Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của 3 loài ngoại mộc tái (allophylus livescens gagnep.), cày ri ta Hạ Long (chirita halongensis kiew& t.h.nguyen) và An Điền lá thông [oldenlandia pinifolia (wall. ex g.don) kuntze] của Việt Nam

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu thành phần hoá học của ba loài Allophylus livescens Gagnep, Chirita halongensis Kiew & T. H. Nguyen và Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze ở Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của 3 loài ngoại mộc tái (allophylus livescens gagnep.), cày ri ta Hạ Long (chirita halongensis kiew& t.h.nguyen) và An Điền lá thông [oldenlandia pinifolia (wall. ex g.don) kuntze] của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------------------------- KHIẾU THỊ TÂM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA 3 LOÀI NGOẠI MỘC TÁI (ALLOPHYLUS LIVESCENS GAGNEP.), CÀY RI TA HẠ LONG (CHIRITA HALONGENSIS KIEW& T.H.NGUYEN) VÀ AN ĐIỀN LÁ THÔNG [OLDENLANDIA PINIFOLIA (WALL. EX G.DON) KUNTZE] CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2018
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. TRẦN VĂN LỘC Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ngày nay, kinh tế càng phát triển thì nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của cộng đồng càng trở nên cấp thiết. Do đó, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y đặc biệt là bệnh ung thư ngày càng cao. Hiện nay, một trong những hướng nghiên cứu thu hút các nhà khoa học để tìm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị ung thư là đi từ các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên. Các nhà khoa học vẫn đang cố gắng tìm hiểu, khám phá tác dụng chống ung thư và các hoạt tính sinh học khác của các hợp chất được phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau. Việt Nam có nguồn thực vật phong phú và đa dạng với khoảng 12.000 loài trong đó đã điều tra có gần 3.900 loài được sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ. Song bản chất hóa học của chúng cũng như mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý thì mới được biết rất ít hoặc chưa biết. Do đó, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thực vật nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính có giá trị là rất cần thiết. Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.), Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongenis Kiew & T. H. Nguyen) là hai loài thực vật đặc hữu của Vịnh Hạ Long, chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze] có tác dụng thanh nhiệt, giảm đau và chữa vết thương, tuy nhiên cho đến nay chỉ có một thông báo kết quả ban đầu về thành phần hóa học và chưa có nghiên cứu nào về hoạt tính sinh học của loài này. Để đóng góp vào việc tìm hiểu, nghiên cứu, đánh giá, góp phần bảo tồn những loài thực vật quý hiếm, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của ba loài: Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.), Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongenis Kiew & T. H. Nguyen) và An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze] của Việt Nam. 2. Mục tiêu của luận án Nghiên cứu thành phần hoá học của ba loài Allophylus livescens Gagnep, Chirita halongensis Kiew & T. H. Nguyen và Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze ở Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. 3. Nội dung luận án bao gồm - Phân lập các hợp chất từ ba loài Allophylus livescens, Chirita halongensis và Oldenlandia pinifolia ở Việt Nam bằng phương pháp sắc ký cột. - Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ MS, 1D-NMR, 2D-NMR. - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các hợp chất phân lập được.
2 4. Những đóng góp mới của luận án - Đây là lần đầu tiên loài Ngoại mộc tái và Cày ri ta Hạ long được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Hai hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol và catechin lần đầu tiên được phân lập từ chi Allophylus. Ba hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Chirita là oleanolic acid, decaffeoylacetoside and β-hydroxy acteoside. - Đây là lần đầu tiên cây An điền lá thông được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ở Việt Nam và trên thế giới. Trong số 14 hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc hóa học trong đó có 1 hợp chất mới là 1,4,6-trihydroxy-2- methyl anthraquinone và hai hợp chất (lutein và afzelin) lần đầu tiên được phân lập từ chi này.Cao chiết n-butanol và 4 hợp chất phân lập từ cao chiết này ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu K562, gây apoptosis và có khả năng kích hoạt caspase 3 (p
3 1.3. Tổng quan về chi Oldenlandia 1.3.1. Giới thiệu thực vật về chi Oldenlandia 1.3.2. Ứng dụng của chi Oldenlandia trong y học cổ truyền 1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Oldenlandia 1.3.4. Tình hình nghiên cứu cây An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia) Cây An điền lá thông có tên khoa học là Oldenlandia pinifolia (Wall. Ex G. Don) Kuntze, tên đồng nghĩa là Hedyotis pinifolia Wall. Ex G. Don. Theo tra cứu tài liệu, trên thế giới chưa có công bố nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Oldenlandia pinifolia. Ở Việt Nam, có duy nhất một bài báo công bố về thành phần hóa học của O. pinifolia của nhóm tác giả Lê Hoàng Duy. Việc nghiên cứu loài này sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học và định hướng nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. 1.4. Hợp chất iridoid 1.4.1. Giới thiệu chung về hợp chất iridoid 1.4.2. Phân loại các hợp chất iridoid 1.4.3. Hoạt tính sinh học các iridoid CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thu hái mẫu thực vật và xác định tên khoa học - Mẫu cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.), được thu hái tại Hạ Long vào tháng 04/2013 do TS Trần Thị Phương Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST xác định tên khoa học. Mẫu tiêu bản số VHH.HL 4.2013.1 được lưu giữ tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Mẫu Cày ri Hạ long (Chirita halongensis Kiew & T.H.Nguyen) được thu hái tại các hòn đảo của vịnh Hạ Long, tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam vào tháng 10 năm 2013. Tên khoa học do TS.Trần Thị Phương Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST xác định. Tiêu bản số VHH.HL 10.2013.2được lưu giữ tại Viện Hóa học, VAST. - Mẫu An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia Wall. Ex G. Don) được thu hái tại Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 10 năm 2014. Tên khoa học do TS. Đỗ Xuân Cẩm, Đại học Huế xác định. Tiêu bản số VHH.TTH 10.2014.1được lưu giữ tại Viện Hóa học, VAST. 2.2. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu Mẫu lá và cành cây Ngoại mộc tái, An điền lá thông, Cày ri Hạ long được ngâm chiết theo quy trình chung 2.3. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật Việc phân tích, phân tách các dịch chiết của cây được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau 2.4. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập đƣợc Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại.
4 2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 2.5.1. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào Sử dụng phương pháp MTT assay 2.5.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính cảm ứng apoptosis Khả năng gây apoptosis của hoạt chất được xác định thông qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 và phương pháp nhuộm nuclei bằng propidium iodide và phân tích tế bào theo dòng chảy. CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Tách chiết, phân lập các chất từ cây Ngoại mộc tái 3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Hình 3.1. Sơ đồ chiết và phân lập các chất từ cây Ngoại mộc tái 3.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái 3.1.2.1. Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) Chất dạng dầu, Rf = 0,48 (n-hexane:CH2Cl2 95/5, v/v). ESI-MS, m/z = 291 [M+H]+,1H-NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 5,21 (d, 17,5, H-1); 5,05 (d, 11,0, H-1); 5,91 (dd, 10,5 & 17,5; H-2); 1,55 (m, H-4); 1,95 – 2,09 (m, H-5); 5,14 (t, 7,0; H-6); 1,95 – 2,09 (m, H-8, H-9, H-12, H-13); 5,11 (t, 6,5; H-10); 5,11 (t, 6,5, H-14); 1,68 (s, H-16); 1,59 (s, H-17); 1,27 (s, H-18); 1,60 (s, H-19, H-20). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm), 111,6 (C-1); 145,1 (C-2); 73,4 (C-3); 42,1 (C-4); 22,7 (C-5); 124,4 (C-6); 135,5 (C-7); 39,7 (C-8); 26,5 (C-9); 124,1 (C-10); 135,0 (C-11); 39,7 (C-12); 26,7 (C-13); 124,2 (C-14); 131,2 (C-15); 25,6 (C-16); 17,6 (C-17);, 27,8 (C-18); 16,0 (C-19, C-20). 3.1.2.2. Hợp chất catechin (AL2)
5 Chất bột màu cam, Rf = 0,56 (CHCl3:MeOH:H2O 6,5:3,5:0,5, v/v). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 4,60 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2); 4,00 (1H, m, H-3); 2,53 (1H, dd, J = 16,0; 8,1 Hz, H-4a); 2,87 (1H, dd, J = 16,0; 8,1 Hz, H-4b); 5,88 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-6); 5,96 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8); 6,86 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2’); 6,79 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-5’); 6,74 (1H, dd, J = 8,1; 1,9 Hz, H-6’). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 82,79 (C-2); 68,77 (C-3); 28,5 (C-4); 156,9 (C-5); 95,5 (C-6); 157,5 (C-7); 96,3 (C-8); 157,8 (C-9); 100,8 (C- 10); 132,2 (C-1’); 115,3 (C-2’);146,2 (C-3’); 146,2 (C-4’); 116,1 (C-5’); 120,0 (C-6’). 3.1.2.3. Chất stigmasterol(AL3) Tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,55 (n-hexane:EtOAc 3:1, v/v).1H- NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 3,51 (m, H-3); 5,34 (m, H-5); 0,92 (d, 6,5 Hz, CH3-19); 5,01 (dd, 8,5; 15,0 Hz, H-20); 5,15 (dd, 8,5; 15,0 Hz, H-21); 0,84 (t, 7,2 Hz, CH3-24); 0,83 (d, 6,5 Hz, CH3-26), 0,80 (d, 6,6 Hz, CH3-27), 0,70 (s, CH3-28), 1,03 (s, CH3-29). 3.1.2.4. Hợp chất -sitosterol(AL4) Chất hình kim màu trắng, Rf = 0,55 (n-hexane:EtOAc 3/1, v/v).1H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 3,51 (m, H-3); 5,34 (m, H-5); 0,92 (d, 6,5 Hz, CH3-19); 0,85 (t, 7,2 Hz, CH3-24); 0,83 (d, 6,5 Hz, CH3-26); 0,81 (d, 6,6 Hz, CH3-27); 0,68 (s, CH3-28); 1,02 (s, CH3-29). 3.1.2.5. Hợp chất -sitosterol glucoside (AL5) Tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,45 (CH2Cl2:MeOH 9:1, v/v) 3.1.3. Hoạt tính sinh học của cây Ngoại mộc tái 3.2. Tách chiết, phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long 3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Hình 3.2. Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long
6 3.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây Cày ri Hạ long 3.2.2.1. Hợp chất 7-hydroxytectoquinone (CH1): Tinh thể màu vàng, Rf = 0,30 (CH2Cl2:MeOH 4,8:0,2, v/v).1H NMR (500MHz, CD3OD): H(ppm) 8,07 (brs, H-1); 7,68 (dd, 1,0 & 8,0 Hz, H-3); 8,16 (d, 8,0 Hz; H-4); 8,17 (d, 8,5 Hz, H-5); 7,21 (dd, 2,5 & 8,5 Hz, H-6); 7,59 (d, 2,5 Hz, H-8); 2,54 (s, 2-CH3).13C NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm) 128,2 (C-1); 146,3 (C-2); 136,1 (C-3); 128,2 (C-4); 132,8 (C-4a); 130,9 (C-5); 122,3 (C-6); 164,7 (C-7); 113,5 (C-8); 137,1 (C-8a); 184,6 (C-9); 134,9 (C-9a); 183,3 (C-10); 127,2 (C-10a); 21,8 (2-Me). 3.2.2.2. Hợp chất 3,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2) Chất bột màu trắng, Rf = 0,3 (n-hexane:EtOAc=1:1).(-)-ESI-MS m/z: 471,0[M-H]-, công thức phân tử: C30H48O4. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & CD3OD): H (ppm) 3,83 (br s, H-3); 2,19 (d, 11,0 Hz, H-18); 3,70 (d, 11,0 Hz, Ha-24); 3,46 (d, 11,0 Hz, Hb-24). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C(ppm) 34,4 (C-1); 24,5 (C-2); 71,3 (C-3), 44,0 (C-4); 50,6 (C-5); 19,5 (C-6); 34,6 (C-7); 40,9 (C-8); 48,8 (C-9, C-17); 37,9 (C-10); 25,3 (C-11); 126,9 (C-12); 139,6 (C- 13); 43,3 (C-14); 29,2 (C-15); 26,1 (C-16); 54,39 (C-18); 40,5 (C-19); 40,4 (C- 20); 30,7 (C-21); 38,1 (C-22); 22,8 (C-23); 66,32 (C-24); 16,3 (C-25); 17,6 (C- 26); 24,1 (C-27); 181,63 (C-28); 17,67 (C-29); 21,57 (C-30). 3.2.2.3. Hợp chất acid ursolic (CH3) Chất bột màu trắng, Rf = 0,5 (CH2Cl2:MeOH 94:6, v/v).(-)-ESI-MS m/z: 455,2 [M-H]-, công thức phân tử: C30H48O3. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 2,98 (m, H-3), 5,11 (m, H-12); 2,09 (d, 11,3 Hz, H-18); 0,88 (s, Me-23); 0,66 (s, Me-24); 0,85 (s, Me-25); 0,73 (s, Me-26); 1,02 (s, Me-27); 0,79 (d, 6,4 Hz, Me-29); 0,89 (d, 8,7 Hz, Me-30). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): C (ppm) 38,2 (C-1); 26,9 (C-2); 76,9 (C-3); 38,4 (C-4); 54,8 (C-5); 18,0 (C-6); 30,19 (C- 7); 39,1 (C-8); 47,0 (C-9); 36,5 (C-10); 23,81 (C-11); 124,6 (C-12); 138,2 (C-13); 41,6 (C-14); 32,7 (C-15); 22,8 (C-16); 46,83 (C-17); 52,4 (C-18); 38,4 (C-19); 38,5 (C-20); 27,5 (C-21); 36,3 (C-22), 28,3 (C-23); 16,9 (C-24); 16,1 (C-25), 15,2 (C-26); 23,3 (C-27); 178,3 (C-28); 17,0 (C-29); 21,1 (C-30). 3.2.2.4. Hợp chất oleanolic acid (CH4) Chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2:MeOH 94:6, v/v).(-)-ESI-MS m/z: 455,2 [M-H]-, công thức phân tử: C30H48O3. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 5,27 (1H, t, 3,5 Hz, H-12); 3,20 (1H, dd, 4,0; 11,0 Hz, H-3); 2,81 (1H, dd, 4,0; 13,5 Hz, H-18); 1,12; 0,97; 0,91; 0,90; 0,89; 0,76; 0,74 (mỗi tín hiệu 3H, s, Me-23, 24, 25, 26, 27, 29, 30). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): C (ppm) 38,4 (C- 1); 27,7 (C-2); 79,1 (C-3); 38,8 (C-4), 55,3 (C-5); 18,3 (C-6); 32,7 (C-7); 39,3 (C-8); 47,7 (C-9); 37,1 (C-10); 23,0 (C-11); 122,7 (C-12); 143,6 (C-13); 41,7 (C- 14); 27,2 (C-15); 23,4 (C-16); 46,5 (C-17); 41,1 (C-18); 45,9 (C-19); 30,7 (C- 20); 33,8 (C-21); 32,5 (C-22); 28,1 (C-23); 15,6 (C-24); 15,3 (C-25); 17,1 (C- 26); 25,9 (C-27); 181,6 (C-28); 33,1 (C-29); 23,6 (C-30). 3.2.2.5. Hợp chất 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl--D-glucopyranoside (CH5)
7 Chất bột màu vàng nhạt, Rf =0,3 (EtOAc:MeOH:H2O = 4:0,5:0,1).ESI-MS m/z: 315,0 [M-H]-, công thức phân tử C14H20O8.1H NMR (500MHz, CD3OD): H (ppm) 6,71 (d, 1,5 Hz, H-2); 6,69 (d, 8,5 Hz, H-5); 6,57 (dd, 1,5 & 8,5 Hz, H-6); 2,80 (m, H-7); 3,72 (m, H-8); 4,05 (m, H-8); 4,31 (d, 8,0 Hz, Glc-1); 3,20 (t, 8,0 Hz, Glc-2); 3,28 – 3,39 (m, Glc-3, 4, 5); 3,68 (dd, 5,0 & 12,0 Hz, Glc-6); 3,88 (dd, 1,5 & 12,0 Hz, Glc-6). 13C-NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm)131,6 (C-1); 117,1 (C-2); 146,1 (C-3); 144,6 (C-4); 116,3 (C-5); 121,3 (C-6); 36,6 (C- 7); 72,1 (C-8); 104,4 (Glc-1); 75,1 (Glc-2); 77,9 (Glc-3); 71,6 (Glc-4); 78,1 (Glc-5); 62,7 (Glc-6). 3.2.2.6. Hợp chất acteoside (CH6) Chất bột màu trắng, Rf =0,56 (CH2Cl2:MeOH:H2O = 3,75:1,0:0,1). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 6,73 (d, 2,0 Hz, H-2); 6,71 (d, 8,0 Hz, H- 5); 6,58 (dd, 2,0; 8,5 Hz, H-6); 3,75 (m, H-8); 4,06 (m, H-8); 2,81 (m, H-7);, 7,09 (d, J = 1,5 Hz, H-2’); 6,81 (d, J = 8,0 Hz, H-5’); 6,98 (dd, 1,5 & 8,0 Hz, H- 6’); 6,30 (d, 16,0 Hz, H-8’); 7,62 (d, 16,0 Hz, H-7’); 4,40 (d, 8,0 Hz, H-1”); 3,3 – 4,1 (m, H-2”, 3”); 4,95 (t, 9,0 Hz, H-4”); 3,3 – 4,1 (m, H-5”); 5,22 (brs, H- 1”’); 3,3 -4,1 (m, H-2”’, H-3”’, H-4”’, H-5”’); 1,12 (d, 6,5 Hz, H-6”’).13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 131,5 (C-1); 116,5 (C-2);144,6 (C-3); 146,0 (C- 4); 117,1 (C-5); 121,3 (C-6); 72,3 (C-8); 36,5 (C-7); 127,6 (C-1’); 114,7 (C-2’); 149,7 (C-3’); 146,7 (C-4’); 116,3 (C-5’); 123,2 (C-6’);168,3 (C-9’); 115,3 (C- 8’); 148,0 (C-7’); 104,1 (C-1”); 76,1 (C-2”); 81,6 (C-3”); 70,4 (C-4”); 75,9 (C- 5”); 62,3 (C-6”); 103,0 (C-1”’); 72,0 (C-2”’); 72,2 (C-3”’); 73,8 (C-4”’); 70,6 (C-5”’); 18,4 (C-6”’). 3.2.2.7. Hợp chất isoacteoside (CH7) Chất bột màu trắng, Rf =0,44 (CH2Cl2:MeOH:H2O = 3,75:1,0:0,1). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 6,70 (d, J = 1,5 Hz, H-2), 6,67 (d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,55 (dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-6), 3,73 (m, H-8), 4,05 (m, H-8), 2,80 (m, H-7), 7,06 (d, J = 2,0 Hz, H-2’), 6,79 (d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,90 (dd, J = 2,0 & 8,5 Hz, H-6’), 6,30 (d, J = 16,0 Hz, H-8’), 7,58 (d, J = 16,0 Hz, H-7’), 4,33 (d, J = 8,0 Hz, H-1”), 3,4 – 4,0 (m, H-2”, H-3”, H-4”, H-5”) 4,39 (brt, J = 5,5 Hz, H- 6”), 4,52 (dd, J = 1,5; 11,5 Hz, H-6”), 5,21 (brs, H-1”’), 3,4 – 4,0 (m, H-2”’, H- 3”’, H-4”’,H-5”’), 1,28 (d, J = 6,0 Hz, H-6”’). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 131,4 (C-1), 117,1 (C-2), 146,0 (C-3), 144,6 (C-4), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-8), 36,6 (C-7), 127,7 (C-1’’), 115,1 (C-2’), 146,7 (C-3’), 149,5 (C-4’), 116,6 (C-5’), 123,2 (C-6’), 169,2 (C-9), 114,8 (C-8’), 147,2 (C-7’), 104,3 (C-1”), 75,3 (C-2”), 84,0 (C-3”), 70,0 (C-4”), 75,6 (C-5”), 64,6 (C-6”), 102,7 (C-1”’), 72,2 (C-2”’), 72,3 (C-3”’), 74,0 (C-4”’), 70,4 (C-5”’), 17,9 (C- 6”’) 3.2.2.8. Hợp chất decaffeoylacteoside (CH8) Chất bột màu trắng, Rf =0,56 (CH2Cl2:MeOH:H2O = 3,5:1,0:0,1). (-)-ESI- MS m/z: 461,0 [M-H]-, công thức phân tử: C20H30O12. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 6,71 (d, 1,5 Hz, H-2), 6,69 (d, 8,0 Hz, H-5), 6,57 (dd, 2,0;
8 8,0 Hz, H-6), 3,72 (m, H-8) 4,01 (m,, H-8), 2,80 (m, H-7), 4,31 (d, 8,0 Hz, H- 1”), 3,3 – 4,1 (m, H-2”, H-3”, H-4”, H-5”), 3,37 (brt, 9,5 Hz, H-6”), 3,42 (brt, 9,5 Hz, H-6”), 5,17 (d, 1,0 Hz, H-1”’), 3,3 – 4,1 (m, H-2”’, H-3”’, H-4”’, H-5”’, 1,26 (d, J = 7,0 Hz, H-6”’) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 131,5 (C-1), 116,3 (C-2), 144,6 (C-3), 146,1(C-4), 117,1 (C-5), 121,2 (C-6), 72,1 (C- 8), 36,5 (C-7), 104,2 (C-1”), 75,6 (C-2”), 84,5 (C-3”), 70,1 (C-4”), 77,8 (C-5”), 62,7 (C-6”), 102,8 (C-1”’), 72,2 (C-2”’), 72,3 (C-3”’), 74,0 (C-4”’), 70,2 (C- 5”’), 17,9 (C-6”’) 3.2.2.9. Hợp chất -hydroxyacteoside (CH9) Chất bột màu trắng, Rf =0,38 (CH2Cl2: MeOH: H2O = 3,5:1,0:0,5). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 6,73 (d, 2,0 Hz, H-2), 6,76 (d, 8,0 Hz, H- 5), 6,87 (dd, 2,0; 8,0 Hz, H-6), 3,57 (m, H-8), 4,00 (m, H-8), 4,77 (m, H-7), 7,07 (d, 2,0 Hz, H-2’), 6,80 (d, 8,0 Hz, H5’), 6,98 (dd, 2,0 & 8,0 Hz, H-6’), 6,29 (d, 16,0 Hz, H-8’), 7,62 (d, 16,0 Hz, H-7’), 4,40 (d, 8,0 Hz, H-1”), 3,5 – 4,0 (m, H-2”, H-3”), 4,96 (t, 9,0 Hz, H-4”), 3,5 – 4,0 (m, H-5”), 3,42 (brt, 8,5 Hz, H-6”), 3,84 (brt, 9,0 Hz, H-6”), 5,22 (brs, H-1”’), 3,5 – 4,0 (m, H-2”’, H- 3”’, H-4”’, H-5”’), 1,12 (d, 6,0 Hz, H-6”’). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 133,7 (C-1), 114,6 (C-2), 146,3 (C-3), 146,1 (C-4), 116,5 (C-5), 119,0 (C-6), 76,7 (C-8), 74,2 (C-7), 127,7 (C-1’’), 115,3 (C-2’), 146,9 (C-3’), 149,8 (C-4’), 116,2 (C-5’), 123,2 (C-6’), 168,3 (C-9’), 114,7 (C-8’), 148,0 (C-7’), 104,6 (C-1”), 76,4 (C-2”), 81,3 (C-3”), 70,5 (C-4”), 76,1 (C-5”), 62,3 (C-6”), 102,9 (C-1”’), 72,1 (C-2”’), 72,4 (C-3”’), 73,8 (C-4”’), 70,4 (C-5”’), 18,4 (C-6”’). 3.3. Tách chiết, phân lập các chất từ cây An điền lá thông 3.3.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Hình 3.3. Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây An điền lá thông
9 3.3.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông 3.3.2.1. Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1) Chất bột màu cam, Rf = 0.45 (n-hexane:CH2Cl2 4:1,v/v). HR-ESI-MS: m/z = 269,0464 [M-H]-. Công thức phân tử C15H10O5. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 + CD3OD và DMSO-d6,) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 + CD3OD và DMSO- d6,)  (ppm) (Bảng 4.3). 3.3.2.2. Hợp chất 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2) Chất bột màu đỏ cam, Rf = 0,52 (n-hexane: EtOAc 4,5: 1, v/v). 1H NMR (500MHz, CDCl3): H (ppm) 7,36 (d, 9,0 Hz, H-3), 8,14 (1H, d, 9,0Hz, H-4), 8,27 ( m, H-5, H-8), 7,74 (m, H-6, H-7), 4,04 (s, OMe), 6,69 (s, OH). 13C NMR (125MHz, CDCl3): C (ppm) 146,6 (C-1), 155,6 (C-2), 120,3 (C-3), 125,8 (C-4), 127,1 (C-5), 133,9 (C-6, C-7), 126,9 (C-8), 182,7 (C-9), 182,1 (C-10), 133,0 (C-11), 134,5 (C- 12), 125,7 (C-13), 127,6 (C-14), 62,3 (OMe). 3.3.2.3. Hợp chất 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3) Chất bột màu cam, Rf = 0,47 (n-hexane:CHCl3:EtOAc 1,0:1,5:1,0, v/v).(-)- ESI-MS m/z: 253,0 [M-H]-, công thức phân tử C15H10O4. 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6): H (ppm) 7,61 (d, 7,5 Hz, H-3); 7,55 (d, 7,5 Hz, H-4); 7,44 (d, 2,5 Hz, H-5); 7,21 (dd, 2,5; 8,5 Hz, H-7); 8,08 (d, 8,5 Hz, H-8); 13,08 ( s, 1-OH); 2,27 (s, 2-CH3). 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6): C (ppm) 159,9 (C-1); 114,6 (C-2); 136,8 (C-3); 118,6 (C-4); 112,5 (C-5); 163,9 (C-6); 121,4 (C-7); 129,8 (C-8); 187,6 (C-9); 181,7 (C-10); 131,1 (C-4a); 124,4 (C-8a); 134,2 (C-9a); 135,6 (C-10a); 15,7 (2-CH3). 3.3.2.4. Hợp chất digiferruginol (HP4) Chất bột, màu vàng da cam, Rf = 0,5 (CH2Cl2: MeOH = 9:1, v/v). (-)-ESI- MS m/z: 253,0 [M-H]-, công thức phân tử C15H10O4.1H-NMR(500MHz, DMSO), δH (ppm) 7,77 (d, 7,5 Hz, H-3); 7,92 (d, 8,0 Hz, H-4); 8,20 (m, H-5); 7,95 (m, H-6, H-7); 7,92 (m, H-7); 8,25 (m, H-8); 4,66 (d, 5,0 Hz, 2 -CH2OH); 5,46 (t, 5,5 Hz, 2-CH2OH); 12,77 (s, 1-OH). 13C NMR (125MHz, DMSO), C (ppm) 158,4 (C-1); 138,2 (C-2); 131,3 (C-3); 118,8 (C-4); 126,8 (C-5); 134,5 (C-6); 135,1 (C-7); 126,6 (C-8); 188,7 (C-9); 181,8 (C-10); 133,6 (C-5a); 133,2 (C-8a); 114,9 (C-9a); 132,8 (C-10a); 57,4 (CH2OH). 3.3.2.5. Hợp chất lutein(HP5) Chất bột màu đỏ cam, Rf = 0,44(n-hexane: EtOAc 3,75:1,25, v/v). (+)- ESI-MS m/z: 569,3 [M+H]+, công thức phân tử: C40H56O2. 1H NMR (500MHz, CDCl3): H (ppm) 1,48 (t, 12,0 Hz, H2-2), 4,00 (m, H-3), 2,04 (dd, 17,0, 10,0 Hz, H-4ax), 2,33 – 2,42 ( m, H-4eq), 6,12 (s, H-7, H-8), 6,15 (m, H-10), 6,58- 6,67 (m, H-11, H-15, H-11’, H-15’), 6,36 (d, 15,0 Hz, H-12), 6,25 (brd, 9,0 Hz, H-14), 1,07 (s, 1-(CH3)2), 1,97 (s, 9-CH3, 13-CH3), 1,37 (dd, 13,0; 7,0 Hz, H- 2’ax), 1,84 (dd, 13,0; 6,0 Hz, H-2’eq), 4,25 (m, H-3’), 5,54 (brs, H-4’), 2,33 – 2,42 (m, H-6’), 5,43 (dd, 10,0; 15,5 Hz, H-7’), 6,15 (m, H-8’, H-10’), 6,36 (d, 15,0 Hz, H-12’), 6,25 (brd, 9,0 Hz, H-14’), 0,85 (s, 1’-CH3), 1,00 ( s, 1’-CH3), 1,63 (s, 5’-CH3), 1,91 (s, 9’-CH3), 1,97 (s, 13’-CH3). 13C NMR (125MHz,
10 CDCl3): C (ppm) 37,1 (C-1), 48,5 (C-2), 65,1 (C-3), 42,6 (C-4), 126,2 (C-5), 137,6 (C-6), 125,6 (C-7), 138,5 (C-8), 135,7 (C-9), 131,3 (C-10), 124,8 (C-11), 137,7 (C-12), 136,5 C-13), 132,6 (C-14), 130,1 (C-15), 28,7 (1-Me), 30,3 (1- Me), 21,6 (5 –Me), 12,8 (9-Me, 13-Me), 34,0 (C-1’), 44,6 (C-2’), 65,9 (C-3’), 125,6 (C-4’), 137,8 (C-5’), 55,0 (C-6’), 128,7 (C-7’), 138,0 (C-8’), 135,1 (C- 9’), 130,8 (C-10’), 124,5 (11’), 137,6 (C-12’), 136,4 (C-13’), 132,6 (C-14’), 130,0 (C-15’), 24,3 (1’-Me), 29,5 (1’-Me), 22,9 (5’-Me), 14,1 (9’-Me), 13,1 (13’-Me). 3.3.2.6. Hợp chất ursolic acid (HP6) Chất bột màu trắng, Rf = 0,5 (CH2Cl2:MeOH 94:6, v/v). 3.3.2.7. Hợp chất oleanolic acid (HP7) Chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2:MeOH 94:6, v/v). 3.3.2.8. Hợp chất asperuloside (HP8) Chất bột màu trắng, Rf = 0,54 (CH2Cl2: MeOH: H2O 4,0:1,0:0,1, v/v).ESI-MS m/z: 437,0 [M+Na]+, công thức phân tử: C18H22O11.1H NMR (500MHz, CD3OD): H (ppm) 5,97 (d, 1,0 Hz, H-1), 7,32 (d, 2,0 Hz, H-3), 3,70 (m, H-5), 5,59 (brd, 6,5 Hz, H-6), 5,75 (brs, H-7), 3,32 (m, H-9), 4,69 (dd, 14,0 Hz, 1,0 Hz, H-10a), 4,80 (dd, 14,0, 1,0 Hz, H-10b), 2,10 (s, CH3CO), 4,71 (d, 8,0 Hz, Glc-1), 3,22 (dd, 9,0, 8,0 Hz, Glc-2), 3,31 – 3,40 (m, Glc-3, 4, 5), 3,94 (dd, 12,0 Hz, 2,0 Hz, Glc-6), 3,70 (dd, 12,0; 6,0 Hz, Glc-6). 13C NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm) 93,3 (C-1), 150,3 (C-3), 106,1 (C-4), 37,4 (C-5), 86,3 (C-6), 128,9 (C-7), 144,2 (C-8), 45,2 (C-9), 61,9 (C-10), 172,3 (C-11), 172,6 (CH3CO), 20,6 (CH3CO), 100,0 (Glc-1), 74,6 (Glc-2), 78,3 (Glc-3), 71,6 (Glc-4), 77,8 (Glc-5), 62,8 (Glc-6). 3.3.2.9. Hợp chất deacetyl asperuloside (HP9) Chất bột màu trắng, Rf = 0,67 (CH2Cl2:MeOH 4:1, v/v).(-)-ESI-MS m/z: 370,9 [M-H]-, công thức phân tử: C16H20O10. 1H NMR (500MHz, CD3OD): H (ppm) 5,97 (d, 1,5 Hz, H-1), 7,31 (d, 2,0 Hz, H-3), 3,70 (m, H-5), 5,58 (dd, 1,5; 6,5 Hz, H-6), 5,66 (brs, H-7), 3,32 ( m, H-9), 4,21 (brs, H-10), 4,70 (d, 8,0 Hz, Glc-1), 3,21 (dd, 9,0; 8,0 Hz, Glc-2), 3,30 – 3,60 (m, Glc-3, Glc-4, Glc-5), 3,94 (dd, 12,0; 2,0 Hz, Glc-6), 3,84 (dd, 12,0; 6,0 Hz, Glc-6). 13C NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm) 93,3 (C-1), 150,2 (C-3), 106,5 (C-4), 37,5 (C-5), 86,6 (C- 6), 125,7 (C-7), 149,8 (C-8), 45,0 (C-9), 60,1 (C-10), 172,8 (C-11), 99,9 (Glc- 1), 74,7 (Glc-2), 78,4 (Glc-3), 71,6 (Glc-4), 77,9 (Glc-5), 62,8 (Glc-6). 3.3.2.10. Hợp chất asperulosidic acid (HP10) Chất bột màu trắng, Rf = 0,56 (CH2Cl2:MeOH 4:1, v/v). 1H NMR (500MHz, CD3OD): H (ppm) 5,07 (d, 9,0 Hz, H-1), 7,63 (s, H-3), 3,05 (m, H- 5), 4,85 (m, H-6), 6,04 (brs, H-7), 2,65 ( t, 8,0 Hz, H-9), 4,97 (brd, 14,5 Hz, H- 10a), 4,83 (brd, 14,5 Hz, H-10b), 2,03 (s, CH3CO), 4,75 (d, 8,0 Hz, Glc-1), 3,41 (brt, 8,5 Hz, Glc-2), 3,25 - 3,33 (m, Glc-3, Glc-4, Glc-5), 3,87 ( brd, 10,0 Hz, Glc-6), 3,64 (dd, 5,0; 12,0 Hz, Glc-6). 13C NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm) 101,2 (C-1), 154,6 (C-3), 109,0 (C-4), 42,7 (C-5), 75,5 (C-6), 131,9 (C-7), 14,.9
11 (C-8), 46,4 (C-9), 63,8 (C-10), 170,0 (C-11), 172,5 (CH3CO-), 20,8 (CH3CO), 100,6 (Glc-1), 74,9 (Glc-2), 78,5 (Glc-3), 71,6 (Glc-4), 77,9 (Glc-5), 63,0 (Glc- 6). 3.3.2.11. Hợp chất scandoside methyl ester (HP11) Chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2:MeOH 4,5:1, v/v).(-)-ESI-MS m/z: 403,0 [M-H]-, công thức phân tử: C17H24O11. 1H NMR (500MHz, CD3OD): H (ppm) 5,21 (t, 6,0 Hz, H-1), 7,53 (brs, H-3), 3,04 (m, H-5), 4,57 (brs, H-6), 5,83 (brs, H-7), 3,23 (brt, 8,0 Hz, H-9), 4,21 (brd, 15,0 Hz, H-10a), 4,36 (brd, 15,0, H-10b), 3,77 (s, OCH3), 4,69 (d, 8,0 Hz, Glc-1), 3,20 – 3,34 (m, Glc-2 – Glc-5), 3,88 (brd, 11,5 Hz, Glc-6), 3,66 (brd, 11,5 Hz, Glc-6). 13C NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm) 98,3 (C-1), 153,9 (C-3), 110,8 (C-4), 45,6 (C-5), 82,6 (C-6), 130,1 (C-7), 147,5 (C-8), 47,1 (C-9), 61,0 (C-10), 170,3 (C-11), 52,03 (OCH3), 100,3 (Glc-1), 74,8 (Glc-2), 78,4 (Glc-3), 71,5 (Glc-4), 77,9 (Glc-5), 62,7 (Glc-6). 3.3.2.11. Hợp chất afzelin (HP12) Chất bột màu vàng, Rf = 0,51 (CH2Cl2:MeOH 4,25:0,75, v/v).(-)-ESI-MS m/z: 430,9 [M-H]-, công thức phân tử: C21H20O10. 1H-NMR (500MHz, CD3OD): H (ppm) 6,22 (d, 2,0 Hz, H-6); 6,40 (d, 2,0 Hz, H-8); 7,79 (d, 9,0 Hz, H-2’, 6’); 6,96 (d, 9,0 Hz, H-3’, 5’); 5,40 (d, 1,5 Hz, H-1”); 3,73 (dd, 3,0; 9,0 Hz, H- 2”); 3,36 (d, 5,0 Hz, H-3”); 3,35 (d, 5,0 Hz, H-4”); 4,24 (dd, 2,0; 4,0Hz, H-5”); 0,94 (d, 6,0 Hz, H-6”). 13C-NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm) 159,3 (C-2); 136,2 (C-3); 179,6 (C-4); 163,2 (C-5); 99,9 (C-6); 166,1 (C-7); 94,8 (C-8); 158,6 (C-9); 105,9 (C-10); 122,7 (C-1’); 131,9 (C-2’, C-6’); 116,5 (C3’, C-5’); 161,6 (C-4’); 103,5 (C-1”); 72,0 (C-2”); 72,2 (C-3”); 73,2 (C-4”); 71,9 (C-5”); 17,6 (C-6”). 3.3.2.13. Hợp chất isorhamnetin-3-O--rutinoside(HP13) Chất bột màu vàng, Rf = 0,63 (CH2Cl2:MeOH:H2O 3,75:1:0,1, v/v).(-)-ESI- MS m/z: 623,2 [M-H]-, công thức phân tử: C28H32O16. 1H-NMR (500MHz, CD3OD): H (ppm) 6,22 (d, 1,5 Hz, H-6), 6,41 (d, 1,5 Hz, H-8), 7,95 (d, 2,0 Hz, H-2’), 6,93 (d, 8,5 Hz, H-5’), 7,64 (dd, 2,0, 8,5 Hz, H-6’), 5,24 (d, 7,5 Hz, H-1”), 4,55 (d, 1,0 Hz, H-1”’), 1,12 (d, 7,5 Hz, H-6”’), 3,96 (s, OMe). 13C-NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm) 158,5 (C-2), 135,5 (C-3), 179,3 (C-4), 162,9 (C-5), 100,0 (C-6), 166,0 (C-7), 94,9 (C-8), 158,9 (C-9), 105,7 (C-10), 123,0 (C-1’), 114,6 (C-2’), 148,3 (C-3’), 150,8 (C-4’), 116,1 (C-5’); 124,0 (C-6’), 104,4 (C- 1”), 75,9 (C-2”), 78,1 (C-3”), 71,6 (C-4”), 77,3 (C-5”), 68,5 (C-6”), 102,5 (C- 1”’), 72,0 (C-2”’), 72,3 (C-3”’), 73,8 (C-4”’), 69,8 (C-5”’), 17,9 (C-6”’), 56,8 (- OMe) 3.3.2.14. Hợp chất rutin (HP14) Chất bột màu vàng, Rf = 0,4 (CH2Cl2:MeOH:H2O 2,75:1:0,1, v/v).(-)-ESI- MS m/z: 609,2 [M-H]-, 633,1 [M+Na]+ công thức phân tử: C27H30O16. 1H-NMR (500MHz, CD3OD): H (ppm) 6,22 (brs, H-6), 6,42 (brs, H-8), 7,71 (brs, H-2’), 6,91 (d, 8.0 Hz, H-5’), 7,64 (brd, 8.5 Hz, H-6’), 5,07 (d, 7,5 Hz, H-1”), 3,53 (t, 9,0 Hz, H-2”), 3,81 (brd, 9,5 Hz, H-6”), 4,54 (brs, H-1”’), 3,69 (brs, H-2”’),
12 3,58 (dd, 3,5, 9,5 Hz, H-3”’), 3,31 (m, H-4”’), 3,44 (m, H-5”’), 1,14 (d, 6,5 Hz, H-6”’). 13C-NMR (125MHz, CD3OD): C (ppm) 158,4 (C-2), 135,6 (C-3), 179,3 (C-4), 162,7 (C-5), 100,0 (C-6), 166,0 (C-7), 95,0 (C-8), 159,4 (C-9), 105,6 (C- 10), 123,1 (C-1’), 117,7 (C-2’), 145,6 (C-3’), 149,7 (C-4’), 116,1 (C-5’), 123,6 (C-6’), 104,8 (C-1”), 75,5 (C-2”), 78,0 (C-3”), 71,3 (C-4”), 77,1 (C-5”), 68,6 CH2 (C-6”), 102,3 (C-1”’), 72,0 (C-2”’); 72,1 (C-3”’); 73,9 (C-4”’), 69,6 (C- 5”’), 17,8 (C-6”’). 3.3.3. Thử hoạt tính của các cặn chiết và các chất phân lập từ cây An điền lá thông 3.3.3.1. Thử hoạt tính gây cảm ứng apoptosis 3.3.3.2. Thử hoạt tính độc tế bào CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu về cây Ngoại mộc tái 4.1.1. Các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens) Từ cây Ngoại mộc tái, một loài thuộc chi Allophylus lần đầu tiên được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, đã phân lập được 5 hợp chất gồm 1 Diterpen (AL1), 1 flavonoid (AL2), 3 steroid (AL3-AL5) (Hình 4.1) trong đó hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) và catechin (AL2) lần đầu tiên được phân lập từ chi Allophylus. OH 6' 4' 19 18 17 16 OH HO 7 9 O 2 1' 3' OH 1 15 3 20 12 10 6 3 5 10 OH AL2 AL1 4 OH 24 24 23 19 23 19 20 20 26 25 26 12 29 18 22 25 12 29 18 22 21 21 17 11 17 11 27 13 27 28 13 28 16 16 1 8 14 1 8 14 15 15 9 7 9 7 3 3 AL4 6 AL3 6 HO 10 HO 10 4 5 4 5 23 24 19 20 29 18 25 26 12 17 21 22 11 28 13 27 1 8 16 14 9 7 15 3 6 GlcO 10 AL5 4 5 Hình 4.1. Cấu trúc của các hợp chất từ cây Ngoại mộc tái
13 4.1.2. Hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái Geranyl linalool (AL1) thể hiện kết quả âm tính khi thử hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư ở người (KB, HepG2, LU-1, MCF – 7, SK). 4.2. Các nghiên cứu về cây Cày ri ta Hạ long 4.2.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được Từ cây Cày ri ta Hạ long một loài thuộc chi Chirita lần đầu tiên được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Đã phân lập được 9 hợp chất gồm 1 anthraquinone: 7-hydroxytectoquinone (CH1), 3 triterpenoid: 3α, 24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2), ursolic acid (CH3), oleanolic acid (CH4), 5 phenylethanoid glycoside: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-β-D- glucopyranoside (CH5), acteoside (CH6), isoacteoside (CH7), decaffeoylacteoside (CH8), β-hydroxyacteoside (CH9).Trong đó, có 3 hợp chất: oleanolic acid, decaffeoylacteoside và β-hydroxy acteoside lần đầu tiên được phân lập từ chi Chirita. O 30 2 4 R R 8 9 1 29 3 HO 7 8a 9a 2 R 19 21 12 18 6 3 22 10a 10 4a 4 11 17 28 5 25 26 COOH O 1 9 14 16 CH1 OH 3 7 27 1 OH R 5 O 3 5 23 R O 1 4 24 HOHO OH CH2 R1 = -OH, R2 = R3 = CH3, R4 = H, R5 = CH2OH OH CH3 R1 = -OH, R2 = R3 = R5 = CH3, R4 = H CH5 CH4 R1 = -OH, R3 = H, R2 = R4 = R5 = CH3 OR 2 R3 OH O 3 O 1 OR 1 O 4 OH OH OH 1" O CH6 R1 = Caffeoyl, R2 = R3 = H OH 1"' CH7 R2 = Caffeoyl, R1 = R3 = H HO CH8 R1 = R2 = R3 = H CH6 R1 = Caffeoyl, R2 = H, R3 = OH Hình 4.9. Cấu trúc của các hợp chất từ cây Cày ri ta Hạ long 4.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào của một sô hợp chất phân lập được Ba hợp chất CH2, CH7, CH8 phân lập được từ cây Cày ri ta Hạ long thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu trên bốn dòng tế bào: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU-1) và ung thư vú (MCF7) 4.3. Kết quả nghiên cứu về cây An điền lá thông 4.3.1. Các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông Từ cây An điền lá thông đã phân lập được 14 hợp chất gồm 1
14 anthraquinone mới 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1) và 13 hợp chất đã biết gồm 3 anthraquinone: 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2), 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3), digiferruginol (HP4), 1carotenoid: lutein (HP5), 2 triterpene: ursolic acid (HP6), oleanolic acid (HP7), 4 iridoid glycoside: asperuloside (HP8), deacetyl asperuloside (HPB3, HP9), asperulosidic acid (HP10), scandoside methyl ester (HPB4, HP11) và 3 flavonoid glycoside: afzelin (HP12), isorhamnetin-3-O--rutinoside (HP13), rutin (HP14) trong đó hợp chất HP5, HP12 lần đầu tiên được phân lập trong chi Oldenlandia. (Hình 4.23). 1 O R 4' 8 9 1 2 5' OH 8a 9a 2 R 1 7 11 13 15 12' 10' 8' 3' 7 9 14' 6' 6 13' 9' 2' 2 6 3 8 10 12 14 15' 11' 7' 1' 4 10a 4a 4 3 5 R 5 10 3 HO R 4 HP5 O 1 3 4 2 HP1 R = R = R = OH, R = Me 11 O CO HP2 R1 = OMe, R2 = OH, R3 = R4 =H H HP3 R1 = R4 = OH, R2 = Me, R3 = H 6 4 5 3 HP4 R1 = OH, R2 = CH2OH, R3 = R4 = H 7 9 O 30 29 8 30 1 R 10 H 6' 29 O 1' O 5' 20 21 20 21 OH 19 19 12 12 2' 4' 11 1318 22 1318 22 HO 25 26 11 OH 17 COOH 25 26 17 3' 1 9 14 16 1 14 COOH OH 28 9 16 28 2 2 HP8 R = OAc 10 8 15 10 8 3 15 5 7 27 3 5 HO 7 27 HP9 R = OH 4 6 HO 4 6 OH 23 24 23 24 3' OH HP6 HP7 4' 8 1' 1 3' HO 9 O 2 OH HO H R 2' 4' 7 4 3 6 8 9 6 3 HO 7 O 5' 10 O 5 4 7 9 2 1' 6' 5 O OH O 1" 8 6 4 OH 2 1 6' 5 10 3 O O R H O 1' O 6"' 2'' 10 O 1"' O OH OH O 1'' OH 3" 5' O 5"' 4" OH 2' 2'' 6" 5" HO 4"' 2"' 3' 4' OH 5'' OH HO 3"' OH OH 4'' 3'' OH OH OH HP10 R1 = COOH, R2 = OAc HP13 R = OH HP12 HP14 R = OMe HP11 R1 = COOMe, R2 = OH Hình 4.23. Cấu trúc của các hợp chất từ cây An điền lá thông 4.3.1.1. Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone(HP1) O OH O OH 8 9 1 CH3 8a 9a 2 7 6 3 HO 10a 4a 4 HO 5 10 HMBC OH OH O O Hình 4.24. Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của HP1
15 Chất HP1 được phân lập dưới dạng bột màu cam. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS pic ion giả phân tử ở m/z = 269,0464 [M-H]- phù hợp với công thức phân tử C15H10O5. Phổ 1H-NMR của HP1 xuất hiện tín hiệu singlet của 1 proton thơm tại δH7,12; các tín hiệu của proton thơm điển hình của vòng được thế ở vị trí 1, 3, 4 tại δH 8,22 (d, J = 8,5Hz); 7,21 (dd, J= 2,5;8,5Hz) và 7,64 (d, J = 2,5 Hz) và tín hiệu singlet của proton nhóm methyl gắn vào carbon vòng thơm tại δH 2,37. Hình 4.26. Phổ 1H-NMR của HP1 (CDCl3 + CD3OD) Hình 4.27. Phổ 1H-NMR của HP1 (DMSO-d6) Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất HP1 có 15 nguyên tử carbon bao gồm 2 carbon carbonyl, 8 carbon thơm bậc bốn, 4 carbon bậc ba và 1 nhóm methyl. Trong số 8 carbon thơm bậc bốn có 3 nguyên tử carbon gắn với nhóm hydroxyl cộng hưởng tại δC 156,7 (C-1); 157,4 (C-4) và 163,6 (C-6); 1 nguyên tử carbon gắn với nhóm methyl cộng hưởng tại C 141,2 (C-2) và bốn nguyên tử carbon
16 khác cộng hưởng tại δC 111,7; 111,9; 125,9 và 136,1. Trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu của 4 carbon bậc ba trong vùng 112,6-130,1 ppm, tín hiệu của nhóm methyl tại δC 16,6 ppm cùng với hai tín hiệu đặc trưng của 2 nhóm carbonyl tại C 186,7 và 187,0 cho phép dự đoán chất HP1 có khung anthraquinone. Liên kết của 2 nhóm hydroxy ở C-1 và C-4 được chứng minh dựa vào tín hiệu proton hydroxy có liên kết hydro nội phân tử trên phổ 1H NMR (đo trong DMSO-d6) ở H 13,51 và 12,73 cùng với sự chuyển dịch về phía trường thấp của hai carbon carbonyl. Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của HP1(CDCl3 + CD3OD) Hình 4.29. Phổ HMBC của HP1 Phổ HMBC cho thấy các tương tác xa giữa H-8 (H 8,22) với C-9 (C 186,7) và C-6 (C 163,6); H-5 (H 7,64) với C-10 (C 187,0) và C-7 (C 121,9); H-7 (H 7,21) với C-5 (C 112,6) và C-8a (C 125,9) chứng tỏ nhóm hydroxy gắn với C-6. Ngoài ra còn có tương tác giữa proton của nhóm methyl ở H 2,37
17 với C-3 (C 128,0) và C-1 (C 156,7) chứng minh nhóm methyl gắn với C-2. Từ các dữ liệu phổ 1H-, 13C- NMR (Bảng 4.3) và HMBC cho phép xác định HP1 là 2-methyl-1,4,6-trihydroxy-anthraquinone, một hợp chất mới. Bảng 4.3. Số liệu phổ 1H-và 13C-NMR (500/125 MHz) của hợp chất HP1 C CDCl3 + CD3OD DMSO-d6 1 13 1 13 H C H C 1 - 156,7 - 155,9 2 - 141,2 - 140,6 3 7,12 (s) 128,0 7,29 (s) 127,8 4 - 157,4 - 156,6 4a - 111,7 - 111,1 5 7,64 (d, 2,5) 112,6 7,51 (d, 2,5) 112,4 6 - 163,6 - 164,5 7 7,21 (dd, 2,5; 121,9 7,23 (dd; 2,5; 122,1 8,5) 8,5) 8 8,22 (d, 8,5) 130,1 8,14 (d, 8,5) 130,4 8a - 125,9 - 124,1 9 - 186,7 - 185,8 9a - 111,9 - 111,4 10 - 187,0 - 186,3 10a - 136,1 - 135,4 2-CH3 2,37 (s) 16,6 2,3 (s) 16,3 1-OH - - 13,51 (s) - 4-OH - - 12,73 (s) - 4.3.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học 4.3.2.1. Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis của cao chiết n-butanol trên tế bào bạch cầu OCI-AML Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể ở mọi nồng độ thử của cao chiết n-butanol. Vì vậy, cao chiết n-butanol gây apoptosis nhưng chưa làm ảnh hưởng đến chu kỳ của tế bào sau 24 giờ nuôi cấy. 4.3.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-butanol và một số hợp chất phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào ung thư máu K562 Kết quả cho thấy cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu K562 phụ thuộc vào liều. Cao chiết n-butanol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn các hợp chất phân lập từ cao này. 4.3.2.3. Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis của cao chiết n-butanol và một số hợp chất phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào ung thư máu K562 Hoạt tính apoptosis của cao chiết n-butanol và 4 hợp chất (HP9, HP11, HP13, HP14) phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào ung thư máu K562 được
18 xác định thông qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 và xác định hoạt tính caspase 3.  Kết quả về khả năng gây apoptosis của cao chiết n-butanol và một số hợp chất thông qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 (Hình 4.52) Hình 4.67. Phần trăm tế bào K562 apoptosis gây ra bởi cao chiết n-butanol và 4 hợp chất sau 24 giờ. *P HP14> HP9> HP11. Đối chứng Camptothecin (0,5 µg/ml) HP13 (300 µg/ml) HP9 (300 µg/mL) HP11 (300 µg/mL) HP14 (300 µg/mL) Cao chiết n-butanol (300 µg/mL)