Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

79
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care cũng như đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc chẩn đoán phát hiện bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng. Bên cạnh đó, thông tin về các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các virus Care giúp cho việc sàng lọc và lựa chọn được chủng virus có tiềm năng trong sản xuất vacxin và các chế phẩm sinh học phục vụ công tác chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh Care.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN VĂN NÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà Nội - Năm 2017
Công trình được hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. NGUYỄN THỊ LAN 2. PGS. TS. NGUYỄN VĂN THANH Phản biện 1: PGS TS. PHẠM VĂN HOẠT BỘ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Phản biện 2: PGS.TS. TÔ LONG THÀNH TRUNG TÂM CHUẨN ĐOÁN THÚ Y TRUNG ƢƠNG Phản biện 3: TS. ĐẶNG THANH SƠN VIỆN THÚ Y Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào hồi giờ ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Lương Định Của - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thường xảy ra ở chó con, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao. Bệnh Care được biết tới là căn bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa đầu thế kỷ 19. Bệnh Care được báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and Gillespie, 1972). Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả lần đầu tiên vào năm 1809 bởi EdwardJenner (Appel and Gillespie, 1972); (Shell, 1990) và virus Care đã được phân lập vào năm 1905. Bệnh Care xảy ra rộng rãi trên toàn thế giới, xảy ra ở một số nước như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều nước ở châu Âu, gần đây nhất là ở các nước châu Á như Nhật Bản (Lan et al., 2006a), Thái Lan (Keawcharoen et al., 2005), Hàn Quốc (An et al., 2008) và Ấn Độ (Latha et al., 2007). Nguyên nhân gây bệnh Care trên chó là do virus Care (Canine distemper virus - CDV). CDV là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ Paramixoviridae. Các thành viên khác của giống Morbillivirus như virus gây bệnh sởi trên người (Measles virus - MV), virus dịch tả trâu bò (Rinderpest virus - RPV), virus gây bệnh trên động vật nhai lại nhỏ (Peste des petits ruminants virus - PPRV), virus gây bệnh trên động vật có vú dưới nước (cá heo, hải cẩu) (Murphy et al., 1999). Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang dã ăn thịt và hổ (Appel et al., 1994); (Frölich et al., 2000); (Martella et al., 2002). Virus Care có cấu tạo gồm một sợi RNA đơn không phân đoạn gồm khoảng 15.690 nucleotide. Trong cấu trúc bộ gene gồm 6 gene mã hóa cho các protein như protein tạo lớp vỏ bọc (M), hai glycoprotein (yếu tố kết dính (H), yếu tố kết hợp virus với thụ thể trên màng tế bào (F)), hai protein có liên quan tới sự sao chép RNA (phosphoprotein – P và large protein – L) và nucleocapsid N đóng gói RNA của virus (Sidhu et al., 1993). Dựa trên trình tự của protein Haemagglutinin (H), Harder and Osterhaus, (1997) và Martella et al., (2006) đã phân loại virus Care thành 7 nhóm chính theo ví trí địa lý gồm: Arctic – like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife. CDV là virus gây nhiễm hướng lympho, niêm mạc và mô thần kinh. Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân lập CDV trên các môi trường như dòng tế bào biểu mô và nguyên bào sợi, tế bào lympho của chó (Appel et al., 1992), đại thực bào phế nang của chó (Appel, 1978), đại thực bào màng bụng chồn sương (Poste, 1971), xơ phôi gà (Ezeibe, 2005). Tuy nhiên việc phân lập và xác định hiệu giá virus Care rất khó khăn do không có dòng tế bào nào thích hợp để virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào. Qua nghiên cứu của Seki et al. (2003) và Lan et al. (2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus. Ở Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920. Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ chết 50-80%, có thể lên đến 100% nếu không được điều 1
trị kịp thời (Hồ Đình Chúc, 1993). Cho đến nay, bệnh Care xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn cho đàn chó nuôi trong nước do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006). Nhưng các nghiên cứu về bệnh lý, đặc tính sinh học và di truyền của virus Care ở trong nước còn rất khiêm tốn, bên cạnh đó hiệu quả bảo hộ của các vacxin phòng bệnh Care đang lưu hành hiện nay chưa cao cũng như chưa có nhiều báo cáo cụ thể. Xuất phát từ thực tiễn đó, trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc Care, đồng thời nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa rất quan trọng giúp các bác sỹ thú y cơ sở tại các phòng mạch hay cơ quan nghiên cứu trong việc chẩn đoán bệnh dựa vào đặc điểm bệnh lý đặc trưng của bệnh và lựa chọn được nguồn mẫu bệnh phẩm phục vụ cho việc chọn chủng virus chế vacxin phòng bệnh hiệu quả, chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh Care gây ra cho đàn chó nuôi ở trong nước. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định được một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care cũng như đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc chẩn đoán phát hiện bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng. Bên cạnh đó, thông tin về các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các virus Care giúp cho việc sàng lọc và lựa chọn được chủng virus có tiềm năng trong sản xuất vacxin và các chế phẩm sinh học phục vụ công tác chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh Care. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tượng nghiên cứu là chó mắc bệnh Care, mẫu virus Care phân lập được từ các chó mắc bệnh Care - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2014 tới tháng 12/2016 - Địa điểm nghiên cứu: + Bệnh viện thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam + Bộ môn bệnh lý thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam + Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và có hệ thống về đặc điểm bệnh lý bệnh Care ở chó và đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus phân lập được từ 6 giống chó (3-6 tháng tuổi) mắc bệnh Care thu thập từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu về bệnh Care ở chó trong các trường, viện nghiên cứu chuyên ngành thú y. Đây cũng là tư liệu khoa học quý báu và cần thiết cho những người làm công 2
tác thú y cơ sở về bệnh Care. Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống virus Care phân lập được có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho các bước đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn gene quốc gia. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus Care đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. 5 chủng virus phân lập được có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất vacxin hoặc chế tạo kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 2.1.1. Tình hình nghiên cứu ở trong nƣớc Nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care được thực hiện bởi các tác giả như: Hồ Đình Chúc (1993); Lê Thị Tài (2006); Tô Du và Xuân Giao (2006); Lan et al., (2008); Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam (2012); Nguyễn Thị Lan và cs., (2015). Nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care được thực hiện bởi các tác giả như: Nguyễn Thị Lan và cs. (2012); Lan et al., (2008); Lan et al., (2009a). 2.1.2. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nƣớc Nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care được thực hiện bởi các tác giả như: Appel (1969), McCullough et al., (1974); Miry et al. (1983); (Shell, 1990); Summers and Appel, (1994); Maeda et al., (1994); (Bittegeko et al., 1994); (Baumgärtner et al., 1995); Appel and Summers, (1995); Grone et al., (2003); Amude et al., (2006); Amude et al., (2007); Kubo et al. (2007); Del Puerto et al. (2010). Nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care được thực hiện bởi các tác giả như: Appel et al., (1992); Appel, (1978); Poste, (1971); Carpenter et al., (1992); Haas et al., (1997); Harder and Osterhaus, (1997); Iwatsuki et al., (1997); Mochizuki et al., (1999); von Messling et al., (2001); Seki et al., (2003); Hirama et al., (2004); Ezeibe, (2005); Martella et al., (2006); Lan et al., (2005a; 2005b; 2005c; 2006a; 2006b; 2007; 2008; 2009a; 2009b); Tan et al., (2011); Guo et al., (2013). 3
2.2. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE 2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care Canine Distemper Virus (CDV) là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ Paramixoviridae. 2.2.2. Hình thái của virus Care Hình thái virus quan sát được thấy dưới kính hiển vi điện tử có hình vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi cuộn quanh tròn mà thành. Dạng tròn này có đường kính đo được 115nm đến 230nm. Màng cuộn kép có độ dày 75 đến 85Ao với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy et al., 1989). 2.2.3. Cấu trúc của virus Care Virus Care không phân đoạn, sợi âm tính, sợi đơn, với bộ gene RNA ước chừng khoảng 15,7 Kb và có vỏ bọc với đường kính có kích thước từ 150 tới 300 nm (Murphy et al., 1999). 2.2.4. Sức đề kháng của virus Care Virus Care là một virus không ổn định và nhạy cảm với nhiệt độ, tia UV, dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và chất ôxy hóa (Gröne et al., 1998) mặc dù nó có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngoài. 2.2.5. Cơ chế sinh bệnh Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hướng mô lympho, niêm mạc và mô thần kinh. Đầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hô hấp. Sau đó virus nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết. Virus tác động đến nội mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày. Virus theo máu vào hệ hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như dây thần kinh thị giác. Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do các nhiễm trùng nặng trong phủ tạng. 2.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care Nghiên cứu của Seki et al., (2003) đã làm rõ những đặc tính sinh trưởng khác nhau khi gây nhiễm các CDV lên tế bào Vero và tế bào Vero-DST. Qua đó, có thể nhận thấy, tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus (Lan et al., 2005a; 2005b; 2006b). 2.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care Cấu trúc của virus Care gồm 1 protein không cấu trúc (C) và 6 protein cấu trúc gồm: Large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M). (Diallo, 1990). Phân loại theo địa lý của virus Care dựa trên trình tự của protein H (Harder and Osterhaus, 1997) gồm 7 nhóm chính: Arctic – like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife. 2.3. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE 2.3.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care Bệnh Care xuất hiện trên toàn thế giới. Trong tự nhiên tất cả các giống chó đều cảm thụ với virus Care, nhưng chó ngoại mẫn cảm hơn chó nội. Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang dã ăn thịt (Appel et al., 1994). Trong 4
tự nhiên hầu hết xảy ra ở chó từ 2 đến 12 tháng tuổi, nhiều nhất là chó từ 3 đến 6 tháng tuổi. Bệnh xảy ra quanh năm nhưng xuất hiện nhiều khi có sự thay đổi thời tiết đặc biệt là những ngày mưa, độ ẩm cao. Ở Việt Nam, bệnh thường diễn ra vào thời điểm giao mùa, từ xuân sang hè. Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ chết 50 - 80%, thậm chí lên đến 100% nếu không điều trị kịp thời (Hồ Đình Chúc, 1993). 2.3.2. Triệu chứng bệnh tích Triệu chứng của bệnh thường liên quan tới hệ thống hô hấp, tiêu hóa và hệ thống thần kinh. Bệnh Care thường có đặc điểm sốt hai giai đoạn, kèm theo tiết dịch ở mắt – mũi, sau đó là dịch mủ, chán ăn, viêm kết mạc, viêm phế quản, viêm phổi, viêm dạ dày ruột, và triệu chứng thần kinh (Summers and Appel, 1994). Theo Appel and Summers (1995) bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm sừng hoá ở mõm và gan bàn chân. 2.3.3. Chẩn đoán bệnh Care Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh, triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán bệnh Care. Trong phòng thí nghiệm có thể áp dụng các phương pháp như xét nghiệm máu, tìm thể Lents, chẩn đoán virus học, ELISA, nhuộm hóa mô miễn dịch, miễn dịch huỳnh quang, RT-PCR, kit chẩn đoán nhanh. 2.3.4. Phòng và điều trị bệnh Phòng bệnh bằng vệ sinh và tiêm phòng vacxin. Điều trị bằng dùng kháng huyết thanh: liều 15 – 30 ml/con, tiêm sớm. Khi con vật đã có triệu chứng viêm phổi hay triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh không có hiệu lực. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Bệnh viện thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Bộ môn bệnh lý thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Thời gian: từ tháng 6/2014 tới 12/2016 3.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Chó mắc bệnh Care, mẫu virus Care phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm của chó mắc bệnh Care được thu thập từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định. 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu - Dụng cụ, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: Bể ổn nhiệt, máy đúc chuyển mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính hiển vi quang học, máy xét nghiệm huyết học tự động CELL-DYN 3700, tủ ấm nuôi cấy tế bào (5% CO2), kính hiển vi soi nổi, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR, máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000. 5
- Hóa chất phục vụ nghiên cứu: Formol 10%, parafin, xylen, thuốc nhuộm Hematoxilin – Eosin, dòng tế bào Vero-DST; DMEM, 10% FBS, dung dịch đệm EDTA, kháng sinh; kit tách chiết RNA, DNA tổng số, cặp mồi gene H và P, kit phản ứng RT-PCR và PCR, đệm TBE hoặc TAE, agarose, hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR sequence và kit chạy giải trình tự gene, kit ELISA. 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.4.1. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu một số triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu sự thay đổi về chỉ tiêu máu của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật hóa mô miễn dịch để xác định sự phân bố của virus Care trên các cơ quan tổ chức của chó bệnh 3.4.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của của những chủng virus Care phân lập đƣợc - Nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân lập được - Nghiên cứu xác định hiệu giá virus của những chủng virus Care phân lập được - Nghiên cứu xác định quy luật nhân lên của những chủng virus Care phân lập được - Nghiên cứu về tính kháng nguyên của những chủng virus Care phân lập được 3.4.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của những chủng virus Care phân lập đƣợc - Nghiên cứu giải trình tự gene của những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide của những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu so sánh trình tự amino acid của những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu so sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ phát sinh loài 3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣơng pháp khám lâm sàng Nhiệt độ cơ thể được đo bằng nhiệt kế thủy ngân, ở trực tràng, ngày 2 lần vào lúc 7 giờ sáng và 5 giờ chiều. Tần số hô hấp được kiểm tra bằng phương pháp quan sát, thông qua sự lên xuống của các cơ vùng ngực. Tần số tim được đo bằng ống nghe đếm nhịp tim trong một phút. 6
3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể Chó bệnh được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, được mổ khám nhằm bộc lộ các cơ quan trong xoang ngực, xoang bụng, xoang chậu, hộp sọ và não,… để quan sát. 3.5.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) thường quy tại phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 3.5.4. Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch Phương pháp nhuộm hoá miễn dịch tổ chức có quy trình tẩm đúc bằng paraffin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Các bước thực hiện chính gồm: làm sạch tiêu bản; hoạt hóa enzyme; khử peroxydase nội sinh; gắn kháng thể; gắn kháng kháng thể; bổ sung cơ chất; nhuộm nhân tế bào và đọc kết quả. 3.5.5. Phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý máu Lấy 2ml máu/con, đưa vào ống bảo quản có chứa chất chống đông, sau đó phân tích các chỉ tiêu sinh lý máu bằng máy đếm huyết học Cell-Dyn 3700. 3.5.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào Dòng tế bào Vero-DST được nuôi cấy trên môi trường DMEM có bổ sung 10% FCS và 5% CO2. 3.5.7. Phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST Mẫu bệnh phẩm được nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau đó được đồng nhất trong dung dịch MEM. Tiến hành ly tâm tốc độ cao và lọc hỗn dịch bệnh phẩm. Hút bỏ môi trường nuôi cấy ở các đĩa lồng tế bào đã chuẩn bị và bổ sung 100 µl hỗn dịch bệnh phẩm. Tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 30 phút. Bổ sung 1,5 ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose Phosphate Broth) vào đĩa lồng và để ở 370C với 5% CO2. Hàng ngày theo dõi sự phá hủy tế bào bằng kính hiển vi soi nổi và thu virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% - 90% diện tích đáy của đĩa lồng. 3.5.8. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) TCID50 xác định theo phương pháp Behrens-Karber (Lan et al., 2005a). 3.5.9. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus Gây nhiễm virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST với MOI = 0,01. Xác định hiệu giá virus tự do và virus nằm trong tế bào ở các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 96 giờ sau gây nhiễm virus. Đường biểu diễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log10 của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus. 3.5.10. Phƣơng pháp xác định tính kháng nguyên của virus Care Hỗn dịch kháng nguyên virus Care sau khi được vô hoạt bằng formaldehyde (35%), kiểm tra vô hoạt và thuần khiết, sau đó được trộn với Al(OH)3 10% theo tỷ lệ 1:1. Hỗn dịch này được tiêm cho 6 chó becgie với 2 mũi tiêm cách nhau 28 ngày. Sau 21 ngày tiêm mũi cuối tiến hành công cường độc bằng chủng virus CDV-HUA-04H với liều 100 LD50. Theo dõi triệu chứng lâm sàng, mẫu máu và 7
dịch swab của chó thí nghiệm được lấy ở các ngày 4, 7, 10, 14, 21 để kiểm tra huyết thanh học và phân lập virus. 3.5.11. Phƣơng pháp ELISA Các bước thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ kit ELISA Ingezime MOQUILLO IgG 1.5.CDG.K1 của hãng Ingenasa (Tây Ban Nha) nhằm phát hiện kháng thể trong huyết thanh. 3.5.12. Phƣơng pháp RT-PCR và PCR Mẫu RNA tổng số sau khi được tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR bằng bộ kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, Đức) với các bước thực hiện theo hướng dẫn đi kèm. 3.5.13. Phƣơng pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR, chạy phản ứng PCR sequence rồi tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR sequence, sau đó đưa vào máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter SEQ 8000. Dữ liệu các trình tự gene thu được trên máy giải trình tự gene được kiểm tra bằng chương trình Blast trên ngân hàng gene thế giới. Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene của chủng virus thu nhận bằng phần mềm Genetyx (version 5.0.4) và MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) version 6.0. Sử dụng phương pháp test Maximum likehood với giá trị bootstrap là 1000 đơn vị với các chủng tham chiếu được lấy từ ngân hàng gene thế giới. 3.5.14. Xử lý số liệu Các số liệu thu thập được gồm thân nhiệt, tần số hô hấp, tần số tim và các chỉ tiêu máu được tính toán các giá trị trung bình (Mean) và sai số chuẩn (SE) bằng phần mềm Minitab version 16.2.4. Sử dụng phương pháp thống kê phân tích phương sai (ANOVA/One Way) với phương pháp Tukey của phần mềm Mintab version 16.2.4 nhằm chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các số liệu thu thập được. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE 4.1.1. Kết quả chẩn đoán chó mắc bệnh Care bằng phƣơng pháp RT-PCR Nghiên cứu đã tiến hành lấy dịch swab của 68 chó trong nghiên cứu để chẩn đoán bằng RT-PCR (với bệnh Care) và PCR (với bệnh Parvovirrus) nhằm sàng lọc được các chó chỉ mắc bệnh Care. Kết quả chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR và PCR được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR và PCR Parvovirus CDV Mẫu bệnh phẩm Dịch swab Dịch swab Số mẫu dương tính 0/68 68/68 Tỷ lệ dương tính (%) 0,0 100,0 8
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy tất cả 68/68 mẫu dịch swab được lấy từ các chó bệnh đều cho kết quả dương tính với virus Care, âm tính với Parvovirus khi chẩn đoán bằng phản ứng RT-PCR với đoạn gene P. Kết quả chẩn đoán này khẳng định chắc chắn 68 chó nghiên cứu chỉ mắc bệnh Care. 4.1.2. Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care Sau khi theo dõi, quan sát và ghi chép các biểu hiện khác thường trên 68 chó mắc bệnh Care, một số triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó được trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care Số chó Số chó có STT Triệu chứng lâm sàng nghiên cứu biểu hiện Tỷ lệ (%) (con) (con) 1 Biếng ăn, ủ rũ 68 68 100,0 2 Sốt 68 68 100,0 3 Dử mắt 68 68 100,0 4 Nôn mửa 68 66 97,06 5 Ho 68 54 79,41 6 Dử mũi 68 54 79,41 7 Ỉa chảy 68 52 76,47 8 Sừng hóa gan bàn chân 68 28 41,18 9 Nốt sài 68 22 32,35 10 Triệu chứng thần kinh 68 8 11,76 Qua bảng 4.2, nhận thấy các chó mắc Care có những triệu chứng điển hình như biếng ăn, ủ rũ, sốt, ho, ỉa chảy màu cà phê, nôn mửa, có các nốt sài ở vùng da mỏng (hình 4.1), gan bàn chân cứng và sưng (hình 4.2), có dử mắt, dử mũi nhiều, ở giai đoạn cuối của bệnh một số con có triệu chứng thần kinh. Trong đó, các triệu chứng xuất hiện với tỷ lệ cao như biếng ăn, ủ rũ, sốt, có dử mắt chiếm 100%, nôn mửa chiếm 97,06%, sau đó là các triệu chứng như ho, có dử mũi và ỉa chảy với tỷ lệ lần lượt là 79,41%; 79,41% và 76,47% và chiếm tỷ lệ ít nhất là những con chó có biểu hiện thần kinh với tỷ lệ 11,76%. Nốt sài được coi là một chỉ tiêu để chẩn đoán lâm sàng chó mắc bệnh Care một cách chính xác nhưng qua kết quả quan sát thì tỷ lệ xuất hiện chỉ là 32,35%. Khi xem xét triệu chứng lâm sàng ở 68 chó nghiên cứu, nhận thấy triệu chứng lâm sàng có sự tương đồng giữa các giống chó nội và chó ngoại. Điều này cho thấy chó ở các giống chó khác nhau đều có thể mắc bệnh Care với biểu hiện triệu chứng tương đối giống nhau. Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra được triệu chứng lâm sàng của bệnh Care trên 68 chó nghiên cứu là đặc trưng và điển hình cho chó mắc bệnh Care ở độ tuổi 3-6 tháng tuổi. Thông tin về triệu chứng lâm sàng thu được trong nghiên cứu này sẽ giúp các bác sỹ thú y làm lâm sàng có thể chẩn đoán được chó mắc bệnh Care dựa vào các triệu chứng điển hình của bệnh. 9
Một số hình ảnh minh họa triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care Hình 4.1. Chó mắc bệnh Care có Hình 4.2. Chó mắc bệnh Care có các nốt sài ở vùng da mỏng. gan bàn chân sƣng, cứng 4.1.3. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng của các giống chó mắc bệnh Care Sau khi quan sát triệu chứng lâm sàng trên 68 chó mắc bệnh Care, tiến hành xác định một số chỉ tiêu lâm sàng trên các chó bệnh và so sánh với chó khỏe mạnh. Kết quả theo dõi ở giống chó Phú Quốc và Rottweiler được trình bày ở bảng 4.3 và 4.4 đã cho thấy có sự thay đổi về các chỉ tiêu lâm sàng so với chó khỏe mạnh đối chứng với sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Trong đó: Thân nhiệt: chó mắc bệnh có biểu hiện sốt cao với thân nhiệt dao động từ 40,23 (giống chó lai Becgie) tới 40,590C (giống chó H’Mông Cộc). Tần số hô hấp: chó bệnh có biểu hiện thở nhanh và nông hơn chó khỏe mạnh với tần số hô hấp dao động từ 71,83 (lần/phút) (giống chó Rottweiler) tới 78,94 (lần/phút) (giống chó Phú Quốc). Tần số tim: ở các chó bệnh thì tần số tim mạch tăng hơn so với chó khỏe với tần số tim dao động từ 118,88 (lần/phút) (giống chó Fox) tới 130,75 (lần/phút) (giống chó Rottweiler). Bảng 4.3. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care Chó khỏe (n = 8) Chó bệnh (n = 8) Chỉ tiêu theo dõi Mean  SE Mean  SE Thân nhiệt (0C) 38,94 ± 0,04 40,46 ± 0,06* Tần số hô hấp (lần/ phút) 38,06 ± 0,33 78,94 ± 0,37* Tần số tim mạch (lần/ phút) 97,19 ± 0,32 129,19 ± 0,42* Ghi chú: Mean là giá trị trung bình; SE là sai số chuẩn; *: khác nhau có ý nghĩa thống kê với giá trị P < 0,05 10
Bảng 4.4. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care Chó khỏe (n = 12) Chó bệnh (n = 12) Chỉ tiêu theo dõi Mean  SE Mean  SE 0 Thân nhiệt ( C) 38,78 ± 0,05 40,33 ± 0,05* Tần số hô hấp (lần/ phút) 39,33 ± 0,32 71,83 ± 0,44* Tần số tim mạch (lần/ phút) 93,67 ± 0,36 130,75 ± 0,58* Ghi chú: Mean là giá trị trung bình; SE là sai số chuẩn; *: khác nhau có ý nghĩa thống kê với giá trị P < 0,05 4.1.4. Kết quả nghiên cứu sự thay đổi về chỉ tiêu máu của các giống chó mắc bệnh Care Kết quả đếm số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, tỷ lệ các loại bạch cầu bằng máy đo chỉ tiêu huyết học của giống chó Phú Quốc được trình bày ở bảng từ 4.5. Khi xem xét ở các giống chó thì có sự thay đổi về các chỉ tiêu máu như sau: Số lượng hồng cầu: Ở những chó bệnh, số lượng hồng cầu trung bình là từ 3,80 tới 4,26 (106/µl), đều giảm so với chó khoẻ. Trên lâm sàng, có thể điều này có thể do con vật bị mất máu như xuất huyết, tiêu chảy ra máu kèm theo sốt cao trong viêm phổi. Hàm lượng huyết sắc tố: nhận thấy hàm lượng huyết sắc tố ở chó bệnh là từ 110,81 tới 123,81 (g/l), giảm so với chó khỏe. Tỷ khối hồng cầu: Tỷ khối hồng cầu của chó bệnh trung bình là từ 32,59% tới 34,18% giảm so với chó khỏe. Chỉ tiêu này cũng giảm tương quan thuận với sự giảm số lượng hồng cầu, điều này cho thấy ở đây hiện tượng giảm số lượng hồng cầu là do mất máu là chủ yếu. Thể tích trung bình hồng cầu: Thể tích trung bình hồng cầu ở nhóm chó bệnh là từ 46,20 tới 47,74 (fl) giảm so với chó khoẻ. Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu ở chó bệnh là từ 17,88 tới 18,65 pg giảm so với lô chó khỏe. Nồng độ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu ở chó khỏe giảm xuống còn từ 133,96 (g/l) tới 138,01 (g/l) ở chó bệnh. Như vậy sự biến đổi chỉ tiêu lượng huyết sắc tố trung bình và nồng độ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu ở chó bệnh là rất đáng chú ý. Các chỉ tiêu này nói đến sự thiếu máu ở chó bệnh do sốt cao và xuất huyết. Số lượng bạch cầu: ở lô chó bệnh số lượng bạch cầu là từ 4,67 tới 4,87 3 (10 /ml) máu, giảm so với lô chó khỏe. Sự giảm bạch cầu trên lâm sàng có thể do con vật bị viêm, nhiễm trùng cấp tính dẫn tới sự suy giảm nghiêm trọng số lượng bạch cầu. Ở chó bệnh, tỷ lệ các loại bạch cầu thay đổi rõ rệt so với lô chó khỏe ở các loại bạch cầu như: Tỷ lệ bạch cầu ái toan; bạch cầu ái kiềm; bạch cầu đơn nhân; lâm ba cầu ở lô chó bệnh giảm so với lô chó khỏe. Chỉ có tỷ lệ bạch cầu trung tính ở chó bệnh tăng nhẹ so với chó khỏe. Trên lâm sàng, sự gia tăng số lượng bạch cầu trung tính chứng tỏ chó đang bị nhiễm trùng điều này có thể được giải thích do cơ chế sinh bệnh của bệnh Care. 11
Bảng 4.5. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care Chó khoẻ Chó bệnh Chỉ tiêu xét nghiệm (n = 8) (n = 8) Mean  SE Mean  SE 6 Số lượng hồng cầu (10 /µl) 5,85 ± 0,04 3,80 ± 0,06* Hàm lượng huyết sắc tố (g/l) 153,06 ± 1,42 121,89 ± 0,80* Tỷ khối hồng cầu (%) 40,22 ± 0,06 33,97 ± 0,05* Thể tích trung bình hồng cầu (fl) 62,32 ± 0,05 46,48 ± 0,13* Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (pg) 23,00 ± 0,10 18,12 ± 0,05* Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (g/l) 334,70 ± 0,78 137,74 ± 0,73* Số lượng bạch cầu (103/ml) 9,52 ± 0,05 4,78 ± 0,04* Bạch cầu ái toan (%) 6,32 ± 0,03 5,75 ± 0,04* Bạch cầu ái kiềm (%) 0,54 ± 0,05 0,45 ± 0,06 Bạch cầu đa nhân trung tính (%) 58,19 ± 0,07 63,28 ± 0,05* Bạch cầu đơn nhân (%) 4,89 ± 0,07 3,66 ± 0,03* Lâm ba cầu (%) 30,06 ± 0,14 26,86 ± 0,10* Ghi chú: Mean là giá trị trung bình; SE là sai số chuẩn; *: khác nhau có ý nghĩa thống kê với giá trị P < 0,05 4.1.5. Biến đổi bệnh lý đại thể của chó mắc bệnh Care Kết quả các biến đổi đại thể chủ yếu của chó mắc bệnh Care đã được thể hiện trong bảng 4.6. Bảng 4.6. Các tổn thƣơng đại thể ở chó mắc Care Số con Số con Tỷ lệ Cơ quan Chỉ tiêu nghiên cứu nghiên có tổn (%) cứu thương Viêm phổi thùy 68 54 79,41 Phổi Viêm phế quản phổi 68 54 79,41 Phổi xuất huyết 68 58 85,29 Ruột viêm, xuất huyết 68 62 91,18 Ruột Sung huyết ở ruột non 68 60 88,24 Hạch Hạch lympho sưng to, xuất 68 68 100,0 lympho huyết Gan Gan sưng, xuất huyết 68 60 88,24 Thận Thận sưng, xuất huyết 68 40 58,82 Lách Lách nhồi huyết, sưng to 68 48 70,59 Tim Tim nhão, xuất huyết 68 11 16,18 Não Não sung huyết 68 4 5,88 12
Qua kết quả được trình bày ở bảng 4.6, nhận thấy bệnh tích đại thể của các chó nghiên cứu tập trung chủ yếu ở các cơ quan như hạch lympho, phổi, ruột, gan, lách, thận, tim và não. Ở hạch lympho, tổn thương chủ yếu quan sát được là sưng to, xuất huyết chiếm tỷ lệ 100% trong 68 ca mổ khám. Các hạch lympho như hạch vùng đầu cổ, hạch dưới hàm và hạch màng treo ruột sưng to, rìa tù, cứng, xuất huyết làm cho hạch đỏ sẫm từng vùng hoặc toàn bộ ở hầu hết các chó nghiên cứu. Ở phổi, bệnh tích chủ yếu là phổi xuất huyết (hình 4.3), viêm phổi thùy, viêm phế quản phổi chiếm tỷ lệ lần lượt là 85,29%, 79,41% và 79,41%. Kết quả nghiên cứu này là phù hợp với triệu chứng lâm sàng quan sát được trên các chó với biểu hiện là ho nhiều và có nhiều dịch mũi chảy ra. Bệnh tích ở đường tiêu hóa thể hiện sung huyết ở ruột viêm, xuất huyết (91,18%); sung huyết ở ruột non (88,24%) (hình 4.4) và gan sưng và xuất huyết (88,24%). Kết quả nghiên cứu phù hợp với bệnh tích sung huyết, xuất huyết ở ruột chó khi được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus Care cường độc (Nguyễn Thị Lan và cs., 2015). Bệnh tích ở não biểu hiện là não sung huyết chiếm tỷ lệ 5,88% là thấp nhất trong các bệnh tích quan sát được trên 68 chó mắc bệnh Care. Khi xem xét bệnh tích đại thể ở 68 chó nghiên cứu ở các giống chó khác nhau thì bệnh tích đều tập trung chủ yếu ở các cơ quan như hạch lympho, phổi và ruột. Điều này cho thấy sự phân bố và tập trung của virus trong các cơ quan khác nhau là hoàn toàn khác nhau. Ngoài ra, một số tổn thương khác cũng được quan sát thấy khi mổ khám như lách nhồi huyết, sưng to chiếm tỷ lệ 70,59%; thận sưng, xuất huyết chiếm tỷ lệ 58,82%. Bệnh tích trên tim chiếm tỷ lệ thấp nhất lần lượt là 16,18%. Một số hình ảnh minh họa bệnh tích đại thể của chó mắc bệnh Care Hình 4.3. Xuất huyết phổi ở chó Hình 4.4. Ruột bị sung huyết ở chó mắc bệnh Care mắc bệnh Care 4.1.6. Biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care Kết quả quan sát những biến đổi bệnh lý vi thể trên kính hiển vi quang học được chụp ảnh và tổng hợp thông tin ở bảng 4.7. 13
Bảng 4.7. Biến đổi vi thể ở một số cơ quan của chó mắc bệnh Care Các tổn thương Thâm Số Hoại tử tế Thoái hóa Sung huyết Xuất huyết nhiễm tế Cơ block bào tế bào bào viêm quan nghiên cứu Số Số Số Số Số Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ blo blo blo blo blo (%) (%) (%) (%) (%) ck ck ck ck ck Phổi 12 12 100,0 10 83,33 3 25,0 4 33,33 12 100,0 Gan 12 12 100,0 4 33,33 0 0,0 8 66,67 12 100,0 Thận 12 12 100,0 8 66,67 2 16,67 10 83,33 10 83,33 Lách 12 12 100,0 9 75,0 8 66,67 12 100,0 11 91,67 Tim 12 7 58,33 6 50,0 4 33,33 5 41,67 9 75,0 Não 12 1 8,33 0 0,0 0 0,0 2 16,67 2 16,67 Hạch 12 12 100,0 12 100,0 7 58,33 9 75,0 12 100,0 lympho Ruột 12 12 100,0 12 100,0 12 100,0 12 100,0 12 100,0 non Ruột 12 11 91,67 12 100,0 3 25,0 10 83,33 11 91,67 già Kết quả ở bảng 4.7 cho thấy tỷ lệ có tổn thương sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm chiếm tỷ lệ cao hơn so với các tổn thương khác. Đặc biệt các cơ quan như ruột non, ruột già, phổi và hạch lympho là những cơ quan có tổn thương vi thể chiếm tỷ lệ cao hơn so với các cơ quan khác trong các cơ quan được nghiên cứu. Ở phổi có tổn thương sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm chiếm chiếm tỷ lệ 100%; xuất huyết chiếm tỷ lệ 83,33%; hoại tử tế bào và thoái hóa tế bào chỉ chiếm tỷ lệ lần lượt là 25,0% và 33,33%. Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể trên phổi khác với nghiên cứu của Lan et al., (2005b; 2006a; 2007), chỉ ra bệnh tích ở phổi là xuất hiện nhiều ổ viêm phổi, viêm phổi thùy và xuất hiện thể bao hàm (ái toan) trong nguyên sinh chất của các tế bào biểu mô phế quản hoặc phế nang. Hạch lympho có các tổn thương sung huyết, xuất huyết và thâm nhiễm tế bào viêm chiếm tỷ lệ 100%; thoái hóa tế bào chiếm tỷ lệ 75,0% và hoại tử tế bào chiếm 58,33%. Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể trên hạch lympho có sự sai khác với kết quả nghiên cứu của Lan et al., (2005b; 2006a; 2007) khi so sánh về bệnh tích thoái hóa và hoại tử tế bào chiếm tỷ lệ thấp hơn với kết quả nghiên cứu trước đây của Lan et al., (2005b; 2006a; 2007) chỉ ra bệnh tích vi thể chủ yếu ở các chó mắc bệnh Care là sự suy giảm tế bào lympho. Ở ruột: cả ruột non và ruột già đều có tổn thương sung huyết, xuất huyết, thoái hóa tế bào và thâm nhiễm tế bào viêm với tỷ lệ dao động trong khoảng 91,67% - 100%; riêng ở ruột già thì tổn thương hoại tử tế bào chỉ chiếm 25,0% thấp hơn rất nhiều so với ở ruột non là 100%. Kết quả nghiên 14
cứu có sự sai khác với nghiên cứu của Lan et al., (2005b; 2006a; 2007) về bệnh tích vi thể chủ yếu ở ruột chó mắc bệnh là viêm ruột cata; xuất hiện thể bao hàm trong nguyên sinh chất ở biểu mô ruột. Não là cơ quan có tổn thương vi thể chiếm tỷ lệ thấp nhất trong các cơ quan được nghiên cứu, tổn thương thâm nhiễm tế bào viêm, thoái hóa tế bào chiếm tỷ lệ 16,67%; hiện tượng sung huyết chiếm tỷ lệ 8,33%; không xuất hiện các tổn thương như xuất huyết và hoại tử tế bào. Kết quả nghiên cứu có sự sai khác với kết quả nghiên cứu của Lan et al., (2005b; 2006a; 2007) khi chỉ ra bệnh tích vi thể chủ yếu ở não là tổn thương tế bào myelin; viêm não thể mạn tính, xuất hiện thể bao hàm. Kết quả nghiên cứu về bệnh tích trên các cơ quan như gan, thận và lách có sự sai khác với nghiên cứu của Lan et al., (2005b; 2006a; 2007; 2008) và Nguyễn Thị Lan và cs., (2015) khi chỉ ra được các bệnh tích xuất hiện trên các cơ quan trên. Một số hình ảnh minh họa biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care Hình 4.5. Viêm phế quản phổi Hình 4.6. Lông nhung ruột đứt nát (HE. 10X) (HE. 10X) 4.1.7. Kết quả ứng dụng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định sự phân bố virus Care trên các cơ quan tổ chức của chó bệnh Tiến hành lựa chọn mẫu phổi, hạch phổi, ruột, hạch ruột, lách từ 68 chó mắc bệnh Care để làm hóa mô miễn dịch. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8. Kết quả ở bảng 4.8 cho thấy mức độ dương tính có sự sai khác giữa các cơ quan khi chẩn đoán bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch. Trong đó, mức độ dương tính ở tiêu bản phổi, ruột, hạch phổi và hạch ruột là cao hơn so với lách. Kết quả nghiên cứu về sự phân bố của virus bằng nhuộm hóa mô miễn dịch là tương đối phù hợp với kết quả quan sát được trên bệnh tích vi thể và đại thể của 68 chó nghiên cứu. Như vậy, khi chẩn đoán bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch để chẩn đoán chó mắc Care nên chọn 3 loại mẫu bệnh phẩm gồm phổi, ruột, hạch lympho. 15
Bảng 4.8. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch Kết quả chẩn đoán bằng nhuộm hóa mô miễn dịch (n = 68) STT Tỷ lệ dƣơng tính (%) Âm tính (+) (++) (+++) Phổi 0,0 10,29 57,35 32,35 Hạch phổi 0,0 27,94 47,06 25,0 Ruột 11,76 42,65 33,82 11,76 Hạch ruột 22,06 14,71 45,59 17,65 Lách 36,76 54,41 8,82 0,0 Chú thích: (-) : Âm tính (+) : Dương tính mức độ I (Có các đám nâu vàng nhưng mức độ rải rác) (++) : Dương tính mức độ II (Có các đám nâu vàng với mức độ trung bình) (+++) : Dương tính mức độ III (Có các đám rải rác với mức độ dày đặc) Một số hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch Hình 4.7. Hóa miễn dịch dƣơng Hình 4.8. Hóa miễn dịch dƣơng tính tại phổi (IHC. 40X) tính tại hạch lympho (IHC. 10X) 4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC 4.2.1. Thông tin của những chủng virus Care phân lập đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 5 chủng virus Care được lựa chọn đại diện cho 5 địa phương nghiên cứu có thông tin chi tiết được trình bày ở bảng 4.9. Bảng 4.9. Thông tin của các chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu Kí hiệu chó Năm Cơ quan Địa phương STT Chủng virus Care nghiên cứu phân phân lập phân lập lập 1 CDV-VNUA-768 ND03 Phổi Nam Định 2015 2 CDV-HUA-02H TB06 Hạch phổi Thái Bình 2015 3 CDV-HUA-03R HY08 Ruột Hưng Yên 2015 4 CDV-HUA-04H HN09 Hạch phổi Hà Nội 2015 5 CDV-HUA-05P BG10 Phổi Bắc Giang 2015 16
Qua bảng 4.9, thông tin chi tiết của 5 chủng virus Care nghiên cứu được lựa chọn từ các chó mắc bệnh Care được phân lập từ thực địa. Các mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập virus đã được chẩn đoán dương tính với virus Care bằng phương pháp RT-PCR và nhuộm hóa mô miễn dịch. 4.2.2. Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân lập đƣợc Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của 5 chủng virus Care và chủng virus vacxin Onderstepoort trên môi trường tế bào Vero- DST được trình bày ở bảng 4.10. Bảng 4.10. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của 5 chủng virus Care và chủng virus vacxin Onderstepoort CPE (%) STT Virus 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 1 CDV-VNUA-768 5 25 55 90 100 B 2 CDV-HUA-02H 5 20 50 80 95 100 B 3 CDV-HUA-03R 5 30 45 80 95 100 B 4 CDV-HUA-04H 5 25 50 90 100 B 5 CDV-HUA-05P 10 30 55 80 95 100 B 6 Onderstepoort 20* 40 60 90 100 B Chú thích: 20*%: số % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích bề mặt nuôi cấy B: Tế bào bong tróc hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy hpi: hour post inoculation (giờ sau gây nhiễm virus) Phân tích kết quả ở bảng 4.10 cho thấy 5 chủng virus được lựa chọn nghiên cứu gây bệnh tích tế bào sớm, điển hình và phá hủy tế bào hoàn toàn rất giống với chủng virus vacxin với biểu hiện là thời gian xuất hiện bệnh tích sớm sau 24 giờ gây nhiễm với biểu hiện gây bệnh tích kiểu syncytium - thể hợp bào với các tế bào co cụm lại, màng tế bào bị tan rã, các nhân co cụm lại và thời gian hủy hoại hoàn toàn tế bào diễn ra nhanh, sau 60-72 giờ gây nhiễm các chủng virus này CPE đạt 95 - 100%, lúc này không còn cụm tế bào nào bám vào đáy bình, các tế bào đều đã bị tan vỡ bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy, các tế bào đều bị phá hủy. 4.2.3. Hiệu giá của những chủng virus Care phân lập đƣợc Bên cạnh việc khảo sát khả năng gây bệnh tích tế bào, cũng tiến hành kiểm tra hiệu quá virus, kết quả được trình bày ở bảng 4.11. 17
Bảng 4.11. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu Hiệu giá virus STT Chủng virus (Log TCID50/25µl) 1 CDV-VNUA-768 3,16 x 104 2 CDV-HUA-02H 3,16 x 105 3 CDV-HUA-03R 5,83 x 104 4 CDV-HUA-04H 6,25 x 105 5 CDV-HUA-05P 3,16 x 105 Bảng 4.11 cho thấy 5 chủng virus phân lập được có hiệu giá cao và thích nghi tốt trên môi trường tế bào Vero-DST. 4.2.4. Nghiên cứu xác định biểu đồ tăng trƣởng của những chủng virus Care phân lập đƣợc Kết quả minh họa đường biểu diễn của một số chủng virus so sánh với chủng vacxin được trình bày ở hình 4.9, 4.10. Hình 4.9. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-VNUA-768 và chủng virus vacxin Onderstepoort Hình 4.10. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-05P và chủng virus vacxin Onderstepoort Qua kết quả ở hình 4.9, 4.10 nhận thấy các chủng virus Care có đặc điểm chung đó là hàm lượng virus tập trung ở trong tế bào luôn cao hơn so với hàm lượng virus tập trung ở ngoài tế bào qua các thời điểm thu khác nhau thì khác nhau ở từng virus. Đồng thời, các chủng virus này có đường biểu diễn sự nhân 18