Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan trong nước trong kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:33

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm tạo được chitosan khối lượng phân tử thấp, tan trong nước và có khả năng kháng bệnh thán thư hại rau quả (xoài, chuối, ớt) từ chitosan bằng phương pháp cắt mạch bởi hydrogen peroxide. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan trong nước trong kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ----------------------------- LÊ THANH LONG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHITOSAN TAN TRONG NƯỚC TRONG KHÁNG NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN XOÀI, CHUỐI, ỚT SAU THU HOẠCH Chuyên ngành : Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số : 9540105 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2019
Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG Trường Đại học Nha Trang 2. PGS.TS. VŨ NGỌC BỘI Trường Đại học Nha Trang Phản biện 1: GS.TS NGUYỄN THỊ HIỀN Đại học Bách Khoa Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS NGUYỄN DUY THỊNH Đại học Bách Khoa Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS HOÀNG THỊ LỆ HẰNG Viện Nghiên cứu Rau quả Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án Trường Đại học Nha Trang vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng …… năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Trường Đại học Nha Trang
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan trong nước trong kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch. Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: Lê Thanh Long Khoá: 2012 Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Trang Sĩ Trung 2. PGS.TS. Vũ Ngọc Bội Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án đã đạt được một số kết quả mới đóng góp vào lĩnh vực nghiên cứu: 1) Luận án đã xác định điều kiện cắt mạch chitosan thương mại độ deacetyl 85 - 90% bằng H2O2 thu hồi chitosan hòa tan trong nước (WSC) đạt hiệu suất cao nhất: nồng độ H2O2 5,4%, nhiệt độ 47,1oC và thời gian 3,4 giờ với hiệu suất thu hồi đạt 85,6 ± 2,5%. WSC có khối lượng phân tử trung bình là 31,5 KDa và cấu trúc có cấu trúc mạch phân tử hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu. 2) Luận án đã phân lập và định danh được 3 loài nấm: C. gloeosporioides L2 từ xoài, C. musae D1 từ chuối và C. capsici B4 từ ớt gây bệnh thán thư điển hình. Trong đó, 2 chủng C. gloeosporioides L2 từ xoài và C. musae D1 từ chuối có mối quan hệ di truyền gần. 3) Luận án đã đánh giá khả năng kháng nấm C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 gây bệnh thán thư điển hình tương ứng trên xoài, chuối và ớt sau thu hoạch ở điều kiện in vitro của WSC. Kết quả cho thấy WSC ức chế mạnh sự phát triển 3 chủng C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 trên môi trường rắn PDA và môi trường lỏng PDB. WSC đã gây ức chế và biến đổi hình thái rõ rệt sự nãy mầm các bào tử nấm C. gloeosporioides L2 C. musae D1 và C. capsici B4. 4) Luận án đã đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư điển hình tương ứng trên xoài, chuối và ớt sau thu hoạch ở điều kiện in vivo của WSC. WSC có tác dụng khống chế rõ rệt sự hình thành và phát triển vết bệnh bệnh thán thư sau thu hoạch do nấm C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 lây bệnh nhân tạo tương ứng trên xoài, chuối và ớt. Đồng thời, việc xử lý WSC cho biểu hiện kích kháng rõ rệt thông qua sự thay đổi hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase và tích lũy các hợp chất phenolic trên mô vỏ quả. 5) Luận án đã đánh giá tác dụng bảo quản bằng xử lý tạo màng bởi WSC với nồng độ 0,5 - 2% trên xoài, chuối và 0,25 - 1% trên ớt sau thu hoạch. Màng WSC đã thể hiện 1
khả năng làm chậm các biến đổi hoá lý (hao hụt khối lượng, biến đổi độ cứng và cường độ màu), sinh hoá (chất khô hoà tan, acid tổng số, cường độ hô hấp và sinh etylen) giúp kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch xoài, chuối và ớt ở nhiệt độ 25 - 28oC. Kết quả nghiên cứu là cơ sở đề xuất ứng dụng dẫn xuất chitosan tan trong nước trong bảo quản xoài, chuối và ớt sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH PGS.TS. Trang Sĩ Trung PGS.TS. Vũ Ngọc Bội Lê Thanh Long 2
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Lê Thanh Long, Hà Thị Thuý, Trang Sĩ Trung, Vũ Ngọc Bội (2013). Nghiên cứu khả năng kháng bệnh thán thư trên xoài bằng chitosan hoà tan trong nước. Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 334-339. 2. Lê Thanh Long, Trang Si Trung, Vu Ngoc Boi (2015). Optimization of chitosan hydrolysis for making water-soluble chitosan and its antifungal ability against postharvest anthracnose from mango. Acta Horticulturae 1088, ISHS, 371-376. 3. Lê Thanh Long, Nguyễn Thị Thủy Tiên, Trần Thị Thu Hà, Nguyễn Hiền Trang, Trang Sĩ Trung, Vũ Ngọc Bội (2015). Ảnh hưởng của chitosan tan trong nước đến nấm thán thư Colletotrichum gloeosporioides L2 ở điều kiện in vivo và biến đổi sinh hoá của xoài sau thu hoạch. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 4, 207-214. 4. Lê Thanh Long, Nguyễn Văn Toản, Nguyễn Văn Huế, Trang Sĩ Trung, Vũ Ngọc Bội (2016). Nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan hoà tan trong nước đến nấm Colletotrichum musae D1 gây bệnh thán thư trên chuối ở điều kiện in vitro. Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 119, 5, 56-65. 5. Le Thanh Long, Le Van Tan, Vu Ngoc Boi, Trang Si Trung (2018). Antifungal activity of water-soluble chitosan against Colletotrichum capsici in postharvest chili pepper. Journal of Food Processing and Preservation, 42 (1). DOI: 10.1111/jfpp.13339. 3
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của Luận án Chitosan, sản phẩm deacetyl của chitin, là một polymer tự nhiên không độc hại với nhiều đặc tính sinh học quan trọng như: tương hợp sinh học, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hoá, kích thích cơ chế phòng vệ ở thực vật... nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống như trong thực phẩm, y dược, nông nghiệp, bảo vệ môi trường,... Tuy vậy, chitosan có trọng lượng phân tử lớn, chỉ hòa tan trong môi trường acid và khi tan tạo ra dung dịch có độ nhớt cao nên khó sử dụng trong thực tế. Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy từ chitosan có thể thủy phân tạo thành chitosan có trọng lượng phân tử nhỏ với nhiều nhóm NH2 tự do và hòa tan trong nước. Do đặc điểm trên, chitosan có khối lượng phân tử nhỏ có nhiều đặc tính sinh học cao hơn chitosan như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kích thích sinh trưởng nên được sử dụng trong nhiều lĩnh vực hơn, đặc biệt là trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng và bảo quản rau quả sau thu hoạch. Hiện có một số phương pháp cắt mạch chitosan tạo ra chitosan trọng lượng phân tử nhỏ, hòa tan trong nước như phương pháp hóa học, phương pháp sử dụng enzyme, ... Trong đó, phương pháp cắt mạch bằng hóa học hiện đang được nhiều nhà khoa học sử dụng do có lợi thế là dễ ứng dụng ở qui mô công nghiệp và thời gian thủy phân ngắn. Bệnh thán thư là bệnh phổ biến và gây hại nghiêm trọng trên một số rau quả sau thu hoạch (xoài, chuối, đu đủ, cà chua, ớt...) do nấm bệnh Colletotrichum spp. gây nên. Chúng gây nên những tổn thương các mô tế bào trên vỏ quả và thối gây ảnh hưởng lớn đến giá trị cảm quan, dinh dưỡng sản phẩm rau quả sau thu hoạch. Để khống chế bệnh thán thư phát triển trên rau quả sau thu hoạch, người ta thường xử lý rau quả bằng các loại thuốc diệt nấm tổng hợp như Imazalil, Benomyl, ... dẫn tới việc lạm dụng thuốc hoá học gây nên mối nguy đối với sức khỏe của người tiêu dùng cũng như gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường. Để khắc phục tình trạng lạm dụng hóa chất, các nhà nghiên cứu đang quan tâm đến các tác nhân sinh học, có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại, có hoạt tính kháng nấm phòng trừ bệnh thán thư trên rau quả,... Trong đó, chitosan và đặc biệt là chitosan khối lượng phân tử thấp đã được một số nhà nghiên cứu rất quan tâm. Chitosan khối lượng phân tử thấp có khả năng kháng nấm cao và dễ tạo màng bám trên rau quả nên giúp hạn chế sự biến đổi sau thu hoạch và kéo dài thời gian bảo quản rau quả. Vì vậy, luận án “Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan trong nước trong kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch” theo hướng nghiên cứu tạo ra chitosan khối lượng phân tử thấp, 4
tan trong nước và có khả năng kháng bệnh thán thư hại rau quả (xoài, chuối, ớt) từ chitosan bằng phương pháp cắt mạch bởi hydrogen peroxide có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao. Kết quả nghiên cứu sẽ minh chứng và bổ sung vào cơ sở lý thuyết về sản xuất dẫn xuất tan trong nước có hoạt tính sinh học cao từ chitosan và khả năng kháng bệnh thán thư của nó trên một số loại rau quả điển hình (xoài, chuối, ớt), kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch. 2. Mục tiêu của Luận án Tạo được chitosan khối lượng phân tử thấp, tan trong nước và có khả năng kháng bệnh thán thư hại rau quả (xoài, chuối, ớt) từ chitosan bằng phương pháp cắt mạch bởi hydrogen peroxide. 3. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 3.1. Vật liệu Chitosan thương mại có độ deacetyl trung bình (DD = 85 - 90). Nấm bệnh Colletotrichum spp. phân lập từ các mẫu xoài, chuối, ớt có vết bệnh thán thư điển hình. Xoài thuộc 2 giống xoài cát Hoà Lộc và cát Chu, chuối giống chuối tiêu AAA (Musa cavendish) và tiêu hồng, ớt thuộc giống ớt sừng trâu (Capsicum annuum). 3.2. Phạm vi nghiên cứu (1) Nghiên cứu tối ưu hoá quá trình thu nhận WSC (water soluble chitosan) từ chitosan bằng phương pháp sử dụng H2O2 để phân cắt. (2) Phân lập và định danh một số chủng Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối và ớt sau thu hoạch. (3) Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch bằng chế phẩm WSC ở điều kiện in vitro và in vivo. (4) Đánh giá khả năng bảo quản xoài, chuối và ớt sau thu hoạch bằng xử lý tạo màng WSC. 4. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp phân tích, nghiên cứu hiện đại: Phân tử lượng trung bình (Mw) của chitosan được xác định thông qua độ nhớt và tính theo công thức Mark–Houwink theo No và cộng sự (2003); Phổ hấp phụ hồng ngoại (FTIR) đo trên máy Vertex 70, Brucker; Định danh nấm bệnh ở cấp độ loài bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS (White et al., 1990; Kosuke et al., 2012) và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng bệnh thán thư thông qua cây quan hệ phát sinh loài (phylogenetic tree) theo phương pháp Neighbour-Joining (Saitou và Nei, 1987); Đánh giá khả năng kháng nấm ở điều kiện in vitro thông qua sự phát triển trên môi trường nhân tạo (Cronin et al., 1996; Al-Hetar et al., 5
2011); Đánh giá khả năng kháng nấm ở điều kiện in vivo trên quả thông qua thay đổi hoạt độ enzyme kháng ngoại bào ở vỏ quả được lây bệnh nhân tạo (Abeles & Forrence, 1970; Dai et al., 2011); Xác định biến đổi các chỉ tiêu lý hoá và sinh hoá bằng các phương pháp và thiết bị hiện đại (thiết bị đo độ cứng Shimpo, đo cường độ màu NF 333- Nippon Densoku, đo nồng độ khí CO2 kiểu ICA 250/ICA và đo hàm lượng etylen ICA56). Các kết quả thí nghiệm đều được xử lý thống kê, kiểm định so sánh các giá trị trung bình bằng phần mềm SAS; thiết kế thí nghiệm, phân tích dữ liệu, xây dựng mô hình bậc hai và tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert; cây quan hệ phát sinh loài bằng phần mềm MEGA. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Luận án - Ý nghĩa khoa học: Lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa việc thu nhận WSC từ chitosan thương mại bằng phương pháp cắt mạch sử dụng hydrogen peroxide và sử dụng WSC để kháng bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) nhằm kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch xoài, chuối và ớt. Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ minh chứng và bổ sung lý thuyết về kỹ thuật sản xuất chitosan tan trong nước, có hoạt tính sinh học kháng bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án là tiền đề để các doanh nghiệp sử dụng WSC trong phòng chống bệnh thán thư nhằm kéo dài thời gian bảo quản rau quả sau thu hoạch - đây chính là cơ sở để tạo ra một nền nông nghiệp “sạch” bền vững hướng tới đẩy mạnh xuất khẩu rau quả. 6. Kết cấu của Luận án Luận án gồm 146 trang, bao gồm 3 trang mở đầu, 31 trang tổng quan, 17 trang phương pháp nghiên cứu, 90 trang kết quả nghiên cứu, 2 trang kết luận, 26 bảng, 90 hình, 220 tài liệu tham khảo (39 tài liệu tiếng Việt, 181 tài liệu tiếng Anh) và 79 trang phụ lục. 6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ WSC (WATER SOLUBLE CHITOSAN) 1.1.1. Khái quát về chitosan và WSC Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, một loại polymer sinh học phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Chitosan dễ tan trong dung dịch HCl, acid lactic, acid acetic loãng và một số acid hữu cơ khác, không tan trong cồn, môi trường trung tính và kiềm. Độ hòa tan của chitosan là một thông số rất khó kiểm soát, bởi vì nó phụ thuộc nhiều vào mức độ deacetyl hóa, khối lượng phân tử, nồng độ ion, pH, sự phân bố của các nhóm acetyl trong mạch polymer của chitosan, cũng như phương pháp, điều kiện tách chiết, thu hồi và sấy chitosan. Khác với chitosan, sản phẩm thủy phân của chitosan có thể hòa tan trong nước do mạch phân tử ngắn và có mặt của các nhóm NH2 tự do có trong các mắt xích D-glucosamine. Tùy thuộc mức độ polymer hóa (DP) của quá trình thủy phân chitosan có thể chia sản phẩm thủy phân chitosan thành 2 loại: chitosan có khối lượng phân tử thấp (low molecular weight chitosan-LMWC) và chitosan oligosaccharides (oligochitosan). Oligochitosan có khả năng hòa tan trong nước tốt hơn LMWC do có độ DP thấp hơn (thường DP từ 2 - 10, khối lượng phân tử dưới 10 kDa), tuy nhiên việc phân biệt LMWC và oligochitosan thông qua DP không rõ ràng. 1.1.2. Các phương pháp thuỷ phân cắt mạch chitosan Chitosan có thể bị thuỷ phân cắt mạch bằng các tác nhân vật lý, hoá học và enzyme. Để điều chế LMWC và oligochitosan, 2 phương pháp hóa học và enzyme đã được nghiên cứu, ứng dụng phổ biến. Trong đó, phương pháp thủy phân bằng hóa học đang được sử dụng chủ yếu ở qui mô công nghiệp. Phương pháp thủy phân cắt mạch chitosan bằng enzyme có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp hóa học và vật lý nhờ giảm thiểu khả năng biến đổi hóa học không có lợi và tăng hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân. Tuy vậy, do tính đặc hiệu và chi phí chiết rút các enzyme có khả năng thuỷ phân chitosan như quá đắt nên khó ứng dụng vào thực tế sản xuất qui mô lớn. Với phương pháp hóa học, có thể sử dụng các acid vô cơ (HCl, HNO3, H3PO4), acid hữu cơ (acid acetic) để sản xuất LMWC và oligochitosan từ chitosan. Mặc dù được áp dụng phổ biến ở qui mô công nghiệp để sản xuất LMWC và oligochitosan nhưng phương pháp này có một số nhược điểm như: tạo ra một số chất độc ảnh hưởng không tốt đến môi trường, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp và ít nhiều ảnh hưởng đến cấu trúc sản phẩm thủy phân. 7
Hydrogen peroxide (H2O2), một tác nhân oxy hóa mạnh có khả năng phân cắt liên kết β-1,4 glycoside trong mạch cấu trúc chitosan với cơ chế đã được nghiên cứu và lý giải. H2O2 không bền trong môi trường trung tính và kiềm, dễ bị phân hủy theo phản ứng toả nhiệt tạo thành nước và oxy phân tử và nên phương pháp này ít ảnh hưởng đến môi trường, có thể sử dụng trực tiếp sản phẩm thủy phân một cách an toàn. Tuy nhiên, trong điều kiện nhiệt độ phản ứng và nồng độ H2O2 quá cao, thời gian kéo dài việc phân cắt chitosan bằng H2O2 sẽ gia tăng tỷ lệ các monosaccharides của chitosan làm giảm hoạt tính sản phẩm. Ngoài ra việc thay đổi cấu trúc chitosan như hình thành các gốc cacboxyl và loại bỏ gốc amin cũng cần xem xét khi lựa chọn điều kiện phản ứng cắt mạch bằng H2O2. 1.1.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kích kháng của chitosan Với cấu trúc là một amino-polysaccharides ở dạng hoà tan trong các trong các dung môi khác nhau chitosan thể hiện như một polycation với nhiều hoạt tính sinh học và hoá lý đặc biệt. Chitosan và các dẫn xuất có chức năng kép độc đáo: kháng vi sinh vật (kháng khuẩn, kháng nấm và virút) và kích thích các cơ chế bảo vệ ở tế bào thực vật. Ngoài ra chúng còn được xem như các loại thuốc diệt nấm có hiệu quả trong việc ức chế nảy mầm bào tử, ngăn sự kéo dài ống mầm, làm chậm tăng trưởng sợi nấm và hạn chế sản sinh độc tố của nấm bệnh. Đã có một số cơ chế được đề xuất giải thích cho hoạt tính kháng vi sinh vật của chitosan và các dẫn xuất. Cơ chế được chấp nhận phổ biến dựa trên tương tác giữa các nhóm tích điện dương trên phân tử chitosan và các nhóm tích điện âm trên màng ngoài vách tế bào vi sinh vật dẫn đến những thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng sinh chất, gây ra sự rò rỉ các thành phần có bản chất protein và các thành phần khác trong nội bào, làm thay đổi các chức năng sinh hóa và sinh lý của vi sinh vật dẫn đến mất khả năng tái tạo và gây chết vi sinh vật. Bên cạnh đó, với vai trò như một chất keo hấp phụ có chọn lọc và lấy đi các ion kim loại quan trọng ở tế bào vi sinh vật, gây ức chế sự phát triển và hạn chế sản sinh các độc tố của vi sinh vật. Chitosan với khối lượng phân tử thấp có thể xâm nhập vào tế bào chất của vi sinh vật và thông qua liên kết của chúng với DNA (polyanion), gây ức chế quá trình phiên mã tổng hợp mRNA và protein tế bào. Ngoài các cơ chế trên, chitosan với chức năng của một chất kích kháng (elicitor) ngoại bào liên quan đến các phản ứng phòng vệ của tế bào vật chủ chống lại sự tấn công của các tác nhân gây bệnh trên rau quả. Chitosan kích hoạt tế bào mô chủ bị nhiễm bệnh tích luỹ các protein liên quan đến kháng bệnh (pathogenesis-related proteins_PRs) như chitinases và β-1,3-glucanase có khả 8
năng kháng trực tiếp tác nhân nấm bệnh xâm nhập; sinh tổng hợp phenylalanine ammonia- lyase (PAL) tham gia trong chuỗi phản ứng tích luỹ phytoalexins và các hợp chất phenolic làm bền thành tế bào; polyphenoloxydase và peroxidase (POD) có khả năng oxy hoá hợp chất phenolic tạo các dẫn xuất quinone có tính độc với tế bào nấm bệnh. 1.2. KHÁI QUÁT VỀ NGUỒN GỐC, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ BỆNH SAU THU HOẠCH THƯỜNG GẶP TRÊN XOÀI, CHUỐI VÀ ỚT Xoài là cây ăn quả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Các tác nhân gây bệnh trên xoài có thể gây ra bệnh ở lá, rễ, thân cây và bệnh trên quả sau thu hoạch. Bệnh sau thu hoạch trên xoài là kết quả của sự lây nhiễm của quả trước khi nó được chế biến hay đến tay người tiêu dùng. Một số bệnh phổ biến sau thu hoạch trên xoài gồm: bệnh thán thư, thối cuống, đốm đen do vi khuẩn, thối mốc đen, đốm đen Alternaria, thối nhũn do vi khuẩn. Chuối là cây ăn quả được trồng chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới. Trên chuối tác nhân gây bệnh sau thu hoạch khá đa dạng, có nguồn gốc từ nấm, VK và vi rút, lây nhiễm và phát triển bệnh trên quả có thể xảy ra trước và sau thu hoạch. Bệnh xâm nhập âm thầm vào quả qua vỏ hay từ các vết tổn thương và bùng phát mạnh gây thối hỏng khi quả chín. Một số bệnh phổ biến xuất hiện trên chuối sau thu hoạch gồm: thán thư, thối cuống, thối đen đầu quả, rỗ bề mặt, đốm đen Sigatoka. Ớt là một loại rau gia vị có chứa nhiều thành phần có giá trị dược lý dinh dưỡng quan trọng. Bệnh hại trên ớt do VK, nấm và virut thường phát triển mạnh trên thân, lá lây nhiễm vào quả trong thời gian cận thu hoạch, phát triển nhanh khi quả chín gây thối hỏng. Một số bệnh thường xuất hiện trên ớt sau thu hoạch gồm: bệnh thán thư, đốm vòng Alternaria, thối nhũn do VK, thối mốc đen Cladosposporium, bệnh thối mốc xám. 1.3. NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN XOÀI, CHUỐI VÀ ỚT SAU THU HOẠCH Bệnh thán thư (Anthracnose) trên xoài, chuối và ớt sau thu hoạch do các loài Colletotrichum spp. gây ra thuộc ngành nấm đảm Ascomycota, lớp nấm bất toàn Deuteromycetes. Thán thư là một trong 10 loại bệnh phổ biến nhất trên nhiều loại rau quả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Colletotrichum gloeosporioides Penz cho đến nay là loài thường xuất hiện với phạm vi ký chủ rộng nhất. Bên cạnh C. gloeosporioides, những loài Colletotrichum như C. acutatum, C. capsici, C. nigrum, C. coccodes, C. musae, C. 9
falcatum, C. dematium .v.v.. có thể gây hại đặc trưng trên mỗi loại ký chủ hoặc cộng sinh cùng với C. gloeosporioides. Bệnh thán thư hại xoài do nấm C. gloeosporioides (Penz.) gây ra. Mầm bệnh có thể lây lan ở cả hai dạng sinh sản: vô tính và hữu tính, giai đoạn hữu tính là Colletotrichum cingulata, thuộc lớp nấm túi. Bệnh thán thư hại chuối là do nấm C. musae (Berk. & Curt.) còn gọi là Gloeosporium musarum (Cooke & Masse) hoặc Myxosporium musae (Berk. & Curt). Giai đoạn hữu tính là Glomerella cingulata, thuộc lớp nấm túi. Trên thế giới phát hiện ra 13 loài trong chi Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt, trong số đó hai loài nấm C. nigrum và C. capsici là điển hình và gây bệnh phổ biến trên nhiều giống ớt. Nấm bệnh thán thư phần lớn xâm nhập vào quả bằng bào tử (thông qua sinh sản vô tính). Trước khi xâm nhập, bào tử phải tiếp xúc với bề mặt ký chủ. Gặp điều kiện thuận lợi (ẩm độ, nhiệt độ), bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm và xâm nhập vào bên trong mô quả bằng các con đường: qua các vết thương trên bề mặt quả, các lỗ khí khổng (xâm nhập trực tiếp) và qua các lớp biểu bì của vỏ quả. Colletotrichum spp. thuộc nhóm nấm hoại dưỡng (necrotrophic). Trong quá trình xâm nhập nấm Colletotrichum thường sản sinh các enzyme và các độc tố nhằm phá hủy và trích rút dinh dưỡng từ tế bào vật chủ chết. Tuy nhiên trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhập, Colletotrichum spp. lại tấn công và phát triển ký sinh trên tế bào vật chủ như một nấm sinh dưỡng (biotrophic). Quá trình sinh dưỡng này thường không kéo dài lâu nên còn gọi là loài nấm bán sinh dưỡng (hemibiotrophic), sau đó sẽ phát triển sang giai đoạn hoại dưỡng. Việc kiểm soát bệnh thán thư do Colletotrichum spp. gây hại trên xoài, chuối, ớt thường kết hợp biện pháp phòng ngừa và các biện pháp bằng vật lý, hoá học, sinh học thích hợp. Trong đó xử lý hoá chất vẫn đang là biện pháp phổ biến hiện nay. Nhìn chung, việc ứng dụng chitosan và các dẫn xuất trong phòng trừ bệnh sau thu hoạch đang được quan tâm nhằm hạn chế tác động xấu của xử lý hoá chất đến sức khoẻ và môi trường. Các nghiên cứu khả năng kháng bệnh thán thư hại rau quả sau thu hoạch (xoài, chuối, ớt) của dẫn xuất WSC cũng như hiệu quả bảo quản là khá mới, chưa được công bố. 10
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Chitosan được cung cấp bởi Công ty TNHH Hùng Tiến, Tp Cần Thơ có dạng bột, màu trắng ngà; độ deacetyl (DD): 85 - 90%; Nitơ tổng số: 5,84%; tro toàn phần: 0,09%; độ tan: >97 %; cặn tro không tan trong HCl: 0,1%. Nấm bệnh Colletotrichum spp. phân lập từ các mẫu xoài, chuối, ớt được thu thập tại chợ trên trên địa bàn Tp Huế, vườn thực nghiệm thuộc Công ty giống cây trồng TT Huế và tại các vườn hộ gia đình trên địa bàn tỉnh TT Huế. Mẫu xoài cho TN thuộc 2 giống xoài cát Hoà Lộc và cát Chu (Mangifera indica). Mẫu chuối sử dụng cho phân lập nấm bệnh thuộc nhóm chuối tiêu AAA (Musa cavendish), mẫu cho các TN khác thuộc giống chuối tiêu hồng. Ớt sử dụng trong nghiên cứu là giống ớt sừng trâu (Capsicum annuum) được trồng phổ biến ở miền Trung. Tất cả các TN được tiến hành ở các PTN thuộc Khoa Cơ khí Công nghệ - Đại học Nông lâm Huế và Viện Tài nguyên và Công nghệ sinh học - ĐH Huế. Kết quả định danh các chủng nấm thán thư bằng kỹ thuật sinh học phân tử được thực hiện tại Lab of Microbial Ecology, Faculty of Agriculture, Kyoto University. Một số chỉ tiêu được phân tích tại Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm TT Huế. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu cắt mạch chitosan tạo WSC bằng tác nhân H2O2 - Chitosan tinh sạch bằng acid acetic được cắt mạch bằng H2O2 với các điều kiện (nồng độ H2O2, nhiệt độ và thời gian) khác nhau trong bể ổn nhiệt, lắc tốc độ 120 rpm. WSC thu hồi sau khi tách phần không tan ở pH = 7, kết tủa bằng ethanol 99,5% ở 2 - 5oC, lọc và sấy ở 40 - 50oC trong thiết bị sấy chân không. - Tối ưu hóa quá trình cắt mạch thu WSC theo phương pháp bề mặt đáp ứng, phương án kế hoạch trực giao cấp hai với mô hình Box- Behnken (Weska et al., 2007; Du et al., 2009). Xác định phân tử lượng trung bình (Mw) của chitosan theo công thức Mark-Houwink (No et al., 2003). Phổ hấp phụ hồng ngoại (FTIR) đo trên máy Vertex 70, Brucker. 2.2.2. Phương pháp phân lập, tuyển chọn và định danh nấm thán thư hại xoài, chuối, ớt - Phân lập, giám định nấm Colletotrichum sp. theo qui trình của Burgess và cs (2009) - Định danh nấm bệnh ở cấp độ loài bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS (White et al., 1990; Kosuke et al., 2012) và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng bệnh thán thư thông qua cây quan hệ phát sinh loài theo phương pháp Neighbour-Joining (Saitou và Nei, 1987). 11
2.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư của WSC - Xác định thời gian nảy mầm của bào tử nấm Colletotrichum spp. theo phương pháp của Cronin và cs (1996). - Đánh giá ảnh hưởng của WSC đến sự phát triển của Colletotrichum spp. trong môi trường PDA & PDB theo phương pháp của Al-Hetar và cs (2011). - Xác định ngưỡng gây bệnh của Colletotrichum spp. trên quả bằng lây bệnh nhân tạo theo phương pháp của Munoz và cs (2011). - Đánh giá ảnh hưởng của WSC đến sự phát triển Colletotrichum spp. trên quả bằng lây bệnh nhân tạo theo phương pháp của Xiangchun và cs (2012) - Xác định hoạt độ β-1,3-glucanase theo phương pháp của Abeles & Forrence (1970) - Xác định hoạt độ chitinase theo phương pháp của Dai và cs (2011) - Xác định polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Cicalteau (Fu et al., 2011) 2.2.4. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của xử lý tạo màng WSC đến những biến sinh lý, sinh hoá của xoài, chuối, ớt trong quá trình bảo quản - Hao hụt khối lượng tự nhiên được xác định bằng cách cân (độ chính xác 10-4g) - Độ cứng quả được xác định bằng thiết bị đo độ cứng của hãng Shimpo - Màu sắc của vỏ quả theo hệ thống Cielab được xác định bằng thiết bị đo cường độ màu NF 333, Nippon Densoku (X-Rite, 2004; Silva et al., 2005) - Hàm lượng chất khô hoà tan của dịch ép quả được xác định theo bằng chiết quang kế cầm tay (TCVN 4414 - 87) - Hàm lượng acid có trong thịt quả được xác định theo phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N (TCVN 4589:1988) - Cường độ hô hấp được xác định bằng thiết bị đo nồng độ khí CO2 kiểu 250/ICA - Hàm lượng ethylene sinh ra trong quá trình hô hấp của quả được xác định bằng thiết bị ICA56 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả thí nghiệm được phân tích phương sai một nhân tố ANOVA và so sánh các giá trị trung bình bằng phương pháp DUNCAN trên phần mềm thống kê SAS (Vesion 9.13). Phần mềm Design Expert (Vesion 8.0.3) được sử dụng để thiết kế thí nghiệm, phân tích dữ liệu, xây dựng mô hình bậc hai và tối ưu hóa bằng cách phân tích bề mặt đáp ứng. Phân tích trình tự nhằm đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng bệnh thán thư thông qua cây quan hệ phát sinh loài (phylogenetic tree) theo phương pháp Neighbour- Joining (Saitou và Nei, 1987) bằng phần mềm MEGA (Version 6.0). 12
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. NGHIÊN CỨU CẮT MẠCH CHITOSAN TẠO WSC BẰNG TÁC NHÂN H2O2 3.1.1. Xác định các thông số biên cho quá trình tối ưu hóa cắt mạch chitosan tạo WSC Kết quả khảo sát biến đổi hiệu suất thu hồi WSC (%) theo thời gian phản ứng (nồng độ H2O2 5%, nhiệt độ 40oC), nhiệt độ phản ứng (nồng độ H2O2 5%, thời gian 3 giờ) và nồng độ H2O2 (nhiệt độ 40oC, thời gian 3 giờ) được trình bày ở hình 1 - 3. Thông số biên cho quá trình tối ưu hoá cắt mạch chitosan tạo WSC được lựa chọn: nồng độ H2O2 từ 4 - 6%, nhiệt độ phản ứng từ 30 - 60oC và thời gian phản ứng 2 - 4 giờ. Hình 1. Biến đổi hiệu suất thu hồi WSC Hình 2. Biến đổi hiệu suất thu hồi Hình 3. Biến đổi hiệu suất thu hồi theo nồng độ H2O2, ở nhiệt độ phản ứng WSC theo nhiệt độ, ở nồng độ H2O2 WSC theo thời gian, ở nồng độ H2O2 40oC và thời gian phản ứng 3 giờ 5% và thời gian phản ứng 3 giờ 5% và nhiệt độ phản ứng 40oC 3.1.2. Tối ưu hoá quá trình cắt mạch chitosan tạo WSC theo phương pháp Box- Behnken Tối ưu hoá công đoạn cắt mạch chitosan tạo WSC theo phương pháp Box-Behnken, Design-Expert® Software Factor Coding: Actual tương quan giữa các yếu tố được biểu diễn ở các hình 4 - 6. Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Hieu suat thu hoi Hieu suat thu hoi 86.1 Hieu suat thu hoi 86.1 86.1 22.7 22.7 22.7 X1 = B: Thoi gian X1 = A: Nong do X2 = C: Nhiet do 90.0 X1 = A: Nong do X2 = B: Thoi gian 90.0 X2 = C: Nhiet do 90.0 Actual Factor 76.0 Actual Factor 80.0 Actual Factor 76.0 C: Nhiet do = 45.0 A: Nong do = 5.0 Hieu suat thu hoi (%) 62.0 Hieu suat thu hoi (%) B: Thoi gian = 3.0 70.0 Hieu suat thu hoi (%) 62.0 60.0 48.0 48.0 50.0 34.0 34.0 40.0 20.0 20.0 4.0 60.0 60.0 6.0 6.0 3.5 4.0 52.5 52.5 5.5 5.5 3.0 3.5 45.0 5.0 45.0 5.0 3.0 Thoi gian (h) 2.5 4.5 Nhiet do (oC) 37.5 4.5 Nhiet do (oC) 37.5 2.5 Nong do (%) Nong do (%) 30.0 4.0 2.0 4.0 30.0 2.0 Thoi gian (h) Hình 4. Ảnh hưởng của nhiệt Hình 5. Ảnh hưởng của thời gian Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ đến hiệu suất thu và nồng độ đến hiệu suất thu hồi, độ và thời gian đến hiệu suất hồi, thời gian phản ứng 3h nhiệt độ phản ứng ở 45oC thu hồi, nồng độ H2O2 5% Tối ưu hoá công đoạn cắt mạch chitosan tạo WSC theo phương pháp Box-Behnken, tương quan giữa các yếu tố được biểu diễn ở các hình 4 - 6. Phương trình hồi qui tương quan giữa nồng độ H2O2 (X1), thời gian (X2) và nhiệt độ phản ứng (X3) với hiệu suất thu hồi WSC (Y): Y = 83,41 + 8,64X1 + 7,17X2 + 9,65X3 + 0,35X1X2 - 2,54X1X3 - 0,04X2X3 - 9,96X12 - 9,98X22 - 30,86X32 Điều kiện cắt mạch chitosan bằng H2O2 thu hồi WSC đạt hiệu suất cao nhất: nồng độ 5,4% H2O2, nhiệt độ 47,1oC và thời gian 3,4 giờ. Hiệu suất thu hồi được xác định là 85,6 ± 2,5%. 13
3.1.3. Khối lượng phân tử trung bình & ảnh hưởng của điều kiện cắt mạch đến cấu trúc sản phẩm WSCE:\Result\ALong\Chitosan1.0 4/17/2012 3:47:06 PM Khối lượng phân tử trung bình của chitosan thương mại, chitosan tinh sạch và WSC 614.56 3451.00 2881.70 1650.23 1426.44 1375.40 1076.56 tương ứng là: 246,6 kDa, 206,7 kDa và 31,5 kDa. 0.40 a 0.35 a: chitosan thương mại 0.30 b: chitosan tinh sạch 0.15 0.20 0.25 b c: WSC Absorbance Units 0.10 0.05 0.00 c 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumber cm-1 Page 1 of 1 Hình 7. Phổ hồng ngoại FT-IR của các loại chitosan Quang phổ hấp thụ của các loại chitosan hầu như không có thay đổi đáng kể và không thấy xuất hiện các peak mới trong vùng bước sóng khảo sát (Hình 7). Như vậy, điều kiện cắt mạch đã thực hiện không làm thay đổi cấu trúc phân tử của mạch chitosan. 3.2. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM THÁN THƯ HẠI XOÀI, CHUỐI, ỚT 3.2.1. Kết quả phân lập, tuyển chọn và giám định bằng hình thái Phân lập được 8 chủng nấm từ vết bệnh tương đồng cao về hình thái với nấm thán thư điển hình trên xoài (3 chủng), chuối (3 chủng) và ớt (2 chủng). Trong đó, L2, D1 và B4 tương ứng là tác nhân gây bệnh chính từ các mẫu bệnh thán thư thu thập được ở xoài, chuối, ớt (Hình 8 - 13). A B Hình 8. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường PDA, Hình 9. Cành bào tử (A) và bào tử phân 1/2PDA & 1/5PDA của chủng L2 trên xoài sinh (B) chủng L2 A B Hình 10. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường PDA, Hình 11. Cành bào tử (A) và bào tử phân 1/2PDA & 1/5PDA của chủng D1 trên chuối sinh (B) chủng D1 14
A B Hình 12. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường PDA, Hình 13. Cành bào tử (A) và bào tử phân 1/2PDA & 1/5PDA của chủng B4 trên ớt sinh (B) chủng B4 3.2.2. Kết quả định danh nấm C. gloeosporioides, C. musae và C. capsici ở cấp độ loài Kết quả giải trình tự gen mã hoá tiểu phần 28S rDNA và so sánh dữ liệu đã công bố trong ngân hàng gen thông qua công cụ BLAST SEARCH trên NCBI cho thấy: 3 chủng L2, D1, B4 có trình tự gen tương ứng tương đồng 100% với chủng C. gloeosporioides AJ301909, Colletotrichum musae AJ301409 và Colletotrichum capsici DQ28. 98 Colletotrichum gloeosporioides L2 100 Colletotrichum musae D1 Colletotrichum truncatum B1 Elsinoe ampelina N2 Colletotrichum capsici B4 100 Colletotrichum acutatum C3 0.05 Hình 14. Cây quan hệ phát sinh loài của nấm mốc (3 mẫu nấm thán thư trên xoài, chuối, ớt và 3 mẫu nấm thán thư thu thập từ nho, thanh long) dựa trên trình tự ITS C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 phân lập được từ vết bệnh thán thư điển hình trên xoài, chuối và ớt đã có những quan hệ phát sinh loài nhất định. Trong đó, 2 chủng C. gloeosporioides L2 từ xoài và C. musae D1 từ chuối có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất (Hình 14). 3.3. KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH THÁN THƯ HẠI XOÀI, CHUỐI, ỚT CỦA WSC 3.3.1. Kết quả kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt của WSC ở điều kiện in vitro a. Trong môi trường PDA WSC đã ức chế rõ rệt sự phát triển của C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4. Trong khoảng nồng độ từ 0,05 - 0,8% (trên đối tượng C. gloeosporioides L2 và C. capsici B4) và 0,1 - 1,6% (trên đối tượng C. musae D1), WSC không chỉ khống chế ĐC (0%) 0,05% 0,1% 0,2% 0,4% 0,8% Hình 15. Nấm C. gloeosporioides L2 sau 10 ngày trên môi trường PDA bổ sung WSC ở 25 - 28oC ĐC (0%) 0,1% 0,2% 0,4% 0,8% 1,6% Hình 16. Nấm C. musae D1 sau 10 ngày trên môi trường PDA bổ sung WSC ở 25 - 28oC 15
sinh trưởng của nấm bệnh thán thư thông qua ĐKTN mà còn gây nên những biến đổi về hình thái khuẩn lạc nấm với hiệu lực ức chế tăng khi tăng nồng độ xử lý (Hình 15 - 17): - Trên đối tượng C. gloeosporioides L2: Hiệu lực ức chế cao nhất ở nồng độ 0,8% và thấp nhất ở nồng độ 0,05% tương ứng với giá trị PIRG là 100% và 21,86%. Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và PIRG (y) trong khoảng nồng độ khảo sát (0,05 - 0,8%): y = 28,27.ln(x) + 115,78 (R2 = 0,9021); EC50 và MIC90 tương ứng là 0,09% và 0,40%. - Trên đối tượng C. musae D1: Hiệu lực ức chế cao nhất ở nồng độ 1,6% và thấp nhất ĐC (0%) 0,05% 0,1% 0,2% 0,4% 0,8% ở nồng độ 0,1% tương ứng với giá trị PIRG là 100% và 15,12%. Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và PIRG (y) trong khoảng nồng độ khảo sát (0,1 - 1,6%): y = 35,03.ln(x) + 94,70 (R2 = 0,9024) ; EC50 và MIC90 tương ứng là 0,28% và 0,88%. - Trên đối tượng C. capsici B4: Hiệu lực ức chế cao nhất ở nồng độ 0,8% và thấp nhất ở nồng độ 0,05% tương ứng với giá trị PIRG là 100% và 7,05%. Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và PIRG (y) trong khoảng nồng độ khảo sát (0,05 - 0,8%): y = 399,75x2 + 465,26x - 17,44 (R2 = 0,9393) ; EC50 và MIC90 tương ứng là 0,16% và 0,45%. b. Trong môi trường PDB WSC ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển sinh khối nấm C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 trong môi trường PDB với hiệu lực ức chế lớn hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường PDA (Hình 18 - 21): A B C (A) (B) (C) Hình 18. Ảnh hưởng của WSC đến sinh khối nấm C. gloeosporioides L2 (A), C. musae D1 (B), C. capsici B4 (C) sau 10 ngày nuôi cấy ở 25 - 28oC - Trên đối tượng C. gloeosporioides L2: Hiệu lực ức chế thấp nhất ở nồng độ WSC 0,05% là 48,18% và cao nhất ở 0,4% là 100%. Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và IC (y) trong khoảng nồng độ khảo sát (0,05 - 0,4%): y = 24,22.ln(x) + 127,80 (R2 = 0,8797); IC50 và MIC90 tương ứng là 0,04% và 0,21%. - Trên đối tượng C. musae D1: Hiệu lực ức chế thấp nhất ở nồng độ WSC 0,05% là 17,27% và cao nhất ở 0,8% là 100%. Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và IC (y) trong 16
khoảng nồng độ khảo sát (0,05 - 0,8%): y = 29,30.ln(x) + 115,94 (R² = 0,9212); IC50 và MIC90 tương ứng là 0,11 và 0,43%. - Trên đối tượng C. capsici B4: Hiệu lực ức chế đạt 100% ở nồng độ 0,32%. Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và IC (y) trong khoảng nồng độ khảo sát (0,02 - 0,32%) được xác định: y = 13,19.ln(x) + 118,63 (R2 = 0,9228) ; IC50 và MIC90 tương ứng là 0,007% và 0,45%. ĐC (0%) 0,05% 0,1% 0,2% 0,4% Hình 19. Nấm C. gloeosporioides L2 sau 10 ngày trên môi trường PDB bổ sung WSC ở 25 - 28oC ĐC (0%) 0,05% 0,1% 0,2% 0,4% 0,8% Hình 20. Nấm C. musae D1 sau 10 ngày trên môi trường PDB bổ sung WSC ở 25 - 28oC ĐC (0%) 0,02% 0,04% 0,08% 0,16% 0,32% Hình 21. Nấm C. capsici B4 sau 10 ngày trên môi trường PDB bổ sung WSC ở 25 - 28oC c. Sự nảy mầm của các bào tử nấm WSC đã gây ức chế rõ rệt sự nảy mầm các bào tử nấm C. gloeosporioides L2 C. musae D1 và C. capsici B4 trong môi trường PDB: sau 7 giờ giá trị PISG50 và MIC90 tương ứng đối với C. gloeosporioides L2 là 0,13% và 0,51%; sau 12 giờ, giá trị PISG50 và MIC90 tương ứng đối với C. musae D1 và C. capsici B4 là 0,24% và 0,54%, 0,08% và 0,27%. A B 0% (ĐC) 0,05% 0,1% 0% (ĐC) 0,05% 0,1% % % % % % % 0,2% 0,4% 0,8% 0,2% 0,4% 0,8% Hình 22. Ảnh hưởng của WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides L2 sau % % 5 giờ (A) % ở 25 - 28oC và 7 giờ (B) nuôi % % % 17
Khi quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 100X, WSC tác động trực tiếp lên màng tế bào, gây biến đổi hình thái bào tử nấm C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 (gây biến dạng, ống mầm bào tử co ngắn, màng bào tử có xu hướng mỏng dần, thay đổi màu sắc và trạng thái dịch bào) trong quá trình nảy mầm (Hình 22 - 24). A B 0% (ĐC) 0,1% 0,2% 0% (ĐC) 0,1% 0,2% 0,4% 0,8% 1,6% 0,4% 0,8% 1,6% Hình 23. Ảnh hưởng của WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. musae D1 sau 5 giờ (A) và 12 giờ (B) nuôi ở 25 - 28oC A B 0% (ĐC) 0,05% 0,1% 0% (ĐC) 0,05% 0,1% 0,2% 0,4% 0,8% 0,2% 0,4% 0,8% Hình 24. Ảnh hưởng của WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. musae D1 sau 5 giờ (A) và 12 giờ (B) nuôi ở 25 - 28oC Tóm lại, trong điều kiện in vitro WSC không chỉ ức chế đáng kể đến sự phát triển của C. gloeosporioides L2, C. musae D1 (trong khoảng nồng độ 0,05 - 0,8%) và C. capsici B4 (trong khoảng nồng độ 0,1 - 1,6%) gây bệnh thán thư tương ứng trên xoài, chuối và ớt thông qua phát triển ĐKTN và sinh khối nấm tương ứng trên môi trường PDA và PDB mà còn làm chậm quá trình nảy mầm của bào tử, gây biến đổi hình thái nấm trong quá trình bào tử nảy mầm. 3.3.2. Kết quả kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt của WSC ở điều kiện in vivo a. Ngưỡng gây bệnh nhân tạo của C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 tương ứng trên xoài, chuối, ớt Quá trình xâm nhập trực tiếp từ vết tổn thương của bào tử C. gloeosporioides L2 trên xoài khá tương đồng với nấm C. capsici B4 trên ớt. Trong khi trên chuối, những biến đổi sinh hóa đáng kể ở mô nhiễm bệnh so với vùng không bị lây nhiễm khi nồng độ bào tử nấm bệnh đủ cao diễn ra chậm hơn. Nồng độ 105 bào tử/mL được xác định là ngưỡng gây bệnh thán thư do C. gloeosporioides L2 và C. capsici B4 tương ứng trên xoài và ớt; 106 18