Tóm tắt Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, đồng thời xác được một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ ÁI LUYẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NĂM 2019
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học khoa học, Đại học Huế Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đỗ Thị Bích Thủy Phản biện 1: PGS. TS. Vũ Đình Hoàng – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Phản biện 2: PGS. TS Lý Nguyễn Bình – Trường Đại học Cần Thơ Phản biện 3: PGS. TS. Phạm Xuân Núi – Trường Đại học Mỏ - Địa chất Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ tại …………………………………………………. Vào hồi………giờ………..ngày………tháng…….năm……… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trường Đại học khoa học, Đại học Huế 0
MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, ... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] … Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic 1
(LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…. Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”. Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, đồng thời xác được một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về polysaccharide 1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide trong công nghiệp 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus fermentum 1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.3.1. Khái niệm 1.3.2. Phân loại và tính chất lý hóa của exopolysaccharide 1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng của EPS 1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB 1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy 1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS 1.4.3. Về đặc tính hóa lý của EPS 1.4.4. Tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối 2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS 2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum 2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol – sulfuric 3
2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum 3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh tổng hợp EPS cao. 140 119,142a 116,744a 120 100,768b 100 88,776c EPS (µg/ml) 80 68,980d 68,370d 69,508d 62,516e 56,581f 58,939ef 60 50,728g 43,248h 35,484i 40 20 0 Chủng vi khuẩn lactic Hình 3.1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic (Trong đó: - TC12: Lb. fermentum TC12 - TC20: Lb. fermentum TC20 - TC13: Lb. fermentum TC13 - TC21: Lb. fermentum TC21 - TC14: Lb. fermentum TC14 - MC2: Lb. fermentum MC2 - TC15: Lb. fermentum TC15 - MC3: Lb. fermentum MC3 - TC16: Lb. fermentum TC16 - N9: Lb. fermentum N9 - TC18: Lb. fermentum TC18 - N10: Lb. fermentum N10 - TC19: Lb. fermentum TC19 Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa các chủng 4
Kết quả Hình 3.1 cho thấy, các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và Lb. fermentum MC2, MC3) và Lb. fermentum MC3 có khả năng sinh tổng hợp tốt hơn so với các chủng còn lại. Từ kết quả này, bốn chủng được chúng tôi lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trong luận án sẽ là Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3). Lb. fermentum TC16 Lb. fermentum TC13 215.159 250 231.988 224.183 238.817 216.988 250 200 EPS (µg/ml) EPS (µg/ml) 200 150 150 100 100 50 50 0 0 0 2 3 4 5 6 0 2 3 4 5 6 Nồng độ bổ sung (%) Nồng độ bổ sung (%) Glucose Lactose Sucrose Glucose Lactose Sucrose 250 Lb. fermentum MC3 Lb. fermentum TC21 EPS (µg/ml) 250 200 178.207 EPS (µg/ml) 200 179.752 176.581 150 150 100 100 50 50 0 0 0 2 3 4 5 6 0 2 3 4 5 6 Nồng độ bổ sung (%) Nồng độ bổ sung (%) Glucose Lactose Sucrose Glucose Lactose Sucrose Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum * Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.1 3.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh EPS của các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) 3.1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn C và nồng độ của chúng Kết quả từ Hình 3.2 cho thấy rằng, quá trình sinh tổng hợp EPS của Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3 xảy ra tốt hơn khi bổ sung các loại đường với nồng độ tương ứng lần lượt là 4% glucose, 3% sucrose, 4% lactose và 4% glucose. 5
3.1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ của chúng Lượng EPS sinh tổng hợp đạt cao nhất bởi các chủng Lb. fermentum TC16, TC21 đều ở trong môi trường chứa 0,8% cao thịt và ở nồng độ cao nấm bổ sung là 0,4% cho chủng Lb. fermentum TC16 và 0,3% cho chủng Lb. fermentum MC3 (Hình 3.3). Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum * Các mức 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ pepton, cao thịt là 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1,0% và cao nấm là 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% bổ sung vào MTTH 3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 3.1.3.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất đối với các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3 khi mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 106 cfu/ml và của chủng Lb. fermentum TC13 là 107 cfu/ml (Hình 3.4) 6
Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 3.1.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu Lượng EPS sinh ra của các chủng Lb. fermentum TC16, TC21, MC3 đều đạt cực đại tại pH 6,0 và tại pH 5,5 đối với chủng TC13 (Hình 3.5). 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 ĐC Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu 3.1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 7
Kết quả Hình 3.6 cho thấy, quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn khảo sát đều xảy ra tốt trong khoảng nhiệt độ từ 35 – 40 oC. 3.1.4. Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian lên men Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men Lượng EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, MC3 đạt cực đại sau 48 giờ lên men và sau 36 giờ lên men với chủng Lb. fermentum TC21. Thời điểm EPS tổng hợp được đạt cực đại cũng chính là thời điểm mà giá trị OD của môi trường đạt được là cao nhất. Kết quả Hình 3.7 cũng chỉ ra những mối quan hệ nhất định giữa hàm lượng EPS tổng hợp được, OD và pH của môi trường trong suốt thời gian lên men. Kết luận 1 : 8
Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb. fermentum nghiên cứu trong luận án Điều kiện thu nhận Hiệu Mật suất thu độ tế nhận Các chủng Thành phần môi bào Nhiệt Thời EPS ở vi khuẩn trường nuôi pH độ gian các điều Lb. cấy ban nuôi lên kiện đã fermentum ban đầu cấy men khảo sát Nguồn Nguồn đầu (oC) (giờ) so với C N (cfu/m MRS l) (%) TC13 4% glc 0,4% cao 107 5,5 40 48 353,56 nấm TC16 3% suc 0,8% 106 6,0 35 48 356,95 cao thịt TC21 4% lac 0,8% 106 6,0 35 36 414,51 cao thịt MC3 4% glc 0,3% cao 106 6,0 35 48 479,14 nấm 3.1.5. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men 3.1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ protein Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13 9
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3 Kết quả trên các Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy, khi nồng độ TCA bổ sung vào tăng lên, lượng protein còn lại trong dịch nuôi cấy đều có xu hướng giảm dần. 10
3.1.5.2. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS Lượng EPS thu được từ các dịch nổi của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đạt tốt nhất khi tỉ lệ dịch nổi và EtOH là 1:1 (Hình 3.12). Các chủng Lb. fermentum Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS 3.1.5.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS Kết quả từ Hình 3.13 cho thấy thời gian áp dụng thích hợp và hiệu quả để thu EPS tủa bằng EtOH trong quá trình tách chiết EPS từ dịch nổi là 24 giờ. Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS 11
Kết luận 2: Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy của các chủng Lb. fermentum Nồng độ Tỉ lệ dịch Thời gian Các chủng Hiệu suất TCA bổ nổi: tủa bằng Lb. thu nhận sung ethanol Ethanol fermentum tăng (%) (%) (v/v) (giờ) TC13 15 1:1 24 121,19 TC16 35 1:1 24 101,73 TC21 20 1:1 24 110,93 MC3 20 1:1 24 106,81 3.2. Kết quả khảo sát các tính chất của EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS EPS tách chiết từ các chủng Lb. fermentum Độ hòa tan (%) EPS- TC13 73,33±3,81 EPS-TC16 75,33±5,17 EPS-TC21 64,00±4,97 EPS-MC3 87,00±2,49 Các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) đều có khả năng hòa tan trong nước rất tốt. 3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu Kết quả Bảng 3.4 cho thấy rằng, EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng giữ nước tốt. 12
Khả năng giữ dầu tương ứng của các EPS từ các chủng Lb. Fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 thể hiện ở Bảng 3.5 Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của EPS từ các chủng Lb. fermentum EPS tách chiết từ các chủng Khả năng giữ nước Lb. fermentum (%) EPS- TC13 140,55 ± 0,45 EPS-TC16 136,22 ± 0,6 EPS-TC21 120,63 ± 1,99 EPS-MC3 135,70 ± 3,11 Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum EPS tách chiết từ các chủng Khả năng giữ dầu Lb. fermentum (%) EPS- TC13 590,78 ± 1,94 EPS-TC16 594,57 ± 1,42 EPS-TC21 608,30 ± 0,45 EPS-MC3 599,97 ± 1,14 3.2.3. Khả năng chống oxy hóa Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) Hoạt lực chống oxy hóa (%) Ascorbic acid Nồng độ (mg/mL) EPS- EPS- EPS- EPS- TC13 TC16 TC21 MC3 Hoạt lực 36,94 ± Nồng độ chống 1,0 - - - (mg/mL) oxy hóa 0,35 57,14 ± 27,14 ± (%) 1,5 - - 0,32 0,30 29,14 ± 27,34 ± 67,41 ± 47,66 ± 27,05 ± 2,0 0,00125 0,52 0,32 0,30 0,55 0,12 38,56 ± 35,95 ± 78,99 ± 68,05 ± 58,3 ± 2,5 0,0025 0,37 0,52 0,30 0,47 0,17 55,01 ± 51,08 ± 80,93 ± 89,57 ± 3,0 - 0,0050 0,25 0,22 0,45 0,1 76,01 ± 72,11 ± 93,12 ± 3,5 - - 0,1250 0,35 0,45 0,12 IC50 2,85 2,96 1,32 2,06 0,00217 13
Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy, các EPS sinh tổng hợp từ 4 chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa tăng dần theo chiều tăng của nồng độ EPS và sự thay đổi này là không giống nhau khi so sánh giữa các EPS từ các chủng khác nhau. 3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 3.3.1. Khối lượng phân tử a) Khối lượng trung bình (kDa) Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 có khối lượng phân tử khoảng 98,5 kDa (Hình 3.14) 3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS - Thành phần monosaccharide của các EPS Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 Thời gian Diện tích STT Hợp chất lưu (phút) peak 1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O- 1 5,134 6665390 methyl-D- glucitol 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O- 2 6,025 6034772 methyl-D-mannitol 14
Kết quả Bảng 3.7 cho thấy thành phần monosaccharide tương ứng trong cấu trúc của EPS-MC3 gồm D-glucose, D- mannose. Dữ liệu Bảng 3.8 thể hiện tỷ lệ và thành phần phần trăm của các monosacharide có trong cấu trúc của EPS-MC3. Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 STT Thành phần Tỷ lệ Thành phần (%) 1 D-glucose 1,00 52,48 2 D-mannose 0,91 47,52 - Xác định vị trí liên kết glycoside trong các EPS bằng GC-MS Bộ khung của EPS-MC3 sinh tổng hợp được có dạng manno- glucan với hai liên kết chủ yếu là (1→6) glucoside và (1→3) mannoside (Bảng 3.9). Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3 STT Hợp chất Liên kết glycoside Tỷ lệ 1,5,6-tri-O-acetyl- →6)-D- 1 2,3,4-tri-O-methyl- glucopyranoside-(1→ 1,00 D-glucitol 1,3,5-tri-O-acetyl- →3)-D- 2 2,4,6-Tri-O-methyl- mannopyranoside-(1→ 0,91 D-mannitol - Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 15
Kết quả phân tích phổ NMR thể hiện ở hình 3.16, hình 3.17, hình 3.18, hình 3.19, hình 3.20, hình 3.21 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của EPS-MC3 cho thấy, trong vùng từ  4,5 đến  4,9 có sự hiện diện của 2 thành phần đường thông qua các tín hiệu đặc trưng của hai proton anomer ở độ chuyển dịch 4,87 ppm và 4,55 ppm; các proton của nhóm O- methyl từ H 3,00 đến 3,62 ppm (Hình 3.16). Hai monosaccharide này được chúng tôi kí hiệu là A và B theo chiều giảm dần của độ chuyển dịch hóa học. Từ giá trị về độ chuyển dịch của proton anomer trong 1H NMR, cấu trúc của EPS-MC3 chỉ chứa liên kết glycoside dạng β-pyranose [9]. Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 16
Kết quả ở Hình 3.17 của phổ 13C –NMR cho thấy EPS-MC3 có sự xuất hiện của hai tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học là 94,1 và 94,0 ppm và các vùng carbon trong mạch vòng của nó từ 61,5 đến 77,2 ppm. Kết hợp các kết quả công bố trước đây [9], [41], [49], [108] và từ phổ 1H, 13C-NMR của EPS-MC3 có tín hiệu carbon anomer ở  94,1 nên có thể được quy cho là của β-D- mannopyranose và tín hiệu ở C1 94,0 sẽ là β-D-glucopyranose. b) a) c) Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 Các đỉnh của đường cắt ngang trong phổ HSQC giúp xác định được vị trí của các phân tử carbon anomer và proton anomer trong cấu trúc dạng vòng từ 1 đến 6 của chúng (Hình 17
3.18). Điều này cho phép xác định vị trí của proton nối với nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3. Những tương tác 1H → 1H trong phổ COSY đã chỉ ra các tương tác giữa các proton của carbon cận kề nhau trong cấu trúc EPS-MC3 sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3. Từ đó cho phép thiết lập trật tự liên kết carbon trong các thành phần đường tương ứng trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3 là (Hình 3.19) Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3 Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO Đơn vị: ppm →6)-β- D- 4,87 3,53 3,62 3,49 3,28 3,51 A glucopyranoside-(1→ →3)-β-D- 4,55 3,01 3,47 3,27 3,50 3,43 B mannopyranoside- (1→ Phần đường C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 →6)-β- D- 94,0 71,6 61,5 70,6 73,8 71,4 A glucopyranoside-(1→ →3)-β-D- 94,1 77,2 73,2 67,1 67,4 61,5 B mannopyranoside- (1→ Đối chiếu với các tài liệu tham khảo [41], [54], [101], [137], [142] cùng những phân tích trên các phổ 1H -NMR, 13C – NMR, 18