Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

13
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án "Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu" là xây dựng quy trình phân tích Auramine O trong mẫu thực phẩm: măng, miến, dưa, phấn hoa, cá khô, mì tôm. Xây dựng quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm thịt khô và bim bim.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI PHẠM THỊ CHUYÊN PHÂN TÍCH AURAMINE O, SUDAN I, SUDAN II TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP-HPLC SỬ DỤNG VẬT LIỆU NANOSILICA ĐỂ XỬ LÝ MẪU Chuyên ngành: Hóa học phân tích Mã số: 9.44.01.18 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2022
Công trình được hoàn thành tại: Bộ môn Hóa phân tích - Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đặng Xuân Thư Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. TS. Nguyễn Bích Ngân Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS. Huỳnh Văn Trung Viện Công nghệ Xạ hiếm Phản biện 3: PGS.TS. Dương Thị Tú Anh Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi …..giờ … ngày … tháng… năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc Gia, Hà Nội - Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết và lí do của đề tài Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế IARC đã xếp một số chất màu tổng hợp vào nhóm các chất có thể gây ung thư như: các chất Sudan, Auramine O, Rhodamine B, Ponceau 3R,… Tuy nhiên đã có nhiều sản phẩm thực phẩm trên thị trường bị phát hiện sử dụng phẩm màu không được phép dùng cho thực phẩm. Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - phẩm màu QCVN 4-10:2010/BYT và Thông tư số 21/2019/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về “Hướng dẫn một số điều của luật chăn nuôi về Thức ăn chăn nuôi”, có quy định rõ tại phụ lục V: Cấm sử dụng Auramine O (AO) và các dẫn xuất của Auramine O trong thức ăn chăn nuôi, như vậy AO là chất không được phép có mặt trong thực phẩm tại Việt Nam. Mặt khác thông tư 24/2019/TT- BYT ban hành ngày 30 tháng 8 năm 2019 quy định có 57 chất màu được phép sử dụng trong thực phẩm không bao gồm các Sudan và AO. Do đó, một phương pháp phát hiện AO và các chất Sudan ở lượng siêu vết trong thực phẩm là rất cần thiết. Trong các hợp chất Sudan, thì Sudan I và Sudan II có màu đỏ sáng đẹp mắt, được sử dụng khá phổ biến trong thực phẩm hơn Sudan III và Sudan do đó đề tài chọn hướng nghiên cứu hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm. Hiện nay, Việt Nam mới chỉ có duy nhất một phương pháp được chứng nhận để xác định Auramine O trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12267:2018 về “Thực phẩm - xác định hàm lượng Auramine - phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)”, chưa có phương pháp được chứng nhận để xác định các Sudan trong thực phẩm. TCVN 12267:2018 đã áp dụng
2 một quy trình duy nhất chiết tách AO từ các nền mẫu thực phẩm khác nhau bằng dung môi hữu cơ, điều này có thể dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp và độ chính xác chưa cao do các mẫu thực phẩm khác nhau có nền mẫu phức tạp không giống nhau, đồng thời LC-MS/MS là hệ thống thiết bị phức tạp đắt tiền, không phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Ưu điểm của phương pháp HPLC là có thể định lượng đồng thời các chất màu tương tự nhau, phương pháp phân tích và vận hành đơn giản, thiết bị sử dụng phổ biến, tuy nhiên khi phân tích HPLC cần phải xử lý làm sạch ảnh hưởng của nền mẫu. Việc sử dụng nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) để hấp phụ chất màu Rhodamine B và Xanh metylen trong dung dịch nước đã được nghiên cứu trên thế giới, ưu điểm của việc sử dụng RHNS so với kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) ở nguồn nguyên liệu nông nghiệp rẻ tiền là trấu, các bước thực nghiệm đơn giản không cần thiết bị phức tạp, sử dụng chính dung môi pha động HPLC để rửa giải chất màu cho hiệu suất hấp phụ- rửa giải cao. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tiến hành hấp phụ chất màu AO và Sudan từ dịch chiết mẫu thực phẩm. Nhằm tìm kiếm giải pháp chiết, tách phù hợp với từng nền mẫu thực phẩm khác nhau, đồng thời xây dựng phương pháp định lượng chất màu nhân tạo độc hại bằng hệ thống thiết bị đơn giản, phù hợp với các điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu”. 2. Mục đích và nội dung chính của luận án Mục đích của luận án:  Xây dựng quy trình phân tích Auramine O trong mẫu thực phẩm: măng, miến, dưa, phấn hoa, cá khô, mì tôm.  Xây dựng quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong
3 mẫu thực phẩm thịt khô và bim bim. Nội dung nghiên cứu chính của luận án:  Đối với Auramine O: o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định Auramine O bằng phương pháp HPLC. o Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Auramine O từ mẫu thực phẩm phòng thí nghiệm. o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của Auramine O trong dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu (kí hiệu RHNS). o Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Auramine O trong mẫu thực tế.  Đối với hỗn hợp Sudan I và Sudan II: o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định đồng thời Sudan I và Sudan II bằng phương pháp HPLC. o Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Sudan I và Sudan II từ mẫu thực phẩm phòng thí nghiệm. o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của của hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu. o Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Sudan I và Sudan II trong mẫu thực tế. 3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu Đối tượng, phạm vi nghiên cứu - Các chất màu Sudan I, Sudan II trong các mẫu thực phẩm: mẫu thịt khô, mẫu bim bim. - Chất màu Auramine O trong các mẫu: măng, miến, phấn hoa, dưa chua, cá khô, mì tôm. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp chiết lỏng – lỏng mẫu thực phẩm bằng dung môi
4 hữu cơ. - Phương pháp hấp phụ chất màu trên nanosilica. - Phương pháp phân tích HPLC định lượng chất màu, sử dụng detector mảng Diode Array (PDA). - Phương pháp phổ hấp phụ phân tử UV-Vis để xác định các bước sóng hấp phụ cực đại của các dung dịch chất màu. Luận án sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại để đánh giá xác định các đặc trưng của vật liệu hấp phụ: phổ FTIR, SEM, EDX, BET,… Sử dụng các phương pháp thống kê để xử lý kết quả, đánh giá số liệu thực nghiệm. 4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án - Việc kiểm tra chất màu độc hại trái phép trong thực phẩm với các mẫu ngẫu nhiên tại các phòng thí nghiệm nhỏ ở Việt Nam là ít khả thi, chính vì vậy với mục tiêu nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đơn giản RP-HPLC để đánh giá hàm lượng AO, Sudan I và Sudan II trong một số mẫu thực phẩm trên thị trường là có ý nghĩa lớn. - Luận án đã đưa ra quy trình chung để phân tích các chất màu (Auramine O và hỗn hợp Sudan I, Sudan II) trong các mẫu thực phẩm. Quy trình gồm 2 giai đoạn chính là xử lý mẫu và phân tích định lượng mẫu bằng phương pháp HPLC. Giai đoạn xử lý mẫu được thực hiện theo 2 cách với các loại mẫu khác nhau. Cách 1: Chiết bằng dung môi hữu cơ. Cách 2: Chiết bằng dung môi hữu cơ - Hấp phụ chất màu trong dịch chiết bằng Nanosilia chế tạo từ vỏ trấu - Giải hấp phụ bằng pha động HPLC. Đây là quy trình phân tích chất màu trong thực phẩm chưa được đề xuất trước đó trong bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào. - Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ được đánh giá là phương pháp nhanh, đơn giản dễ thực hiện và chi phí thấp.
5 Một điểm ý nghĩa của luận án là đưa ra phương pháp chiết các chất màu bằng dung môi ethanol (chiết auramine O bằng hỗn hợp ethanol: nước (v/v 70:30, chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II bằng ethanol tuyệt đối). Với lượng mẫu, thể tích dịch chiết, số lần chiết, nhiệt độ, thời gian chiết phù hợp, sử dụng dung môi chiết chứa dung môi ethanol cho hiệu suất chiết cao đối với nhiều loại mẫu thực phẩm (trên 90%) mà vẫn đảm bảo được yếu tố: không độc hại với người phân tích và môi trường, chi phí thấp, các bước thực hiện đơn giản và có thể chiết đồng thời được nhiều loại mẫu. - Sử dụng Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu để hấp phụ chất màu từ dịch chiết mẫu thực phẩm cũng là một điểm mới của luận án. Đây cũng là một bước quan trọng trong xử lý mẫu hướng tới "quy trình xanh". - Luận án đã đưa ra kết quả định lượng phân tích AO, Sudan I và Sudan II trong nhiều mẫu thực phẩm khác nhau, số liệu có giá trị trong việc tham khảo lựa chọn các loại thực phẩm an toàn đối với người tiêu dùng. 5. Bố cục của luận án ` Bố cục luận án gồm 147 trang: mở đầu 5 trang; tổng quan 40 trang; thực nghiệm 27 trang; kết quả và thảo luận 56 trang; kết luận 2 trang. Luận án có 56 hình và 42 bảng; tài liệu tham khảo 11 trang với 13 tài liệu tiếng Việt và 63 tài liệu tiếng Anh. Ngoài ra còn có 6 Phụ lục với độ dài 6 trang.
6 CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN Chương 1 giới thiệu thông tin về các vấn đề thuộc phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm: 1.1. Chất màu tổng hợp 1.2. Cơ chế liên kết của chất màu với vật liệu 1.3 Auramine O 1.4. Các hợp chất Sudan 1.5. Một số vấn đề khi định lượng chất màu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: gồm các nội dung về hệ số đối xứng của peak, các vấn đề về peak, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ. 1.6. Xử lý mẫu thực phẩm: gồm các nội dung về phân loại các phương pháp xử lý mẫu, kỹ thuật chiết lỏng - lỏng ứng dụng xử lý mẫu, xu hướng áp dụng kỹ thuật chuẩn bị mẫu xanh. 1.7. Vật liệu nanosilica và ứng dụng trong hấp phụ chất màu: bao gồm các nội dung về các đặc trưng vật lý, hóa học của vật liệu, cơ sở xử lý thống kê số liệu hấp phụ, các ứng dụng vật liệu nanosilica chế tạo từ vỏ trấu trong hấp phụ làm giàu chất phân tích. CHƯƠNG 2- THỰC NGHIỆM 2.1. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1.Chuẩn bị mẫu giả 2.2.1.1. Mẫu phân tích Auramine O Măng tươi được đào nguyên củ, bỏ phần cứng và xơ, lấy lõi mềm rửa sạch, thái mỏng, ngâm qua nước muối pha loãng, vớt, luộc chín, để ráo nước, sau đó ngâm ngập trong dấm đến 4 ngày, khi ngửi thấy măng có mùi chua đặc trưng thì vớt ra, cắt nhỏ, cân khối lượng
7 ban đầu m1 (gam), thêm vào một lượng Auramine O theo khối lượng định trước (mAO gam). Đem sấy đến khối lượng không đổi trong tủ sấy chân không cân khối lượng m2 gam, sau đó nghiền, rây mịn. Với mẫu miến, là loại miến dong làm thủ công tại Sơn La, được kiểm soát công đoạn chặt chẽ để không sử dụng bất cứ chất màu hoặc chất tẩy trắng nào trong quá trình làm miến. Lấy một lượng miến đem sấy khô đến khối lượng không đổi (ghi khối lượng mẫu ban đầu m1 gam), ngâm vào nước ấm đến mềm, trộn AO khối lượng định trước (mAO gam), đảo và nghiền đều đến đồng nhất mẫu, đem sấy khô đến khối lượng không đổi (m2 gam), nghiền vụn, rây mịn, thu bột mịn, tiếp tục sấy bột trong tủ sấy chân không khoảng 3 giờ, sản phẩm đựng trong lọ kín, bảo quản trong tủ lạnh tối. 2.2.1.2. Mẫu phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II Để xác định các điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất các mẫu thực phẩm, hai mẫu thịt khô, ký hiệu là A và B, đã được chuẩn bị. Thịt lợn tươi được mua từ một siêu thị VinMart tại Hà Nội, có chứng nhận thịt lợn sạch nuôi hữu cơ. Chỉ dùng phần thịt nạc (loại sạch mỡ, da, gân), thái mỏng, băm rồi xay nhỏ đến kích thước nhỏ hơn 5 mm. Cho lượng thịt nạc xay nhỏ xấp xỉ nhau vào hai cốc thủy tinh chịu nhiệt (kí hiệu A và B), và thêm 0,1g NaCl vào mỗi cốc. Cốc A chỉ chứa mẫu thịt và muối, trong khi cốc B chứa mẫu thịt, muối và Sudan I, Sudan II. Thêm vào mỗi cốc vài giọt ethanol và trộn đều để hỗ trợ chất màu thẩm thấu vào thịt và đảm bảo màu sắc phân bố đều lên thịt. Các mẫu thịt được lưu trữ kín trong tủ lạnh khoảng một ngày để chất màu thấm kĩ vào thịt. Sau đó, các mẫu lại được trộn đều rồi sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50°C trong một ngày đêm. Các mẫu thịt khô được nghiền nhỏ bằng máy rồi rây qua rây kích thước lỗ 0,5 mm. Cuối cùng, các mẫu đã rây xong được tiếp tục làm khô trong tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi (thời gian khoảng 3 tiếng).
8 2.2.2. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng HPLC Các dung dịch chuẩn của Auramine O trước khi đem đo HPLC đều được pha trong đệm photphat (pH=3, thêm 0,2% triethylamine) trộn ACN (tỉ lệ thể tích 65:35). Các dung dịch chuẩn của hỗn hợp Sudan I và Sudan II trước khi đem đo HPLC đều được pha trong pha động là MeOH: H2O: ACN (v/v=77:3:20). Các nội dung khảo sát bao gồm: 2.2.2.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại 2.2.2.2. Khảo sát pha động tối ưu 2.2.2.3. Khảo sát tỉ lệ pha động 2.2.2.4. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 2.2.3. Nghiên cứu các điều kiện chiết 2.2.3.1. Các điều kiện chiết Auramine O * Đánh giá khả năng chiết của hai phương pháp: chiết có hỗ trợ rung siêu âm và chiết rung lắc. * Lựa chọn dung môi chiết AO: Có 8 loại dung môi chiết được lựa chọn để khảo sát được nêu trong bảng 2.3. Bảng 2.3 Các loại dung môi lựa chọn cho quá trình chiết AO. Stt Thành phần Tỉ lệ Stt Thành phần Tỉ lệ v:v v:v 1 ACN:H2O ACN 100% 5 70:30 (0,5%NH3) 2 EtOH 100% 6 MeOH:H2O 70:30 3 MeOH 100% 7 EtOH:H2O 70:30 4 H2O 100% 8 EtOH:H2O 50:50 * Khảo sát thời gian chiết: thời gian chiết được khảo sát với 5 mốc là 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút, 200 phút.
9 * Khảo sát nhiệt độ chiết: khảo sát các mức nhiệt độ đươc gia nhiệt trong quá trình chiết là : 50°C, 60°C, 70°C * Khảo sát số lần chiết: với 10mL dung môi, khảo sát 3 phương án chiết: (1) chiết 1 lần 10 mL trong 60 phút (2) chiết 2 lần, mỗi lần 5 mL (30 phút/lần) (3) Chiết 3 lần theo thể tích dung môi thêm vào lần lượt là 4-3- 3 mL (20 phút/lần) * Khảo sát tỉ lệ mẫu và dung môi: Mẫu MMT và MIT được khảo sát với các khối lượng thay đổi giảm dần từ khoảng 1 gam, 0,1 gam và 0,02 gam. * Khảo sát độ thu hồi của quá trình chiết * Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu 2.2.3.2. Các điều kiện chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II * Đánh giá khả năng chiết của hai phương pháp: chiết rung siêu âm và chiết rung lắc. * Loại dung môi chiết: khảo sát với các dung môi ACN 100%, EtOH 100%, MeOH 100%. Hiệu suất chiết được sử dụng làm cơ sở chính so sánh, lựa chọn dung môi chiết phù hợp. * Khảo sát thời gian chiết: thời gian chiết được khảo sát với 5 mốc là 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút, 200 phút. * Khảo sát nhiệt độ chiết: khảo sát các mức nhiệt độ đươc gia nhiệt trong quá trình chiết là : 50°C, 60°C, 70°C. * Khảo sát số lần chiết * Khảo sát tỉ lệ mẫu và dung môi 2.2.4. Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều kiện hấp phụ tối ưu 2.2.4.1. Đặc trưng vật lý của vật liệu
10 Các thông số đặc trưng của vật liệu đã được xác định bằng các phương pháp hiện đại, độ tin cậy cao, kết quả đươc thể hiện thông qua: phổ FT-IR, phổ EDX, đường đẳng nhiệt hấp phụ - giải hấp N2, đường phân bố kích thước mao quản, biểu đồ diện tích bề mặt BET, đặc trưng thế Zeta phụ thuộc pH dung dịch hấp phụ. 2.2.4.2. Nghiên cứu các điều kiện hấp phụ tối ưu Các yếu tố cần khảo sát ảnh hưởng trong quá trình hấp phụ là: a) Khảo sát ảnh hưởng của lực ion đến hấp phụ: Thêm KCl với các giá trị nồng độ khác nhau vào dung dịch hấp phụ. b) Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch hấp phụ ban đầu: Sử dụng các dung dịch KOH 0,01M; KOH 0,005M; HCl 0,02M để điều chỉnh pH của dung dịch hấp phụ c) Khảo sát thời gian cân bằng hấp phụ: Pha các dung dịch nồng độ đầu khác nhau, khảo sát với thời gian hấp phụ khác nhau. Các điều kiện khác cố định gồm: thể tích dung dịch RHNS, pH dung dịch, nồng độ KCl. d) Đường hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir 2.2.4.3. Nghiên cứu điều kiện rửa giải chất màu 2.2.5. Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp Được tính theo công thức: UR(%)=tα,f . RSDR (%) (2.1) Trong đó: UR : Độ không đảm bảo đo tổng theo thu hồi (%) RSDR : Độ lệch chuẩn tương đối của độ thu hồi (%) tα,f: giá trị t-student tra bảng với mức ý nghĩa α = 0,05 f: Bậc tự do (f = n - 1) n : Số lần thử nghiệm 2.2.6. Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu
11 Hình 2.3: Quy trình xử lý mẫu Hình 2.4: Quy trình xử lý măng, miến, dưa muối chua, mẫu cá khô, bim bim, phấn thịt khô. hoa và mì tôm. (*) : Tùy thuộc vào chất cần phân tích là AO hay hỗn hợp Sudan I và Sudan II sẽ áp dụng điều kiện chiết tối ưu phù hợp Các mẫu lấy tại các quầy hàng tươi, khô trong chợ Long Biên gồm: 4 mẫu măng, 2 mẫu miến, 1 mẫu phấn hoa, 3 mẫu cá khô. Ngoài ra, các mẫu thực phẩm khác được lấy tại chợ Xanh (quận Cầu Giấy, Hà Nội), chợ Cầu Diễn (Nam Từ Liêm, Hà Nội) và chợ Trung Tâm (Thành phố Sơn La). Các bước xử lý mẫu được sơ đồ hóa theo 2 quy trình như Hình 2.3 và Hình 2.4. Có 2 quy trình xử lý mẫu khác nhau bởi vì trong quá trình thí nghiệm với dịch chiết 4 loại mẫu phấn hoa, cá khô, bim bim, mì tôm nếu đem pha loãng dịch chiết trực tiếp trong pha động tối ưu để phân tích HPLC sẽ có hiện tượng tạo huyền phù, có thể kết tủa gây tắc cột HPLC, nên so với sơ đồ 1 (Hình 2.3) thì sơ đồ 2 (Hình 2.4) cần xử lý thêm 2 bước: + Bước 1: dung dịch sau chiết được làm lạnh trong điều kiện tối và kín, sau đó lọc hỗn hợp qua giấy lọc băng xanh (loại bỏ tạp chất lơ lửng và nhất là lớp chất béo đóng trên bề mặt dịch chiết).
12 + Bước 2: phần dung dịch thu được sau bước 1 được hấp phụ bằng RHNS theo quy trình hấp phụ tối ưu đã nghiên cứu với chất chuẩn. Dịch giải hấp sau đó được pha loãng hợp lý, lọc qua syringe 0,22 µm sau đó đem phân tích trên hệ thống HPLC. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều kiện tối ưu phân tích Auramine O bằng HPLC Các thông số phù hợp của phép phân tích định lượng AO bằng phương pháp HPLC được tóm tắt trong Bảng 3.4. Bảng 3.4: Các điều kiện tối ưu phân tích AO bằng HPLC. Điều kiện phân tích Giá trị Loại cột C18-RP (150 mm × 4,6 mm, 100Å, 5 µm) - Waters Nhiệt độ cột 40°C Thể tích tiêm mẫu 20 µL Bước sóng 432 nm Pha động PBS (pH=3; 0,2% triethylamine) : ACN Thành phần pha động 65:35 (v/v) Tốc độ pha động 1,0 mL/phút Phương trình đường chuẩn mô tả sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ AO (µg/L): Y = (103,05 ± 0,96).X, với hệ số tương quan R2 = 0,9999. LOD=1,2 (µg/L); LOQ=3,9 (µg/L). Các giá trị này phù hợp với sắc ký đồ của các mẫu chuẩn có nồng độ từ 10,0 g/L AO để xây dựng đường chuẩn. 3.2. Điều kiện chiết Auramine O tối ưu từ mẫu thực phẩm Thực nghiệm cho thấy phương pháp chiết có sử dụng rung siêu âm cho hiệu suất thu hồi cao hơn nếu chỉ chiết bằng dung môi ở điều
13 kiện thường, do đó phương pháp này được áp dụng đối với tất cả các mẫu chiết về sau. Hình 3.7: Sự thay đổi hiệu suất chiết AO trung bình theo dung môi chiết Kết quả hiệu suất chiết khi khảo sát các loại dung môi chiết khác nhau được trình bày trong Hình 3.7. Sử dụng chuẩn Fisher để so sánh phương sai của hai tập số liệu chiết bằng hai dung môi MeOH:H2O (70:30 v/v) và EtOH:H2O (70:30 v/v) thấy rằng các giá trị tTN đều nhỏ hơn tLT nên chấp nhận hai giá trị trung bình của hiệu suất chiết bằng hai dung môi là không khác nhau. Vì vậy, dung môi EtOH:H2O (70:30 v/v) được chọn làm dung môi chiết cho các phép phân tích về sau vì tính chất ít độc hại của dung môi đối với các nhà phân tích và đối với môi trường. Kết quả khảo sát tỉ lệ mẫu và dung môi cho thấy đối với MMT và MIT thì khối lượng mẫu sử dụng để phân tích khoảng 0,1 gam/10 mL dung môi chiết là chấp nhận được (hiệu suất chiết mẫu giả đều trên 95%). Các kết quả nghiên cứu điều kiện chiết tối ưu khác bao gồm: số lần chiết là 2 lần, mỗi lần sử dụng 5,00 mL hỗn hợp dung môi trong thời gian 30 phút/lần ở nhiệt độ chiết duy trì 60°C.
14 Các kết quả xác định độ thu hồi AO trong các mẫu MIG và MAG cho thấy độ thu hồi của phương pháp chiết đều đạt theo AOAC và theo hội đồng Châu Âu (từ 80%÷110%), vậy kết luận phương pháp chiết là phù hợp để chiết AO từ 2 nền mẫu. Tuy nhiên, khi mở rộng phân tích các loại mẫu thực tế khác ngoài mẫu măng và mẫu miến, và mẫu dưa chua bao gồm: mẫu mì tôm, cá khô, phấn hoa. Nhận thấy rằng ứng với quy trình chiết và phân tích HPLC ở trên, thì các loại mẫu đó cho dịch chiết có hiện tượng tạo huyền phù khi pha trong pha động HPLC và có thể gây tắc cột sắc ký. Vì vậy, biện pháp sử dụng Nanosilica từ vỏ trấu để hấp phụ AO trong dịch chiết được đề xuất, sau đó AO được giải hấp phụ bằng pha động và được định lượng bằng HPLC. 3.3. Các điều kiện tối ưu hấp phụ AO trên nanosilica chế tạo từ vỏ trấu Kết quả thực nghiệm biểu diễn trên Hình 3.9 cho thấy hiệu suất hấp phụ AO cao nhất khi nồng độ chất điện li trơ KCl 5 mM, do đó KCl 5 mM là nồng độ tối ưu được lựa chọn cho các nghiên cứu hấp phụ tiếp theo. Sự phụ thuộc của hiệu suất hấp phụ AO vào pH của dung dịch được trình bày trên Hình 3.10 cho thấy sự giảm hiệu suất hấp phụ AO xảy ra rõ rệt khi pH dung dịch lớn hơn 5,0 chứng tỏ môi trường acid thuận lợi hơn cho sự hấp phụ AO trên RHNS và đạt hiệu suất cao nhất tại pH=4,0. Sự giảm nhẹ hiệu suất hấp phụ khi pH
15 phụ tiếp theo, thời gian cân bằng hấp phụ được chọn là 150 phút. Kết quả thực nghiệm dựa theo đường đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir xác định được dung lượng hấp phụ cực đại của AO trên RHNS là qm = 0,371 mg/g, hằng số hấp phụ KL = 1,843. Kết quả khảo sát thực nghiệm khi sử dụng dung môi pha động PĐ4 để rửa giải AO trên RHNS cho thấy thời gian tối ưu để lắc hỗn hợp là 10 phút/ lần, rửa giải 3 lần với thể tích dung môi lần lượt là 4/3/3 ml. 100 Hiệu suất hấp phụ (%) Hiệu suất hấp phụ (%) 80 60 40 20 0 0.01 0.1 1 0 5 10 100 Nồng độ KCl (mM) pH dung dịch Hình 3.9: Ảnh hưởng nồng độ Hình 3.10: Ảnh hưởng pH đến KCl đến sự hấp phụ AO. sự hấp phụ AO. 3.4. Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích AO Độ không đảm bảo đo của phương pháp: UR%=tα,f . RSDR %= t0,05;19.2,51=1,73.2,51=4,35%. Như vậy ở hàm lượng AO từ 10÷50 µg/L thì độ không đảm bảo đo của quy trình chiết – hấp phụ - giải hấp là 4,35% với độ tin cậy 95%. Điều này có nghĩa là các kết quả phân tích hàm lượng AO với độ lệch
16 AO trong các mẫu được trình bày trong bảng 3.18. Bảng 3.18: Hàm lượng AO trong các mẫu măng, miến, dưa chua Hàm lượng AO Hàm lượng AO STT Mẫu trong mẫu khô STT Mẫu trong mẫu khô (µg/g) (µg/g) 1 MA1 12,5 ± 0,2 8 MAK8 ND 2 MA2 0,8 ± 0,1 9 MI1 2,1 ± 0,1 3 MA3 1,7 ± 0,2 10 MI2 1,1 ± 0,2 1 4 MA4 ND 11 MI3 ND 5 MA5 ND 12 MD1 ND 6 MA6 ND 13 MD2 ND 7 MAK7 ND Nhận xét: Thời gian lưu AO của các mẫu thực tương đối ổn định (từ 3,74 phút đến 3,83 phút). Hàm lượng AO trong mẫu MA1 được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, do nếu cô đặc dịch chiết đường nền khá nhiễu và ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp xác định. Đối với sắc kí đồ MA6 dịch chiết gốc, có một đỉnh peak xuất hiện tại thời gian lưu 3,56 phút, tuy nhiên đây không phải peak của AO, thể hiện rằng khi thêm chuẩn AO, peak của AO xuất hiện sau (tại thời gian lưu 3,97 phút). Như vậy thành phần các chất trong mẫu thực có ảnh hưởng đến thời gian lưu của chất định phân dù trong cùng một điều kiện phân tích HPLC. Tiến hành phân tích với quy trình tương tự với các mẫu cá khô, phấn hoa, mì tôm còn lại. Kết quả phân tích được trình bày trong Bảng 1 ND : Không phát hiện AO trong mẫu
17 3.20. Bảng 3.20 Kết quả phân tích hàm lượng AO trong các mẫu mì tôm, phấn hoa, cá khô. Hàm lượng AO Hàm lượng AO STT Mẫu trong mẫu khô STT Mẫu trong mẫu khô (µg/g) (µg/g) 1 PH1 ND2 6 CK3 ND 2 PH2 ND 7 MT1 ND 3 PH3 0,82 ± 0,19 8 MT2 ND 4 CK1 ND 9 MT3 ND 5 CK2 ND Kết quả phân tích cho thấy hầu hết các mẫu phấn hoa, cá khô và mì tôm được phân tích không phát hiện chứa Auramine O. 3.6. Điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan bằng HPLC Các điều kiện tối ưu cho quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II được trình bày trong Bảng 3.23. Bảng 3.23: Các điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II bằng phương pháp HPLC. Điều kiện phân Giá trị tích Loại cột C18-RP (150 mm × 4,6 mm, 100Å, 5 µm) - Waters Nhiệt độ cột 40°C Thể tích tiêm mẫu 20 µL Bước sóng 490 nm 2 ND : Không phát hiện.
18 Pha động MeOH :H2O: ACN (77:3:20 v/v/v) Tốc độ pha động 1,0 mL/phút Khoảng tuyến tính, đường chuẩn, LOD và LOQ Các kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn trên mẫu chuẩn được trình bày trong Bảng 3.24 Bảng 3.24: Số liệu đường chuẩn và LOD, LOQ của hỗn hơp 2 Sudan chuẩn. Khoảng Chất Hệ số tuyến Phương trình LOD LOQ phân tương tính đường chuẩn (µg/L) (µg/L) tích quan R2 (µg/L) Sudan 2÷ S = (69,50 ± 0,9991 2,73 9,11 I 10000 0,32).C Sudan 5÷ S = (76,03 ± 0,9991 2,99 9,96 II 10000 0,39).C Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ các Sudan được thêm vào trên nền mẫu trắng đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.25. Bảng 3.25: Số liệu đường chuẩn và MDL, MQL trên nền mẫu trắng. Khoảng Chất Hệ số tuyến Phương trình MDL MQL phân tương tính đường chuẩn (µg/g) (µg/g) tích quan R2 (µg/L ) Sudan S= (69,17 ± 2÷10000 0,9994 0,0022 0,0074 I 0,59).C Sudan S= (75,70 ± 5÷10000 0,9991 0,0029 0,0096 II 0,37).C So sánh với số liệu LOD, LOQ của các công trình đưa ra trong Bảng 1.5 có thể thấy giới giạn phát hiện Sudan I của phương pháp tương đương với kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Thị Ngoan và