt Nam tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng nhằm góp nguồn lợi rong lục rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các chi phần hoàn thiện hướng nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển và rong Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam. Ulva gồm 69 loài và phổ biến nhất là Ulva reticulata và Ulva lactuca. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Ulvan là sulfate polysaccharide có trong rong lục thuộc chi Ulva -Xác định cấu trúc của các ulvan có hoạt tính sinh học chiết tách từ 2 và Enteromorpha. Cũng giống như các sulfate polysaccharide có loài rong lục Ulva reticulata và Ulva lactuca phổ biến ở vùng biển nguồn gốc từ rong biển khác, ulvan có cấu trúc rất phức tạp, nó được Nha Trang của Việt Nam. cấu tạo bởi các thành phần chủ yếu là các đường rhamnose, xylose, -Tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt các acid glucuronic, iduronic và nhóm sulfate. Thành phần hóa học và tính sinh học của ulvan. hoạt tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án thu hái, vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và điều kiện chiết tách. Các - Thu thập 2 loài rong lục thuộc chi Ulva là Ulva reticulata và Ulva ulvan từ rong lục có cấu trúc rất đa dạng làm cho việc nghiên cứu cấu lactuca trúc gặp nhiều khó khăn, cản trở sự phát triển của các sản phẩm thuốc - Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của chữa bệnh. Do vậy, việc nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide đòi ulvan chiết tách từ 2 loài rong lục trên. hỏi phải có sự kết hợp một cách hợp lý của nhiều phương pháp. Mặt - Nghiên cứu cấu trúc của các ulvan có hoạt tính tốt. khác, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa - Nghiên cứu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học (sulfate hóa và cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt với hoạt tính acetyl hóa) đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan. sinh học của polysaccharide, do vậy việc nghiên cứu một cách tổng thể cấu trúc của polysaccharide là cần thiết. Hiện nay, một hướng
3 4 4. Cấu trúc của luận án: Luận án gồm 130 trang: Đặt vấn đề 2 trang, là acid glucuronic (GlcA), acid iduronic (IdoA) và nhóm sulfate để Chương 1-Tổng quan 35 trang, Chương 2-Thực nghiệm 14 trang, tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide chính là acid 3- Chương 3-Kết quả và thảo luận 56 trang, Kết luận và kiến nghị 3 sulfate ulvanobiuronic dạng A ((β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(→1)) trang, Danh mục các công trình đã công bố 2 trang, Tài liệu tham và acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng B ((α-L-IdoA-(1→4)-α-L- khảo 18 trang, có 17 bảng biểu và 58 hình ảnh và đồ thị. Rha3S (→1)). Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu cấu trúc CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN polysaccharide bao gồm: Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC, Trong phần tổng quan, luận án đã giới thiệu chung về rong biển, phương pháp phổ IR, phương pháp phổ NMR, phương pháp phổ MS, phân loài rong biển ở Việt Nam và trên thế giới, thành phần dinh phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). dưỡng và ứng dụng của rong biển, các sulfate polysaccharide từ rong CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM biển và tổng hợp về các tính chất hóa lý, phương pháp chiết tách, 2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu thành phần, cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan từ rong lục chi 2.1.1. Thu thập và định danh rong Ulva, như sau: Rong biển hay tảo bẹ hay cỏ biển có thế sống ở cả hai Các mẫu rong lục dùng để chiết ulvan được thu hái tại vùng biển môi trường nước mặn và nước lợ, được chia thành 3 ngành chính bao Nha Trang, tỉnh Khánh Ḥòa, tháng 4/2014 gồm 2 loài rong lục Ulva gồm: rong đỏ (Rhodophyta), rong nâu (Phaeophyta) và rong lục reticulata và Ulva lactuca, được định danh bởi TS. Lê Như Hậu (Viện (Chlorophyta). Rong biển chứa hàm lượng đạm rất cao, rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha trang). Tiêu bản của 2 mẫu khoáng chất, các yếu tố vi lượng trong đó nổi bật là iodine, các rong nghiên cứu đang được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng vitamin (A, E, C, B12 và B1) và chất xơ. Thành phần hóa học của công nghệ Nha Trang và Viện Hóa học với kí hiệu UR-14 (Ulva rong biển bao gồm lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, reticulata) và UL-14 (Ulva lactuca). các hợp chất phenolic, alkaloid... Trong đó, polysaccharide là thành 2.1.2. Phân tích thành phần hóa học của rong phần chính của rong biển, rất có giá trị về mặt kinh tế và được các nhà Xác định độ ẩm, hàm lượng tro, protein thô, béo thô và khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích y học. Ulvan carbohydrate của rong: Theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ là sulfate polysaccharide tan trong nước được phân lập chủ yếu từ 2 AOAC. chi rong lục Ulva và Enteromorpha thuộc họ Ulvaceae, được biết đến 2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục là các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học Sau khi nghiên cứu tham khảo các quy trình và điều kiện chiết quý báu như điều chỉnh hệ miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa, tách ulvan từ rong lục mà các tác giả đã công bố, chúng tôi đã khảo chống đông tụ và kháng vi sinh vật kiểm định. Thành phần hóa học và sát và đưa ra các quy trình để chiết tách ulvan từ 2 loại rong lục thu hoạt tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thập được như sau: thu hái, vị trí địa lý và điều kiện xử lý sau thu hái. Cấu trúc của ulvan 2.1.3.1. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi nước: từ rong lục rất đa dạng và không đồng nhất, được tạo nên bởi các Ngâm chiết 20g bột rong trong 400ml dung dịch nước ở nhiệt độ thành phần đường chủ yếu là rhamnose (Rha), xylose (Xyl), các acid 80º-90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở
5 6 điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, ly tâm lấy dịch trong, qui định chung về thử hoạt tính sinh học như: chuẩn bị mẫu thử, sau đó, cô quay cho đến khi thể tích còn 100ml, thêm tiếp cồn tuyệt mẫu đối chứng, ghi đọc và tính toán kết quả. đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, 2.1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C thu được ulvan thô. Ký Xác định hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư hiệu UR-N, UL-N với hiệu suất chiết tách tương ứng 8,3 và 6,5 (% thử nghiệm bao gồm: HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và w). HeLa (ung thư cổ tử cung). Phép thử này được thực hiện theo 2.1.3.2. Quy trình chiết bằng dung môi acid: phương pháp của Monks. Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400ml dung dịch acid HCl 0,05- 2.1.4.2. Hoạt tính chống đông tụ máu 0,1N ở nhiệt độ 90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết Xác định hoạt tính chống đông tụ máu theo phương pháp của tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung hòa Anderson và CS. về pH=7 rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó cô quay cho đến khi thể tích 2.1.4.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định còn 100ml, thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở pháp khuyếch tán đĩa thạch tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công 60°C thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-H, UL-H với hiệu suất chiết nghệ Nha trang theo phương pháp của Vanden và CS. tách tương ứng là 7,2 và 6,4 (% w). 2.1.4.4. Hoạt tính chống oxy hóa 2.1.3.3. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi kiềm: - Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Prieto và Ngâm chiết 20g bột rong trong 400ml dung dịch kiềm NaOH CS. 0,1N ở nhiệt độ 60ºC, thời gian 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được - Xác định khả năng khử sắt theo phương pháp Zhu và CS. chiết tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung 2.2. Xác định cấu trúc ulvan hòa về pH=7 rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó cô quay cho đến khi thể 2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan tích còn 100ml. Thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = - Xác định hàm lượng sulfate: Hàm lượng sulfate trong phân tử 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy ulvan được xác định theo phương pháp của Dodgson và CS. tủa ở 60°C thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-K, UL-K với hiệu suất chiết tách tương ứng là 5,1 và 4,1 (% w). - Xác định hàm lượng acid uronic: Xác định bằng phương pháp Tinh chế ulvan: mẫu ulvan thô được hòa tan trong nước cất và của Bitter và CS. được tinh chế bằng màng thẩm tách MWCO 10000 (Da) của hãng - Xác định thành phần đường: Xác định theo phương pháp của Thermo Scientific – USA dưới vòi nước chảy trong 72h, kết tủa ulvan Billan và CS. bằng cồn tuyệt đối, ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º, sấy 2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) tủa ở 60°C đến trọng lượng không đổi thu được ulvan có độ sạch cao. Khối lượng phân tử trung bình của ulvan được xác định bằng 2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học GPC, trên máy HPLC Agilent 1100. Pha động 0,1N NaNO3, tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID150. Các phép thử hoạt tính sinh học được tiến hành thử nghiệm đối 2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại IR với các ulvan tự nhiên và các dẫn xuất. Các phép thử đều tuân theo Phổ hồng ngoại của các mẫu ulvan được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU trong vùng số sóng 4000-400cm-1.
7 8 2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Bảng 3.1. Kết quả thành phần hóa học của 6 ulvan SO3Na Acid uronic Mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung môi D2O và được đo Thành phần monosaccharide ( % mol) Ulvan (% khối (% khối phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nước, trên lượng) lượng) Rha Gal Xyl Man Glu máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm UR-N 17,6 22,5 1 0,03 0,06 0,01 0,06 UR-H 14,3 19,3 1 0,1 0,11 0,01 0,21 Khoa học và Công nghệ Việt Nam, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane- UR-K 13,2 19,8 1 0,1 0,14 0,03 0,14 1-sulfonic acid) được dùng làm chất chuẩn nội. UL-N 18,9 21,5 1 0,03 0,07 0,01 0,06 2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng MS UL-H 15,1 18,7 1 0,01 0,10 0,01 0,06 UL-K 14,2 18,2 1 0,04 0,09 0,01 0,07 Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LTQ Orbitrap XLTM, 3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan Thermo SCIENTIFIC kiểu ion hóa âm với dung môi MeOH : H2O = 3.1.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 1:1. Khí phun mù là N2 với áp suất khí là 30psi với tốc độ phun khí Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 650 lít/giờ tại nhiệt độ là 1800C. của 6 mẫu ulvan 2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS Vi Khuẩn UR-H UR-N UR-K UL-H UL-N UL-K Đối chứng Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được thực hiện tại Gram E. coli ++ ++ - ++ +++ - +++ BL19B2, SPring-8, Hyogo, Nhật Bản. (-) Pseudomonas aeruginosa - + - - + - +++ 2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét SEM Vibrio haveyi - - - - - - +++ Bacillus cereus - - - - ++ - +++ Ảnh SEM được chụp trên hệ thiết bị Nova NaNoSEM 450 – FEI Gram Streptococcus faecalis - - - - - +++ tại Khoa Vật lý - Trường ĐH KHTN – Đại học Quốc gia Hà Nội. Enterobacter cloace - ++ - + ++ - +++ (+) 2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên Staphylococcus aureus - - - - - - +++ - Dẫn xuất sulfate hóa: tổng hợp theo phương pháp của Lihong Fan và 3.1.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào CS. Xác định hàm lượng sulfate bằng phương pháp khối lượng Các mẫu ulvan chiết kiềm UL-K và UR-K không thể hiện hoạt - Dẫn xuất acetyl hóa: tổng hợp theo phương pháp của Xiao-xiao Liu tính này. và CS. Xác định hàm lượng acetyl của ulvan bằng phương pháp phân Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan tích thể tích theo Luis.A. % tế bào sống sót Nồng UR-H Nồng UR-N CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN độ độ (µg/ml) (µg/ml) Nồng Ellipticine 3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu HepG HeLa MCF- HepG HeLa MCF- độ 2 7 2 7 3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan (µg/m 100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00 l) M Kết quả thành phần hóa học của các ulvan ở Bảng 3.1 cho thấy, HepG HeLa CF 20 42,26 50,30 44,72 20 50,34 36,29 48,74 2 hàm lượng sulfate trong các mẫu ulvan thu được dao động ở khoảng -7 4 70,18 69,05 76,84 4 84,22 83,05 89,66 5,9 13-19%, hàm lượng uronic acid rất lớn nằm trong khoảng 18-23% 10 1,33 3,31 0,8 83,24 90,44 85,45 0,8 94,90 96,44 95,91 3 tính theo trọng lượng rong khô. Kết quả này cũng phù hợp với các IC50 49,10± 47,75± 50,69± IC50 31,31± 34,75 36,37± 28, nghiên cứu đã công bố trên các loài rong lục khác. 2 29,14 21,87 (µg/ml) 1,56 2,37 1,86 (µg/ml) 1,56 ±1,38 1,73 86
9 10 Nồng UL-H Nồng UL-N 3.2.1. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H) độ độ (µg/ml) (µg/ml) Phổ IR của UR-H có dải hấp thụ ở 848 cm 1 và 761 cm-1: liên kết HepG HeLa MCF- HepG HeLa MCF- 48, 2 7 2 7 0,4 49,42 48,89 58 C-O-S của nhóm sulfate ở vị trí axial và equatorial, tương ứng; băng 100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00 sóng hấp thụ tại 1624 cm 1: dao động của nhóm COO của acid -1 -1 20 50,21 55,34 48,67 20 60,67 66,24 58,71 76, uronic, 1078 cm : C-O-C của liên kết glycoside, 2927 cm : dao động 0,08 81,59 77,13 4 71,46 73,58 79,45 4 78,13 77,0 67,89 92 hóa trị của liên kết C-H, dải phổ rộng tại 3315 cm-1: dao động của 0,8 92,42 94,26 95,53 0,8 89,30 88,0 87,41 IC50 0,4 nhóm OH có liên kết hydro. 0,50 0,34 IC50 40,74± 44,25± 50,93± IC50 29,67± 36,33 25,09± (µg/m 5 Phân tích phổ 1H-NMR, vùng anomeric xuất hiện 3 tín hiệu ở (µg/ml) 2,21 2,32 1,67 (µg/ml) 2,87 ±3,84 1,36 l) δ5,30; δ4,65 và δ5,20 ppm được gán là A, B và C. Tín hiệu ở δ1,17 3.1.2.3. Hoạt tính chống oxy hóa ppm: proton của C-6 ứng với nhóm CH3 của rhamnose, tín hiệu ở Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan δ3,4-4,3 ppm là các proton của vòng pyranose. Trên phổ 13 C-NMR, Hoạt tính khử sắt (mg Hoạt tính chống oxy hóa tổng tín hiệu ở δ94–102 ppm là các carbon anomer, các carbon còn lại TT Mẫu Fe2+/g ulvan) số (mg AcidAscobic/g ulvan) trong vòng sẽ ở vùng δ72–80 ppm. Tín hiệu với δ17,0 ppm đặc trưng 1 UL-N 2,51 3,75 cho nhóm C-CH3 và tín hiệu điển hình cho nhóm carboxyl của uronic 2 UL-H 1,93 2,60 acid với δ167 ppm. Bốn tín hiệu ở δ63,39; 63,32; 63,12; 63,06 ppm là 3 UL-K 0,01 1,12 của nhóm CH2 (C-6) của galactose và/hoặc glucose và/hoặc CH2 (C- 4 UR-N 4,86 3,96 5) của xylose. 5 UR-H 1,34 2,56 Các proton từ H-1 đến H-6 của A được xác định từ phổ COSY, 6 UR-K 0,22 0,86 các carbon từ C-1 đến C-6 cũng lần lượt được gán dựa vào phổ HSQC (Hình 3.6). Tín hiệu ở vùng trường thấp của C-2 (δ79-80 ppm), C-3 Kết luận: Các mẫu được chọn cho mục đích nghiên cứu cấu trúc là: (δ75-77 ppm) và C-4 (δ74-76 ppm) chỉ ra rằng liên kết glycoside ở - Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (kí hiệu: UR-N) rhamnose của ulvan UR-H có thể là (12,3,4) và/hoặc nhóm sulfate - Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (kí hiệu: UR-H) ở vị trí C-2, C-3 và C-4. Kết quả này được khẳng định một lần nữa - Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (kí hiệu: UL-N) thông qua mối tương quan giữa H-1(A) và C-2(A), C-3(A), C-4(A) - Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (kí hiệu: UL-H) trên phổ HMBC (Hình 3.7). 3.2. Xác định cấu trúc của ulvan Đối với gốc B, proton anomer H-1 trên phổ 1H-NMR với δ4,65 Kết quả xác định khối lượng phân tử trung bình Mw và phân bố ppm, đây là giá trị cộng hưởng đặc trưng cho proton anomer H. Phân khối lượng phân tử Mw/Mn chỉ ra rằng, cũng giống như các sulfate tích phổ HSQC cho thấy: C-1(B) ở δ98,39 ppm và δ98,52 ppm có liên polysaccharide tự nhiên khác, ulvan là polymer có độ phân tán cao với hệ với H-1(B) tại δ4,65 ppm. Dựa vào tín hiệu của H-1(B), phổ COSY Mw/Mn có giá trị từ 2,19 đến 5,16 và khối lượng phân tử Mw từ và HSQC các tín hiệu tại δ3,2 ppm và δ3,8 ppm lần lượt được gán cho 4 5 8,1x10 g/mol đến 3,47x10 g/mol tùy theo điều kiện chiết tách. H-2(B) và C-3 (B) tương ứng. Tín hiệu C-2 của acid uronic bị đẩy về
11 12 vùng trường thấp, chứng tỏ C-2 là carbon tham gia liên kết glycoside Phổ ESI-MS của UR-H, xuất hiện disaccharide dạng - - (Bảng 3.8). [RhaUroASO3] biểu hiện qua peak ion mảnh [M-H] tại m/z 419. Các monosaccharide là monosulfate rhamnose [RhaSO3]- và acid uronic [UroA] cho các peak m/z 243 và m/z 195 tương ứng, peak có số khối m/z 503 là của ion mảnh [Rha3SO3]-. Peak có m/z 339 được gán cho ion mảnh [RhaUroA]- , ion mảnh tại m/z 401 là của [RhaUroASO3- H2O]-. Hình 3.6. Phổ HSQC của UR-H Hình 3.7. Phổ HMBC của UR-H Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-H Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 A 102-103 79-80 75-77 74-76 75-76 17-18 Hình 3.9. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 →2)--L-Rha /5,30 /3,63 / 3,95 /3,85 /3,65 /1,17 →4)--L-Rha Hình 3.9 là phổ ESI-MS/MS của ion mảnh ứng với m/z 243. Peak B 98,52; 77,0 74,0 74,0 - 167 →2)--D-GlcA 98,39 /3,20 /3,75 / 3,85 tại m/z 183 là của nhóm sulfate ở vị trí C-4 và mảnh với m/z 139 là /4,65 do nhóm sulfate tại vị trí C-2 của α-L-Rha. Một peak có cường độ C 94,70; 77,5 76,0 74,0 - 167 yếu tại tại m/z 169 là do ulvan bị sulfate hóa một phần tại vị trí số 3 →2)--L-IdoA 94,51 /3,60 /3,95 /3,85 /5,20 của rhamnose. Vậy, ulvan chiết acid (UR-H) có rhamnose bị Đối với gốc C, proton anomer H-1 trên phổ 1H-NMR ở δ5,2 ppm sulfate ở cả 3 vị trí: chủ yếu ở C-2 và C-4, một phần nhỏ ở C-3. Điều là điển hình cho H. Kết hợp các phổ 1D và 2D, gán được H-1(C) tại này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR δ5,2 ppm ứng với C-1(C) tại δ94,51 ppm và δ94,70 ppm. Tương tự và NMR ở trên. như vậy, lần lượt gán được H-2(C) ở δ3,6 ppm, và C-2(C) ở δ77 ppm. Kết hợp với việc phân tích phổ NMR ở trên, chúng tôi đưa ra cấu Tín hiệu của C-2 của acid uronic bị đẩy về vùng trường thấp chứng tỏ trúc mạch chính của ulvan chiết tách bằng dung môi acid từ rong lục C-2 là carbon tham gia liên kết glycoside, vậy liên kết glycoside của Ulva reticulata Việt Nam là [→2)--D-GlcA-(1→2)--L-Rha-(1→] C trong phân tử ulvan là kiểu liên kết (12) (Bảng 3.8). và [→2)--L-IdoA-(1→4)--L-Rha-(1→], phân nhánh ở vị trí C-2 của Như vậy, bằng kết quả phân tích phổ NMR, có thể kết luận rằng acid uronic và Rha bị sulfate hóa ở 3 vị trí C-2, C-3 và C-4. Đây là phân tử ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata được cấu thành một ulvan có cấu trúc mới vì các ulvan đã được công bố thì chưa bởi 2 loại disaccharide tạo thành chuỗi như sau: [→2)--D-GlcA- thấy xuất hiện liên kết (1→2) ở mạch chính. (1→2)--L-Rha-(1→] và [→2)--L-IdoA-(1→4)--L-Rha-(1→], 3.2.2. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N) phân nhánh ở vị trí C-2 của acid uronic và Rha bị sulfate hóa ở 3 vị trí Cấu trúc hóa học của mẫu ulvan chiết nước từ rong lục Ulva C-2, C-3 và C-4 (Bảng 3.8). reticulata cũng được nghiên cứu bằng các phương pháp phổ IR,
13 14 NMR, MS như mẫu UR-H ở trên. Phổ IR của UR-N cũng cho các dải 0,4-0,5 nm, điều này cho thấy UR-N có mạch nhánh tương đối dài, 1 1 1 hấp thụ điển hình của ulvan như: 1595cm , 1028cm , 844cm và giống như fucoidan chiết tách từ các loài rong nâu. Kết quả nghiên -1 783cm . Phân tích các thông tin thu được từ phổ NMR cho kết quả ở cứu về cấu trúc không gian cũng phù hợp với cấu trúc hóa học xác Bảng 3.9. định được theo các phương pháp phổ IR, NMR và ESI-MS ở trên là 1 13 Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ H và C-NMR của UR-N ulvan có cấu trúc mạch nhánh. Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 7x10 -3 Ulva reticulata Forsskål 1% -3 in water A 100,51/ 69,71/ 78,91/ 78,86/ 68,89/ 17,60/ 6 in 0.5 M NaCl aq Ulva reticulata Forsskål 1% in water, Rgc=1.35nm in 0.5 M NaCl aq, Rgc=1.37nm -4 →4)α-L-Rha3S 1→ 4,82 4,20 4,59 3,79 4,13 1,30 5 B 103,83/ 74,58/ 74,83/ 79,48/ 76,70/ -5 ln(qI(q)) 4 177,60 q I(q) 2 →2,4)β-D-GlcA 1→ 4,63 3,35 3,64 3,65 3,82 3 -6 - Phổ ESI-MS của UR-N xuất hiện peak mảnh [M-H] tại m/z 419 2 -7 1 - là của disaccharide dạng [RhaUroASO3] . Monosulfate rhamnose 0 -8 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 [RhaSO3]- và acid uronic [UroA]- cho các peak tại m/z 243 và m/z 195 q, nm -1 q 2 Hình 3.22. Kết quả đo SAXS từ dung dịch UR 1% nước và trong tương ứng. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh với m/z 243 có peak ion NaCl 0,5 M: biểu đồ Kratky và biểu đồ Guinier của mẫu UR-N mảnh với cường độ mạnh tại m/z 169 chỉ ra sự có mặt của nhóm Phương pháp SAXS không những cung cấp thông tin về cấu trúc sulfate ở vị trí C-3. Như vậy, UR-N có rhamnose bị sulfate ở C-3. không gian của phân tử mà còn giúp đưa ra các thông tin chi tiết hơn Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích về cấu trúc hóa học như độ dài mạch nhánh và sự phân bố của mạch phổ IR và NMR ở trên. nhánh trên mạch chính. Để làm được điều này, một mô hình phân tử Từ việc phân tích các phổ IR, NMR và MS, chúng tôi có thể kết của UR-N được xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học đã xác định bằng luận cấu trúc mạch chính của ulvan chiết nước từ rong lục Ulva các phương pháp phổ, sau đó, đường tán xạ tính toàn từ mô hình phân reticulata Việt Nam có dạng A3s [→4-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S- tử được so sánh (fitting) với đường tán xạ thực nghiệm nhận được từ (1→] và bị phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của acid glucuronic với phép đo SAXS. Kết quả cho thấy mô hình cấu trúc phân tử xây dựng nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha. với n = 5 và m =4 (Hình 3.24) thì biểu đồ tán xạ Kratky thu được từ Cấu trúc không gian của phân tử UR-N ở kích thước cỡ nano thực nghiệm SAXS và tính toán dựa trên mô hình cấu trúc phân tử có được nghiên cứu bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). độ trùng nhau (fitting) khá tốt (Hình 3.25). Các biểu đồ Kratky [Hình 3.22 bên trái] và Guinier [Hình 3.22 bên phải] của dung dịch 1% ulvan UR-N trong nước và trong NaCl 0,5M có dạng đặc trưng cho các phân tử có cấu trúc không gian dạng hình que (rod-like). Qua biểu đồ Kratky, cho thông tin về sự có mặt của các nhóm sulfate trong phân tử ulvan. Từ biểu đồ Guinier bán kính từ hồi chuyển của UR-N được xác Hình 3.24. Mô hình cấu trúc phân tử của UR-N xây dựng dựa trên định là Rgc = 1,35-1,37 nm, đối với các polysaccharide mạch thẳng cấu trúc hóa học không phân nhánh như carrageenan hay heparin thì giá trị Rgc khoảng
15 16 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-N Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 A 100,27/ 77,92 73,82/ 71,87/ 61,20/ - →2)-α-D-Xyl-(1→ 5,36 3,65 3,95 3,82 3,80; 3,88 B 89,65; 79,21/ 71,74/ 76,88/ 68,40/ 17,12/ →2,4)-α-L-Rha-(1→ 101,50/ 4,06  3,71  3,82  4,0 1,31 4,90 C 100,40/ 69,46/ 78,68/ 78,68/ 68,65/ 17,35/ →4)-α-L-Rha3S-(1→ 4,82 4,23 4,61 3,80 4,13 1,31 D 103,65/ 74,40/ 74,58/ 79,40/ 76,88/ 177,76 Hình 3.25. Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm và từ →4)-β-D-GlcA-(1→ 4,64 3,35 3,65 3,68 3,81 mô hình cấu trúc phân tử. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm: 1H và 3.2.3. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N) 13 C-NMR, COSY, HSQC, HMBC của ulvan UL-N được tóm tắt ở Phân tích phổ IR của UL-N, cung cấp những thông tin về sự có Bảng 4.10. 1 -1 1 mặt của nhóm sulfate ở 845 cm và 789 cm , dao động ở 1599 cm Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh với m/z 243 thấy có hai peak ứng - là của nhóm COO của acid uronic trong phân tử ulvan, dải hấp thụ ở với m/z 183 và m/z 169 là đặc trưng cho sự có mặt của nhóm sulfate ở 1 1026 cm là đặc trưng cho liên kết glycoside C-O-C. vị trí carbon C-4 và C-3 của α-L-Rha tương ứng. [UroA]- [RhaSO 3] - - [XylUroA] [XylRhaSO 3 ]- - [UroARhaSO 3] [RhaUroA]- - [Rha 3SO 3] Hình 3.32. Phổ ESI-MS của ulvan UL-N Hình 3.33. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 Hình 3.30. Phổ HSQC của UL-N Kết quả từ việc phân tích phổ IR, NMR và MS có thể khẳng định rằng, ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca có cấu trúc mạch chính chủ yếu là disaccharide dạng [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L- Rha3S-(1→] và phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của rhamnose. Ngoài ra, trong phân tử ulvan còn có lượng nhỏ disaccharide ở dạng liên kết GlcA-(12)-Xyl, GlcA-(12)-Rha. Như vậy, ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca Việt Nam mà chúng tôi nghiên cứu có cấu trúc hóa học giống với các kết quả nghiên cứu trước ở mạch chính nhưng Hình 3.31. Phổ HMBC của UL-N khác nhau ở mạch nhánh và đa dạng ở mạch phụ.
17 18 3.2.4. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H) Phổ IR của UL-H có những dao động đặc trưng của ulvan với tín hiệu ở 850 cm 1 và 786 cm-1 là dao động của liên kết C-O-S của nhóm 1 sulfate ở vị trí axial và equatorial, tương ứng. Dải hấp thụ ở 1014 cm 1 đặc trưng cho liên kết C-O chứa O-H. Tín hiệu dao động ở 1599 cm là do dao động của nhóm COO của acid uronic. Từ những kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ NMR bao gồm: 1 H và 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC của ulvan UL-N (Bảng 3.11), chúng tôi có thể kết luận rằng ulvan chiết acid từ rong lục Ulva Hình 3.39. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 lactuca có cấu trúc tạo thành từ disaccharide, tạo thành chuỗi [→4)-β- Trên phổ ESI-MS của ulvan xuất hiện mảnh khối của disaccharide D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí C-3 của [RhaUroASO3]- tại m/z 419. Các monosaccharide là monosulfate rhamnose. So sánh với các nghiên cứu trước đây về ulvan từ rong lục rhamnose [RhaSO3]- và acid uronic [UroA] cho các peak m/z 243 và Ulva lactuca cho thấy bằng các phương pháp chiết tách khác nhau, m/z 195 tương ứng. Phổ ESI-MS/MS của disaccharide với m/z 243 các ulvan thu được đều có thành phần mạch chính giống nhau, chúng được đưa ra ở Hình 3.35, trên phổ, có peak ion mảnh với cường độ chỉ khác nhau ở mạch nhánh. mạnh tại m/z 169 là của nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha. Một paek có cường độ yếu tại tại m/z 139 là do ulvan bị sulfate hóa một phần tại vị trí số 2 của rhamnose. Như vậy, UL-H có rhamnose bị sulfate ở cả 2 vị trí: chủ yếu ở vị trí carbon C-3 một phần nhỏ ở vị trí carbon C-2. Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR và NMR ở trên. Vậy UL-H có cấu trúc chuỗi disaccharide chủ yếu dạng [→4)β-D- Hình 3.37. Phổ HSQC của UL-H Hình 3.38. Phổ HMBC của UL-H GlcA-(1→4)α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí C-3 của rhamnose. Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-H 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 hoạt tính sinh học của ulvan D 102,45/ 71,62/ 80,80/ 80,70/ 70,79/ ~19,56/ Các nghiên cứu trước cho thấy nhóm sulfate là yếu tố cấu trúc có 4)-L-Rha3S 1 4,82 4,22 4,58 3,78 4,11 ~1,3 ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học của sulfate polysaccharide nhất E 105,69/ 76,44/ 76,72/ 81,52/ 78,49/ là hoạt tính chống đông tụ máu. Mặt khác, sự acetyl hóa có thể làm 1)-D-GlcA 4 4,65 3,35 3,60 3,65 3,86 tăng hoạt tính chống oxi hóa hoặc kháng vi sinh vật kiểm định của D’ ~103,6/ 71,62/ 81,34/ ~74,10/ ~73,2/ ~19,48/ chúng. Nhằm mục đích tìm hiểu sự thay đổi cấu trúc cũng như hoạt 1)-L-Rha 3(4) 4,89 4,22 4,05 3,86 3,71 ~1,29 tính sinh học của ulvan khi chúng bị sulfate hóa hoặc acetyl hóa
19 20 chúng tôi đã điều chế các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa của mẫu Đánh giá mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính chống đông tụ máu ulvan tự nhiên, ở đây cụ thể là mẫu UR-N. Chúng tôi thử 4 hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng vi 3.3.1. Ảnh hưởng của sự sulfate hóa sinh vật kiểm định và chống đông tụ máu của mẫu UR-S giống như đã 13 Phổ IR và C- và HSQC - NMR được sử dụng để kiểm tra sự thử với mẫu UR-N. Kết quả cho thấy không có sự thay đổi đáng kể thay đổi trong cấu trúc của mẫu sulfate hóa UR-S. của 3 hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm Kết quả phân tích phổ của mẫu UR-S cho thấy, ở phổ IR có sự định còn hoạt tính chống đông tụ máu thì tăng lên đáng kể. -1 tăng cường độ hấp thụ của tín hiệu tại ~850 cm đặc trưng cho nhóm Với mục đích tìm hiểu ảnh hưởng của mức độ sulfate hóa đến sulfate ở vị trí axial, đồng thời có sự giảm cường độ hấp thụ của tín hoạt tính chống đông tụ máu, các dẫn xuất UR-S với mức độ sulfate -1 hiệu tại ~3261-3370 cm là đặc trưng cho dao động của nhóm OH; Ở hóa khác nhau đã được điều chế và được tiến hành đánh giá hoạt tính 13 phổ C-NMR xuất hiện tín hiệu mới ở δ77,2 ppm là carbon C-2 của chống đông tụ máu như được chỉ ra trong phần Thực nghiệm. Kết quả rhamnose, chứng tỏ mẫu UR-S bị sulfate hóa tại vị trí C-2 của thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và UR-S với các mức độ rhamnose; Phổ HSQC của UR-S xuất hiện một số tín hiệu mới và dịch sulfate hóa khác nhau được đưa ra trên Bảng 3.12, thuốc được dùng chuyển về phía trường thấp hơn so với phổ HSQC của UR-N (Hình làm chất đối chứng là Aspirin. 3.42), tín hiệu tương tác C-1/H-1 của rhamnose bị tách ra; đồng thời Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và UR-S có hai tín hiệu mới xuất hiện, thể hiện sự tương tác giữa C-2/H2 với δ80,0/3,38 ppm và C-3/H3 ở δ76,5/3,67 ppm của glucuronic acid, C-2 Tên mẫu UR-N UR-S1 UR-S2 UR-S3 UR-S4 UR-S5 Aspirin của rhamnose có cường độ tín hiệu tăng lên. Vậy cả 3 vị trí gồm DS (%) 17,60 21,25 25,68 30,42 33,21 35,96 carbon C-2 của rhamnose và carbon C-2, C-3 của glucuronic acid đã Thời gian đông 10 25 40 45 30 37 48 bị sulfate hóa một phần. Như vậy, kết quả phân tích phổ NMR cũng tụ máu (phút) phù hợp với kết quả phổ IR ở trên và các nghiên cứu trước. Kết quả Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và các dẫn phân tích phổ khẳng định sự tăng mức độ sulfate hóa của mẫu UR-S. xuất sulfate hóa của nó cho thấy, khả năng chống đông tụ máu của Dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM), có sự khác nhau rất rõ ràng mẫu ulvan sulfate tăng lên đáng kể so với ulvan tự nhiên, tuy nhiên ở cấu trúc bề mặt giữa mẫu UR-N và UR-S. Các phân tử UR-N tạo chúng tôi không thấy có sự phụ thuộc có quy luật của khả năng chống thành khối có cấu trúc bề mặt phẳng trong khi UR-S dường như tạo đông tụ máu vào hàm lượng sulfate. Kết quả này có thể giải thích thành các khối tinh thể nhỏ có hình dạng xác định. rằng, còn có những yếu tố khác liên quan đến khả năng chống đông tụ máu của ulvan như khối lượng phân tử, vị trí nhóm sulfate…Các nghiên cứu trước đã chỉ ra rằng hoạt tính chống đông tụ máu của polysaccharide tăng lên khi sulfate hóa là do có sự tăng nhóm mang điện tích âm và nhóm này có thể liên kết với nhóm mang điện tích dương của chất ức chế đông tụ máu và do đó làm tăng hoạt tính chống đông tụ máu. Hình 3.42. Phổ HSQC của UR-N (a) và UR-S (b)
21 22 3.3.2. Ảnh hưởng của sự acetyl hóa KẾT LUẬN Sự thay đổi cấu trúc của UR-N sau khi acetyl hóa được kiểm tra bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả như sau: 1. Đã chiết tách 6 mẫu ulvan từ 2 loài rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata thu thập ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa bằng 3 quy trình chiết tách sử dụng dung môi acid, kiềm và nước; Đã xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Kết quả cho thấy thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của ulvan rất khác nhau phụ thuộc quy trình chiết tách, ulvan chiết bằng nước có hàm lượng sulfate, acid uronic và rhamnose cao nhất cũng cho hoạt tính sinh học tốt nhất. 2. Bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý GPC, IR, NMR và MS đã nghiên cứu thành công cấu trúc hóa học của 4 mẫu ulvan chiết tách được, cụ thể như sau: Hình 3.44. Phổ 1H-NMR a) và 13C-NMR b) của UR-Ac - Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata Phổ 1H- NMR và 13C-NMR của UR-Ac được đưa ra ở Hình 3.44, ta thấy trên phổ 1H-NMR của UR-Ac xuất hiện peak mới ở độ chuyển dịch hóa học δ2,007 ppm và phổ 13C-NMR có peak tại δ22,5 ppm, thể hiện sự có mặt của nhóm acetyl O-CH3. Như vậy, bằng phổ NMR, chúng tôi khẳng định mẫu UR-N đã bị acetyl hóa. Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-2, C-3 và C-4 của Rha. Ảnh SEM cũng thể hiện sự khác nhau rất rõ ràng ở cấu trúc bề Đây là một ulvan có cấu trúc mới, vì đa số các ulvan chỉ có liên mặt giữa mẫu UR-N và UR-Ac. Cấu trúc bề mặt như các tấm phẳng kết 1→4 ở mạch chính, trong khi ulvan này tồn tại liên kết 1→2 của UR-N trở nên xốp hơn với nhiều các lỗ và hốc rỗng lớn. ở mạch chính. Đánh giá mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính chống oxy hóa: - Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata Chúng tôi thử 4 hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định và chống đông tụ máu của mẫu UR-Ac giống như đã thử với mầu UR-N. Kết quả cho thấy không có sự thay ðổi Nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha. ðáng kể của cả 4 hoạt tính này. Điều này có thể được lý giải rằng khi - Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca bị acetyl hóa, ulvan được gắn thêm nhóm acetyl là nhóm không ưa nước, làm phân tử ulvan khó tan trong nước hơn và do vậy không thuận lợi cho các phản ứng sinh hóa xảy ra.
23 24 Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 của Rha. KIẾN NGHỊ - Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca 1. Cấu trúc hóa học của ulvan nói riêng và polysaccharide nói chung là rất phức tạp, hơn nữa rõ ràng là có mối liên hệ giữa cấu trúc của ulvan và hoạt tính sinh học của chúng, nhưng cho đến nay mối quan hệ này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Đây là những vấn đề nghiên cứu rất cơ bản, hấp dẫn không chỉ đối với Việt Nam Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 và C-4 của Rha. mà còn ở cả trên thế giới nên cần được tiếp tục nghiên cứu trong Các kết quả nghiên cứu một lần nữa cho phép khẳng định sự phụ thời gian tới. thuộc cấu trúc của ulvan vào vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và 2. Ngoài chi Ulva, ở Việt Nam còn có các chi rong lục khác có các phương pháp chiết tách chúng từ rong. đặc điểm cấu trúc riêng biệt với các hoạt tính sinh học phong phú 3. Bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS đã xác định khác cần tiếp tục được nghiên cứu để có thể sử dụng nguồn ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata UR-N có cấu trúc rong biển một cách hiệu quả nhất. không gian dạng hình que với mạch nhánh dài. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4. Đã xây dựng được mô hình phân tử của UR-N dựa trên cấu 1. Đã sử dụng kết hợp các phương pháp vật lý hiện đại trong nghiên trúc hóa học. Bằng cách so sánh đường tán xạ tính toán từ mô cứu cấu trúc của polymer bao gồm GPC, phổ IR, NMR, ESI-MS, hình cấu trúc phân tử với thực nghiệm của phép đo SAXS, cấu tán xạ tia X góc nhỏ SAXS để nghiên cứu cấu trúc bao gồm cấu trúc hóa học của UR-N đã được khẳng định. Đây là một trúc hóa học và cấu trúc không gian của sulfate polysaccharide từ phương pháp góp phần giải quyết khó khăn trong việc nghiên cứu rong lục thu thập ở vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa của Việt các polymer tự nhiên có cấu trúc phức tạp. Nam. 5. Đã khảo sát ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc 2. Đã phát hiện được một dạng cấu trúc mới của ulvan so với các bề mặt và hoạt tính sinh học của ulvan chiết nước từ rong lục nghiên cứu đã công bố trên thế giới. Ulva reticulata. Kết quả cho thấy: 3. Đã xây dựng được mô hình cấu trúc phân tử của ulvan dựa trên  Sự sulfate hóa làm thay đổi cấu trúc bề mặt của ulvan và cấu trúc hóa học và so sánh đường tán xạ tính toán từ mô hình cấu không làm tăng hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống oxy trúc phân tử với thực nghiệm của phép đo SAXS để khẳng định hóa và kháng vi sinh vật kiểm định nhưng làm tăng đáng kể lại cấu trúc hóa học. Đây là một phương pháp góp phần giải quyết hoạt tính chống đông tụ máu và sự tăng này không tỷ lệ với khó khăn trong việc nghiên cứu các polymer tự nhiên có cấu trúc mức độ sulfate hóa. phức tạp.  Sự acetyl hóa làm ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc bề mặt 4. Bước đầu nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc- hoạt tính của ulvan. nhưng không làm tăng các hoạt tính sinh học đã thử nghiệm Đây là hướng nghiên cứu mới so với các nghiên cứu cùng lĩnh của ulvan. vực ở trong nước.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Q.T.M Thu, Đ.V Lương, T.T.T Vân, B.M Lý và T.T.T Thủy (2014). Ulvan từ rong lục ulva reticulata: chiết tách, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Tạp chí Hóa học, 52 (6A), 158-162. 2. Q.T.M Thu, N.T Nu, Đ.V Luong, B.M Ly, T.T.T Van and T.T.T Thuy (2015). Structural characterization of ulvan from green seaweed Ulva reticulata. Vietnam Journal of Chemistry, 53 (6e1,2), 386-390. 3. Q.T.M Thu, T.H Bang, N.T Nu, Đ.V Luong, B.M Ly, T.T.T Van and T.T.T Thuy (2015). Structural Determination of Ulvan from Green Seaweed Ulva reticulata Collected at Central Coast of Vietnam. Chemistry Letters, 44 (6), 788-790. 4. T.T.T Thuy, Q.T.M Thu, T.T.T Van, D.V Luong and N.T Tai (2015). Ulvan from green seaweed Ulva reticulata: Extraction and structure. The 13th Japan – Vietnam Joint Seminar, 29-30 October 2015 Kyoto, Japan, 23. 5. T.T.T Thuy, T.M.T Quach, T.N Nguyen, D.Vu Luong, B.M Ly and T.T.V Tran (2016). Structure and cytotoxic activity of ulvan extracted from green seaweed Ulva lactuca. International Journal of Biological Macromolecules 93, 695-703. 6. T.T.T Thuy, Q.T.M Thu, N.T Nu, D.V Luong, N.T Tai, T.T.T Van (2016). Structure and biological activity of sulfated polysaccharide extracted from green seaweed Ulva lactuca. The 14th Japan-Vietnam Joint Seminar, Hanoi 22th September 2016, 21. 7. Q.T.M Thu, N.T Nụ, Đ.V Lương, N.T Tài, T.H Bằng, T.T.T Vân, H.Đ Cường, T.T.T Thủy (2016). Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của ulvan chiết tách từ rong lục Ulva lactuca. Tạp chí Hóa học, 54 (6e2), 75-78. 8. Q.T.M Thu, Đ.V Luong, N.T Nu, T.T.T Van, B.M Ly and T.T.T Thuy (2016). Effect of sulfation on the structure and anticoagulant activity of ulvan extracted from green seaweed Ulva reticulata. Vietnam Journal of Science and Technology, 54 (2C), 373-379. 9. Thanh T T T, Quach T M T, Nguyen T N, Dang V L, Tran T T V, Bui M L (2017). Structure and cytotoxicity of the green seaweed originated ulvan. The 17th Asian Chemical Congress, 23-28 July 2017 Melbourne Australia, 332. 10. T.T.V Tran, H.B Truong, N.H.V Tran, T.M.T Quach, T.N Nguyen, M.L Bui, Yoshiaki Yuguchi & T.T.T Thanh (2017). Structure, conformation in aqueous solution and antimicrobial activity of ulvan extracted from green seaweed Ulva reticulata. Natural Product Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1408098.