Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:49

Thêm vào BST

Báo xấu

66
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm thu thập và định danh đến loài của các chủng nấm thuộc hai chi Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loài côn trùng gây hại tại các tỉnh vùng ĐBSCL. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng ký sinh gây bệnh, các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces đã định danh đến loài.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã ngành: 9620112 HUỲNH HỮU ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ Paecilomyces KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ, 2018
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Trần Văn Hai Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm ….. Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Huỳnh Hữu Đức và Trần Văn Hai, 2016. Xác định loài, đặc diểm sinh học và bước đầu đánh giá hiệu quả trừ sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) trong điều kiện phòng thí nghiệm của các chủng nấm Beauveria ký sinh trên côn trùng gây hại phân lập tại Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số chuyên đề: Nông nghiệp. ISSN 1859-2333. (3): 36-46. 2. Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2016. Phân lập, định danh và bước đầu đánh giá hiệu quả phòng trừ rệp sáp Planococcus lilacinus của các chủng nấm Paecilomyces javanicus thu thập tại Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Số chuyên đề: Nông Nghiệp Xanh. ISSN 1859-4581: 109-116. 3. Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2018. Hiệu quả của chế phẩm nấm Paecilomyces javanicus (Friedrichs and Bally) phòng trừ rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới. Tạp chí Bảo vệ thực vật. ISSN 2354-0710. 1(276): 32-37. 4. Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2018. Ảnh hưởng của một số loài thuốc trừ nấm đến tỷ lệ nảy mầm, sự phát triển của tản nấm và khả năng hình thành bào tử của nấm Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. Tạp chí Bảo vệ thực vật. ISSN 2354-0710. 1(276): 42-48.
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu Một tập hợp đa dạng của vi sinh vật khác nhau hiện đang được xem xét như là các tác nhân sinh học kiểm soát côn trùng như: virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh và nấm. Trong đó giới nấm, theo ước tính của các nhà khoa học có khoảng 1,5 triệu loài (Hawksworth, 2001; Mueller and Schmit, 2007; Schmit and Mueller, 2007), với khoảng 110.000 loài được mô tả (Kirk et al., 2008). Trong số này, 700 loài trong 90 chi được công nhận là tác nhân gây bệnh côn trùng (Roberts and Humber, 1981), và khoảng 170 sản phẩm kiểm soát dịch hại đã được phát triển dựa trên ít nhất 12 loài nấm ký sinh côn trùng (De Faria and Wraight, 2007). Các nghiên cứu tập trung phát triển và ứng dụng các loài ký sinh côn trùng thuộc Hyphomycetes trong đó có nấm Beauveria và Paecilomyces . Nấm ký sinh gây bệnh trên côn trùng Beauveria bassiana và Paecilomyces javanicus là loài nấm được quan tâm nghiên cứu phát triển và ứng dụng nhiều do có phổ ký chủ rộng, ký sinh gây chết nhiều loại côn trùng gây hại nông lâm nghiệp, đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trên thế giới như là tác nhân phòng trừ sinh học. Nấm B. bassiana đã được nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Canada, Anh, Úc, Nhật, Philippines, Trung Quốc… sử dụng để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại cây trồng như bọ hung hại mía, bọ hung hại củ cải đường, ruồi hại rễ bắp cải, củ cải… đạt kết quả tốt, đặc biệt là những loài sâu hại cây rừng như sâu róm thông, bọ hại dừa, châu chấu hại tre, mía, mối đất hại cây ăn quả, sùng hại mía (Ferron, 1978; Rombach et al., 1988; Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn Mão, 2004). Chủng nấm P. javanicus kết hợp hoạt chất Azadirachtin (tỷ lệ 100:0,05-0,25) dưới dạng bột hòa nước, huyền phù hoặc dạng nhũ dầu để phòng trừ một số loại sâu hại cây trồng như sâu tơ, rầy phấn trắng, rầy mềm… Việc kết hợp nấm tím P. javanicus và hoạt chất Azadirzachtin giúp tăng hiệu lực của nấm ký sinh đồng thời giảm lượng hoạt chất Azadirachtin trong phòng trừ sâu hại, ngoài ra còn kết hợp với hoạt chất Cypermethrin (100 : 0,25 -
0,56) và Acetamiprid (tỉ lệ 100 : 1,5 - 10) dưới dạng bột hòa nước để phòng trừ sâu hại, đặc biệt là các loài chích hút, còn có tác dụng ngăn ngừa tốt các loài dịch hại như bướm sâu tơ, rầy mềm, bọ trĩ., (Huang Zhen and Ren Shunxiang, 2008a, 2008b, 2008c). Tại Đồng bằng Sông Cửu Long, khoai lang và cây ăn trái chiếm diện tích tương đối lớn. Dịch hại thường xuất hiện là sùng (Cylas formicarius Fabricius) gây hại trên khoai lang và rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) gây hại trên nhiều loại cây ăn trái (mãng cầu, sầu riêng, khóm,…) gây ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sản phẩm nên nông dân đã sử dụng rất nhiều thuốc bảo vệ thực vật để quản lý đối tượng trên, làm lưu tồn một lượng lớn thuốc BVTV trong sản phẩm có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người tiêu dùng. Vì thế, việc nghiên cứu các tác nhân phòng trừ sinh học để quản lý côn trùng gây hại có hiệu quả thay thế dần thuốc BVTV là hết sức cần thiết trong thực tế sản xuất hiện nay. Xuất phát từ thực tế, đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long” đã được thực hiện. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Thu thập và định danh đến loài của các chủng nấm thuộc hai chi Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loài côn trùng gây hại tại các tỉnh vùng ĐBSCL. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng ký sinh gây bệnh, các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces đã định danh đến loài. Tuyển chọn các chủng nấm Beauveria có khả năng ký sinh cao sùng khoai lang C. formicarius Fabricius ở điều kiện phòng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh SKL ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng.
Tuyển chọn các chủng nấm Paecilomyces có khả năng ký sinh cao rệp sáp P. lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm Paecilomyces ký sinh rệp sáp P. lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Đề tài có ý nghĩa khoa học cao vì nghiên cứu chi tiết có hệ thống từ trong phòng thí nghiệm, nhà lưới đến ngoài đồng ruộng nên cung cấp nhiều số liệu khoa học về đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu lực của nấm B. bassiana và P. javanicus (I. javanica) nhằm thiết lập những thông tin cơ bản về các chủng nấm phân lập tại ĐBSCL. Ngoài ra, kết quả của đề tài sẽ mở ra hướng quản lý phòng trừ một số loài côn trùng gây hại cây trồng theo IPM, để thay thế các loại thuốc hóa học cũng là cơ sở cho hướng nghiên cứu tiếp theo về đấu tranh sinh học côn trùng. 1.4. Những đóng góp mới của luận án Phân lập được 16 chủng nấm Beauveria ký sinh trên côn trùng tại 7 tỉnh ĐBSCL thuộc loài B. bassiana. Trong đó, tuyển chọn được hai chủng Bb4(SKL-VL) và Bb5(SKL-HG) để sản xuất chế phẩm. Phân lập được 22 chủng nấm Paecilomyces ký sinh trên côn trùng tại 6 tỉnh ĐBSCL trong đó định danh được 14 chủng nấm thuộc loài P. javanicus và 8 chủng nấm thuộc loài Purpureocillum lilacinum. Kết quả, tuyển chọn được hai chủng Pj6(Pl-TG) và Pj8(Pl- CT) để sản xuất chế phẩm. Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm B. bassiana và P. javanicus trong điều kiện phòng thí nghiệm. Xác định một số hoạt chất hoá học trừ nấm vô hại đối với sự phát triển của nấm B. bassiana ở nồng độ thấp (½ nồng độ liều khuyến cáo) hoặc ảnh hưởng vừa (ở nồng độ liều khuyến cáo) như Metalaxyl, Fenoxanil và Validamycin. Đối với P. javanicus hợp chất Fenxanil, Kasugamycin và Picoxystrobin tỏ ra vô hại hoặc ảnh hưởng
vừa. Tuy nhiên, đối với nấm B. bassiana rất dễ bị ảnh hưởng ngay cả nồng độ rất thấp (½ nồng độ liều khuyến cáo) so với P. javanicus trên cùng hợp chất thuốc hoá học trừ nấm. Đối với chế phẩm nấm B. bassiana dạng tươi để phòng trừ SKL và chế phẩm nấm P. javanicus dạng tươi để phòng trừ rệp sáp P. lilacinus gây hại mãng cầu xiêm đều cho kết quả phòng trừ tốt khi sử dụng liều lượng 3,0 - 3,5 kg/ha với mật số bào tử chế phẩm khoảng > 108 bt/gram. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 9/2013 - 9/2017. Địa điểm: Các thí nghiệm trong phòng, nhà lưới được thực hiện tại Phòng thí nghiệm phòng trừ sinh học, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Ly trích DNA và phản ứng PCR được thực hiện tại Viện Công Nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ. Giải trình tự DNA được gởi đi thực hiện tại công ty MacroGen Hàn Quốc. Các thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện tại tỉnh Vĩnh Long. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Beauveria và Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử 3.2.1.1. Phân lập và định danh loài nấm ký sinh trên một số sâu hại cây trồng thuộc chi nấm Beauveria và Paecilomyces theo phương pháp truyền thống Thu thập côn trùng gây hại bị nhiễm nấm ký sinh tại 7 tỉnh vùng Đồng bằng Sông Cửu Long như: Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng và Trà Vinh về phòng thí nghiệm Bộ môn BVTV để phân lập tác nhân. Nấm được nuôi cấy trên
môi trường PDA, tạo dòng thuần bằng phương pháp nuôi cấy đơn bào tử của nấm Beauveria và Paecilomyces trên môi trường PDA, lưu trữ trực tiếp trên môi trường ở nhiệt độ -37oC. Định danh nấm theo Barnett and Barry (1972), Lawrence (1994), De Hoog (1972), Luangsa-Ard et al. (2006). Các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces sau khi được tách dòng thuần được nuôi cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri (đường kính 9cm) ở nhiệt độ 27±2oC và 12 giờ sáng tối. Lấy khoanh sợi nấm từ rìa mép của tản nấm 3 ngày tuổi đặt vào giữa đĩa petri chứa khoảng 10 mL môi trường nuôi cấy ở vị trí úp ngược cho sợi nấm tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy, tất cả thí nghiệm được lập lại 5 lần cho mỗi mẫu phân lập. Đặc điểm nhận dạng và chỉ tiêu theo dõi: đặc điểm tản nấm, đặc điểm cơ quan sinh bào tử và hình dạng bào tử và kích thước bào tử. 3.2.1.2. Định danh loài và phân tích một số khác biệt di truyền của chủng nấm Beauveria sp. và Paecilomyces spp. dựa trên trình tự DNA vùng ITS-rDNA Chiết xuất DNA tổng số theo quy trình của Saitoh et al. (2006). Sau khi có lượng DNA sẽ thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA, đọc kết quả và giải trình tự vùng ITS-rDNA. Vùng ITS-rDNA được nhân lên bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS5 (5’- GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G - 3’) và ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3’). Các sản phẩm PCR được giải trình tự và dựa vào kết quả giải trình tự để so sánh với các trình tự vùng ITS-rDNA của chủng nấm Beauveria và Paecilomyces trên thế giới đã biết tên loài từ cơ sở dữ liệu của Genbank làm cơ sở xác định tên loài của chủng nấm Beauveria và Paecilomyces thu thập được. Sơ đồ phân nhóm xác định loài nấm thuộc chi Beauveria và Paecilomyces sẽ được xử lý bằng phương pháp Maximum likelihood dựa trên tình tự của vùng ITS-rDNA và phân tích bootstrap với 1.000 lần lập lại. Sử dụng các chương trình phylogenetic (BioEdit, Clustalx
3.1 và Treeview) để quan sát mối quan hệ di truyền qua cây phả hệ của các loài nấm và tính tỷ lệ tương đồng giữa các DNA của các mẫu nấm thu thập. 3.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Beauveria và Paecilomyces 3.2.2.1. Xác định thời gian nẩy mầm của bào tử nấm Beauveria và Paecilomyces Trải đều 0,1 mL dịch bào tử (106 bào tử/mL trong dung dịch nước cất thanh trùng có chứa 0,05% Tween 20) trên các lame có phủ một lớp môi trường nuôi cấy, đặt ở nhiệt độ phòng và trong tối. Mỗi mẫu phân lập thực hiện trên 4 lame tương ứng với 4 lần lặp lại. Tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) được đánh giá 2 giờ một lần trong vòng 24 giờ dưới kính hiển vi OLYMPUS DP20 với độ phóng đại 400 lần. Quan sát 4 thị trường/lame. 25 bào tử/thị trường, tổng số bào tử quan sát là 400 cho mỗi mẫu phân lập. 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm Beauveria và Paecilomyces Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp bố trí hai nhân tố, trong đó nhân tố A là các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces phân lập được và nhân tố B là năm loại môi trường dinh dưỡng khác nhau PDA, CDA, SDAY1, SDAY3, SDAY - Chitin với 4 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại sử dụng một đĩa petri có chứa 10 mL môi trường cần khảo sát. Cấy một khoanh nấm có đường kính khoảng 10 mm vào giữa đĩa môi trường để úp ngược tiếp xúc trực tiếp môi trường nuôi cấy và đặt ở nhiệt độ phòng và 12 giờ sáng tối. Các chỉ tiêu theo dõi: (d1+d2) Đường kính tản nấm (cm) = 2 Trong đó: d1 và d2 là độ dài hai đường chéo phần tản nấm phân bố Thời gian theo dõi: sau 3 ngày nuôi cấy và đo cho đến khi không có sự khác biệt
Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): trung bình của 3 lần đo đường kính tản nấm từ 5 - 7, 7 - 9 và 9 - 11 ngày sau khi cấy. Mật số bào tử/cm2: được tính 1 lần ở thời điểm 15 ngày sau khi nuôi cấy theo phương pháp sau: Tính mật số bào tử theo phương pháp đếm mật số bào tử trực tiếp bằng buồng đếm Thoma Số bào tử/mL = (4 a x 106) / b Trong đó: a: số bào tử có trong thể tích huyền phù ứng với diện tích ô nhỏ (= 1/400 mm2) x độ sâu 0,1 mm; b: hệ số pha loãng Mật số bào tử/cm2= Số bào tử (bt/mL) * V (mL) huyền phù thu được trên đĩa Diện tích tản nấm (cm2) 3.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành bào tử của nấm Beauveria và Paecilomyces Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Uma et al. (2005), Võ Thị Thu Oanh (2010). Thí nghiệm được lập lại 4 lần cho mỗi mẫu phân lập, cấy các khoanh nấm (10 mm) lên bề mặt của đĩa petri có chứa khoảng 10ml môi trường nuôi cấy được lựa chọn từ thí nghiệm 3.2.2.2 và đặt ở các mức nhiệt độ 20, 25, 28, 30, 35oC trong tủ ổn định. Các chỉ tiêu theo dõi: tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày), số lượng bào tử/cm2 (tương tự thí nghiệm 3.2.2.2). Khả năng bào tử nẩy mầm ở nhiệt độ cao (%). Đánh giá khả năng nẩy mầm của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ở các mức nhiệt độ cao, bao gồm các nghiệm thức sau: 25o - 30o - 35o - 38oC, trong đó, nghiệm thức 25oC là nhiệt độ đối chứng. Trải đều 0,1 mL dịch bào tử (106 bào tử/mL) trên các lame có phủ một lớp môi trường nuôi cấy và được đặt trong đĩa petri có lót giấy thấm để giữ ẩm, mỗi mẫu phân lập thực hiện trên 4 lame tương ứng với 4 lần lặp lại. Tiếp theo, tiến hành đặt các đĩa petri vào tủ định ôn cài đặt các mức nhiệt độ cao (30o - 35o - 38o) trong 8 giờ, sau đó chuyển về nhiệt độ đối chứng 25oC trong 16 giờ. Tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) được đánh giá một lần sau 24 giờ (8 giờ ở nhiệt độ cao (30o - 35o - 38oC) và 16 giờ ở nhiệt độ đối chứng 25oC). Phương pháp lấy chỉ tiêu tương tự thí nghiệm 3.2.2.1
3.2.2.4. Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển và nẩy mầm của nấm Beauveria và Paecilomyces Thí nghiệm theo phương pháp của Hokkanen and Kotiluoto, 1992; Rachappa, 2006; Amutha et al., 2010 và Usha et al., 2014. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, năm lần lặp lại tương ứng với năm đĩa petri. Các nghiệm thức bao gồm các loại thuốc trừ nấm được khảo sát và nghiệm thức đối chứng không xử lý thuốc. Bảng 3.1. Mười loại thuốc trừ nấm sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thuốc trừ nấm đến sự phát triển và nẩy mầm đối với nấm Beauveria Liều khuyến cáo (LKC) Stt Hoạt chất Tên thương mại (ml / lít) 1 Propiconazole + Tricyclazole Tillage super 525SE 1,0 2 Azoxytrobin + Difenoconazole Amistartop 325SC 1,0 3 Hexaconazole Tecvil 50SC 1,0 4 Fenbuconazole Indar 240SC 1,1 5 Picoxystrobin Aproach 250SC 1,6 6 Mancozeb TaiYou 20SC 1,56 7 Metalaxyl Mataxyl 500WP 1,50 8 Fenoxanil Dithane M - 45 80WP 3,125 9 Validamycin Validan 5SL 3,75 10 Kasugamycin Kasumin 2SL 5,0 Bảng 3.2. Năm loại thuốc trừ nấm sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thuốc trừ nấm đến sự phát triển và nẩy mầm đối với nấm Paecilomyces Liều khuyến cáo (LKC) Stt Hoạt chất Tên thương mại (ml / lít) 1 Azoxytrobin + Difenoconazole Amistartop 325SC 1,0 2 Fenbuconazole Indar 240SC 1,1 3 Picoxystrobin Aproach 250SC 1,6 4 Fenoxanil Dithane M - 45 80WP 3,125 5 Kasugamycin Kasumin 2SL 5,0 Chọn môi trường tốt cho sự phát triển của nấm được nghiên cứu ở thí nghiệm 3.4.2.2. Thanh trùng ở nhiệt độ 121oC trong 25 phút, để nguội khoảng 50oC, sau đó cho từng loại thuốc khảo nghiệm vào môi trường nuôi cấy với nồng độ (½ x LKC), (LKC) và (2 x LKC). Sau đó, cho 10 mL hỗn hợp vào đĩa petri, cấy khoanh nấm Beauveria và Paecilomyces (chọn chủng nấm thích hợp dựa vào kết quả của thí nghiệm trước đó) với đường kính 10 mm vào giữa đĩa môi trường hỗn hợp và đặt ở nhiệt độ phòng. Các chỉ tiêu theo dõi sau 15 và 24 ngày nuôi cấy gồm:
Đường kính tản nấm (cm): tương tự thí nghiệm 3.4.2.2, tính thành phần trăm sự phát triển của sợi nấm bị ức chế so với đối chứng theo công thức Abbott (1925): 𝐂−𝐓 I= x 100 𝐂 Trong đó: I: % tản nấm bị ức chế; C: đường kính tản nấm được đo ở nghiệm thức đối chứng; T: đường kính tản nấm được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. (Theo công thức Abbott, 1925) Ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ: (Usha et al., 2014) 𝟐𝟎 [𝐕𝐆] + 𝟖𝟎 [𝐒𝐏] T= 𝟏𝟎𝟎 Trong đó: T: là giá trị hiệu chỉnh của tốc độ tăng trưởng đường kính tản nấm và khả năng tăng trưởng sinh sản để phân loại sản phẩm; VG: là phần trăm tốc độ tăng trưởng đường kính tản nấm; SP: là phần trăm hình thành bào tử so với đối chứng. Các giá trị T để phân loại về hiệu quả của sản phẩm hóa học trên các loại nấm như: 0 - 30 (rất ảnh hưởng), 31 - 45 (ảnh hưởng), 46 - 60 (ảnh hưởng vừa) và > 60 (vô hại). Số lượng bào tử/cm2, tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) (tương tự thí nghiệm 3.2.2.1 và 3.2 2.2). 3.2.3. Bước đầu đánh giá độc tính của các chủng nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm (PTN) Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm các chủng nấm Beauveria (Paecilomyces) được phân lập và nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại gồm 30 thành trùng SKL (RS), mỗi thành trùng được nuôi riêng trong hộp nhựa nhỏ có lót giấy thấm giữ ẩm và có thức ăn là khoai lang (lá sầu riêng hoặc mãng cầu). Đối với nghiệm thức xử lý nấm, sử dụng nồng độ huyền phù bào tử nấm 5 x 108 bào tử/mL. Xử lý trực tiếp lên SKL (RS) bằng cách sử dụng bình phun thuốc cầm tay với lượng dung dịch phun 25 - 30 mL
cho bốn lần lặp lại/chủng nấm. Đối với nghiệm thức đối chứng ta pha dung dịch nước có thêm Tween 20 (0,1%) và xử lý SKL (RS) cũng giống như các nghiệm thức xử lý nấm. Các chỉ tiêu theo dõi: ghi nhận số SKL (RS) sống và bị chết do nấm trên mỗi nghiệm thức, độ hữu hiệu được hiệu đính bằng công thức Abbott (1925). 3.2.4. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên RS (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện PTN Tuyển chọn các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces để sản xuất chế phẩm dạng tươi theo quy trình nhân nuôi nấm được nêu ở phụ chương của luận án. Sau đó, tiến hành khảo sát hiệu lực chế phẩm ở điều kiện PTN, nhà lưới và ngoài đồng 3.2.4.1. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên RS (Planococcus lilacinus Cockerell) với 3 mật số bào tử (bt/mL) ở điều kiện PTN Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức (3 nghiệm thức tương ứng với 3 nồng độ chế phẩm nấm Beauveria (Paecilomyces) và 1 nghiệm thức đối chứng là dung dịch nước có thêm chất loang trải bề mặt (CLTBM). Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại gồm 30 thành trùng SKL (RS), mỗi thành trùng được nuôi trong hộp nhựa có lót giấy thấm giữ ẩm và có thức ăn là khoai lang (lá sầu riêng hoặc mãng cầu). Sử dụng nồng độ huyền phù bào tử nấm ở 3 nồng độ (5 x 107), (5 x 108) và (5 x 109) bào tử/mL cộng CLTBM Lực Sĩ Kiến Càng 0,4 mL/L. Xử lý trực tiếp lên SKL (RS) bằng cách sử dụng bình phun thuốc cầm tay với lượng dung dịch phun 25 - 30 mL cho bốn lần lặp lại/nghiệm thức. Các chỉ tiêu theo dõi (tương tự thí nghiệm 3.2.3)
3.2.4.2. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên RS (Planococcus lilacinus Cockerell) với bốn liều lượng sử dụng nấm (kg/ha) ở điều kiện PTN Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức (4 nghiệm thức tương ứng với 4 liều lượng chế phẩm nấm Beauveria (Paecilomyces) và 1 nghiệm thức đối chứng là dung dịch nước có thêm CLTBM. Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại gồm 30 thành trùng SKL (RS), mỗi thành trùng được nuôi trong hộp nhựa có lót giấy thấm giữ ẩm và có thức ăn là khoai lang (lá sầu riêng hoặc mãng cầu). Sử dụng 4 liều lượng chế phẩm nấm 2 - 2,5 - 3 - 3,5 kg/ha cộng CLTBM Lực Sĩ Kiến Càng 0,4 mL/L. Xử lý trực tiếp lên SKL (RS) bằng cách sử dụng bình phun thuốc cầm tay với lượng dung dịch phun 25 - 30 mL cho 4 lần lặp lại/nghiệm thức. Các chỉ tiêu theo dõi (tương tự thí nghiệm 3.2.3) 3.2.4.3. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên RS (Planococcus lilacinus Cockerell) với liều lượng sử dụng nấm (kg/ha) ở điều kiện nhà lưới Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức, trong đó có: 4 nghiệm thức xử lý chế phẩm nấm Beauveria (Paecilomyces) và 1 nghiệm thức đối chứng là dung dịch nước có thêm CLTBM. Mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại tương ứng với 4 chậu khoai lang (cây mãng cầu), mỗi chậu thả 30 thành trùng SKL (RS) thực hiện với nghiệm thức. Sử dụng 4 liều lượng chế phẩm nấm trắng 2 - 2,5 - 3 - 3,5 kg/ha cộng CLTBM Lực Sĩ Kiến Càng 0,4 mL/L. Xử lý trực tiếp lên SKL (RS) bằng cách sử dụng bình phun thuốc cầm tay với lượng dung dịch phun 10 mL/chậu. Tiến hành phun chế phẩm vào lúc sáng sớm. Các chỉ tiêu theo dõi (tương tự thí nghiệm 3.2.3)
3.2.5. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm các chủng nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện ngoài đồng Thí nghiệm diện hẹp được thực hiện theo “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực của các thuốc bảo vệ thực vật phòng trừ sâu và nhện hại cây trồng” số QCVN 01 - 1: 2009/BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ban. 3.2.5.1. Khảo sát hiệu lực chế phẩm nấm trắng Beauveria ký sinh trên SKL (Cylas formicarius Fabricius) ở điều kiện ngoài đồng Thí nghiệm được thực hiện trên nền đất chuyên canh màu có diện tích canh tác là 1000 m2 tại ấp Tân Qui, xã Tân Bình, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long, 2016. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức, 4 lần lặp lại. Các nghiệm thức được trình bày ở Bảng 3.3. Chỉ tiêu ghi nhận: Số lượng củ, trọng lượng củ, tỷ lệ (%) củ bị SKL gây hại bên ngoài và bên trong củ ở 4 thời điểm 60 - 80 - 120 NSKT và một ngày trước khi thu hoạch. Tỷ lệ (%) củ bị SKL gây hại được tính theo công thức: A = (A1/A2) x 100 Trong đó: A: Tỷ lệ (%) củ bị SKL gây hại; A1: Số củ bệnh, bị sâu, sùng đục củ; A2: Tổng số củ quan sát Bảng 3.3. Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm trắng Beauveria phòng trừ SKL ở điều kiện ngoài đồng Nghiệm thức Liều lượng kg, mL/ha Thời điểm xử lý A - Chế phẩm 2 lần 40 - 80 NSKT B - Chế phẩm 3 lần 9,38 g/L (3,0 kg) 40 - 60 - 100 NSKT C - Chế phẩm 5 lần 40 - 60 - 80 - 100 - 120 NSKT D - Theo Nông dân Theo nông dân (15 lần/vụ) E - Đối chứng Phun nước Ghi chú: Liều lượng chế phẩm nấm 9,38 g/L (3,0 kg) được sử dụng trong thí nghiệm là dựa vào kết quả thí nghiệm hiệu lực chế phẩm trong PTN và nhà lưới.
3.2.5.2. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm tím Paecilomyces ký sinh RS (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện ngoài đồng Thí nghiệm được thực hiện trên 60 cây mãng cầu xiêm Thái 4 năm tuổi tại ấp Thành Khương, xã Thành Đông, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long, 2017. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức (mỗi l nghiệm thức tương ứng 5 cây mãng cầu đang mang trái) và được lặp lại 3 lần. Giữa các lần lặp lại cách nhau một đường mương nước tạo vùng đệm để tránh ảnh hưởng giữa các lô thí nghiệm. Các nghiệm thức trong thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.4. Bảng 3.4. Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm tím Paecilomyces sp. trong phòng trừ RS ở điều kiện ngoài đồng Nghiệm thức Liều lượng khuyến cáo Thời điểm xử lý A - Chế phẩm nấm Tím 9,38 g/L H2O (3,0 kg) Mỗi nghiệm thức được phun 3 lần: B - BIO-Pro Pests 10 g/L H2O Lần 1: khi điều tra có rệp sáp gây hại C - Tasodant 600EC 1 L/ha (600 - 800 L nước) Lần 2: phun cách lần 1 sau 14 ngày D - Đối chứng Phun nước Lần 3: phun cách lần 2 sau 14 ngày Ghi chú: Liều lượng chế phẩm nấm 3kg/ha được sử dụng trong thí nghiệm là dựa vào kết quả thí nghiệm hiệu lực chế phẩm trong PTN và nhà lưới. Dùng bình xịt đeo vai (thể tích 16 lít) phun ướt đều các trái mãng cầu trên cây, lượng nước phun ở giai đoạn này khoảng từ 0,5 - 0,7 L/cây. Nên phun vào buổi chiều mát hoặc sáng sớm. Chỉ tiêu ghi nhận: Mật số rệp sáp trên trái: mỗi nghiệm thức chọn 3 cây, mỗi cây điều tra số rệp sáp sống trên 8 trái (4 trái còn non da màu xanh đậm và 4 trái lớn da màu xanh hơi nhạt) vào các thời điểm trước phun và 7, 11, 14 ngày sau khi phun. Tính độ hữu hiệu của thuốc ở điều kiện ngoài đồng ruộng theo công thức Henderson - Tilton (1955): 𝑪 ×𝑻 ĐHH (%) = (𝟏 − 𝒃 𝒂) × 𝟏𝟎𝟎 𝑪𝒂 × 𝑻𝒃 Trong đó: Tb: số RS sống ở nghiệm thức xử lý thuốc trước khi phun; Ta: số RS sống ở nghiệm thức xử lý thuốc sau
khi phun; Cb: số RS sống ở nghiệm thức đối chứng trước khi phun; Ca: số RS sống ở nghiệm thức đối chứng sau khi phun 3.3. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu đo kích thước bào tử nấm được tính toán theo giá trị TB ± SD, số lượng mẫu là 400, độ tin cậy 95%. Các số liều về tỷ lệ nẩy mầm, hình thành bào tử, thuốc trừ sâu, thuốc trừ bệnh, tỷ lệ chết (%) tùy theo dãy số liệu được chuyển đổi bằng cách dùng giá trị cân bậc hai của hàm arcsine hoặc log (x+1) hoặc √𝑥 + 0,5 để phân tích thống kê bằng các phần mền SPSS hoặc MSTATC. Tính toán số liệu, vẽ đồ thị và biểu đồ bằng phầm mềm Microsoft Excel. Sử dụng các chương trình Phylogentic (BioEdit, Clustalx 3.1, Mega 7 và Treeview) để quan sát mối quan hệ di truyền. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu chi Beauveria 4.1.1. Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Beauveria bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học Kết quả thu thập và phân lập được 16 chủng nấm tại các tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng gây bệnh cho nhóm côn trùng thuộc bộ Coleoptera (sùng khoai lang, bọ nhảy, sùng đất), Homoptera (rệp sáp giả, rầy nâu), Lepidoptera (sâu ăn tạp) thuộc chi Beauveria và cũng là loài được phân bố rộng ở một số tỉnh vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Đặc điểm tản nấm: tản nấm của 16 chủng nấm trắng Beauveria sp. khi nuôi cấy trên môi trường PDA cho thấy, các chủng nấm có đặc điểm gần như không khác biệt. Tản nấm có màu trắng sau vài ngày nuôi cấy, một số chủng nấm chuyển sang màu trắng hơi ửng vàng (khi nấm già), xốp mịn, tản nấm kết chặt phát triển theo vòng đồng tâm đôi khi có tiết dịch trên bề mặt tản nấm. Đặc điểm cơ quan sinh bào tử, hình dạng bào tử: kết quả quan sát 16 chủng nấm thu thập được đều có chung đặc điểm là cơ
quan sinh bào tử phát triển từ sợi dinh dưỡng mọc thành đám. Cuống bào tử đính phồng lên ở phía dưới có dạng hình thể bình với chiều dài không đều nhau, phân nhánh hoặc không phân nhánh. Sự kéo dài của gốc ghép làm phát sinh cuống bào tử có hình zíc zắc hoặc cong gập (Hình 4.1). Bào tử có dạng đơn bào trong suốt, không có vách ngăn, dạng bào tử đính có hai loại hình cầu hoặc hình trứng, bào tử mọc trên cuống sinh bào tử hướng gốc. Hình 4.1. Cấu trúc cơ quan sinh bào tử nấm Beauveria bassiana được quan sát dưới kính hiển vi quang học Kích thước bào tử: Sự khác biệt về mặt kích thước của 16 chủng nấm trắng được thể hiện qua Bảng 4.1 cho thấy, các chủng nấm này tương tự như miêu tả của Nguyen Thi Loc (1995), Glare and Inwood (1998), Luangsa-Ard et al. (2006), Võ Thị Thu Oanh (2010) là bào tử dạng hình cầu và hình trứng kích thước dao động trong khoảng 1,42 - 3,82 x 1,47 - 3,82 µm là loài B. bassiana và tỉ lệ dài/rộng nhỏ hơn 2 µm cũng được sử dụng như là sự giới hạn cho định danh loài trong chi Beauveria.
Bảng 4.1. Kích thước bào tử của các chủng nấm Beauveria bassiana STT Chủng nấm Đường kính bào tử (µm) Hình dạng bào tử 1 Bb1(SKL-CT) 2,73 ± 0,12 x 2,42 ± 0,11 Hình trứng 2 Bb2(SKL-VL) 2,75 ± 0,13 x 2,45 ± 0,11 Hình trứng 3 Bb3(SKL-VL) 2,93 ± 0,13 x 2,64 ± 0,09 Hình trứng 4 Bb4(SKL-VL) 2,28 ± 0,12 x 2,26 ± 0,12 Hình cầu 5 Bb5(SKL-HG) 2,78 ± 0,12 x 2,41 ± 0,13 Hình trứng 6 Bb6(SKL-KG) 2,24 ± 0,12 x 2,23 ± 0,11 Hình cầu 7 Bb7(SKL-AG) 2,68 ± 0,10 x 2,35 ± 0,10 Hình trứng 8 Bb8(BN-CT) 2,61 ± 0,10 x 2,41 ± 0,13 Hình trứng 9 Bb9(BN-HG) 2,66 ± 0,09 x 2,35 ± 0,11 Hình trứng 10 Bb10(BN-ST) 2,68 ± 0,12 x 2,37 ± 0,11 Hình trứng 11 Bb11(SĐ-CT) 2,67 ± 0,16 x 2,37 ± 0,11 Hình trứng 12 Bb12(RSG-CT) 2,61 ± 0,09 x 2,35 ± 0,09 Hình trứng 13 Bb13(RSG-HG) 2,69 ± 0,18 x 2,38 ± 0,13 Hình trứng 14 Bb14(RSG-TV) 2,68 ± 0,10 x 2,34 ± 0,09 Hình trứng 15 Bb15(RN-ST) 2,64 ± 0,14 x 2,43 ± 0,13 Hình trứng 16 Bb16(SAT-VL) 2,97 ± 0,12 x 2,72 ± 0,14 Hình trứng Ghi chú: Kích thước bào tử được tính theo độ lệch chuẩn trung bình (TB ± SD) của 40 bào tử cho mỗi chủng nấm. Tóm lại, kết quả quan sát đặc điểm về màu sắc tản nấm, cơ quan sinh bào tử (cành bào đài), hình dạng và kích thước sinh bào tử của 16 chủng đều thuộc loài Beauveria bassiana giống với mô tả trong khóa phân loại của De Hoog (1972), Barnett and Barry (1972) Phạm Thị Thùy (2004), Võ Thị Thu Oanh (2010). 4.1.2. Định danh các chủng nấm thuộc chi nấm Beauveria dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử (ITS-rDNA) A B C D E F G H I J K L M N O P 500 bp MK Hình 4.2. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA của các chủng phân lập Beauveria sp., sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) (MK: maker chuẩn, A - P là ký hiệu của 16 chủng nấm Beauveria sp. từ Bb1 - Bb16) Phản ứng PCR được thực hiện với 2 primer ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) khuếch đại vùng ITS-rDNA của tất cả 16 chủng phân lập Beauveria. Kết quả Hình 4.2 cho thấy, sản phẩm sau khi
khuếch đại bằng phản ứng PCR vùng ITS-rDNA trên băng màu xuất hiện 16 vạch đều bằng nhau có chiều dài nằm khoảng 580 bp khi phân tích điện di trên agarose 1%. Tiếp theo các mẫu sẽ được tinh sạch để giải trình tự gen nhằm so sánh với các loài B. bassiana đã biết trước được đăng ký dữ liệu trên Genbank để củng cố bằng chứng tên loài Beauveria bassiana của các mẫu thu thập được. Sơ đồ phân nhóm loài dựa trên cơ sở so sánh trình tự DNA của 20 mẫu Beauveria được trình bày ở Hình 4.3 cho thấy, cây phân nhóm loài được chia thành 3 nhánh chính: Bb1(SKL-CT) AF291871* Bb14(RSG-TV) EU530656* Bb2(SKL-VL) Bb6(SKL-KG) Bb3(SKL-VL) Bb7(SKL-AG) Bb4(SKL-VL) Bb15(RN-ST) Bb5(SKL-HG) 99 EU530654* Beauveria bassiana Bb10(BN-ST) Bb12(RSG-CT) EU530657* EU530660* Bb13(RSG-HG) 99 Bb16(SAT-VL) KU363833* KY682175* Bb9(BN-HG) Bb11(S-CT) Bb8(BN-CT) HQ880771 100 AB027381 Beauveria cylindrospora 100 U19042 U35285 Beauveria brongniartii U35290 Beauveria album Hình 4.3. Sơ đồ phân nhóm loài của 16 chủng nấm Beauveria bassiana phân lập được bằng phương pháp Maximum likelihood dựa trên tình tự của vùng ITS-rDNA. Phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000 lần lặp lại được chỉ trên các nhánh. Các mẫu B. brongniartii, B. cylindrospora và B. album được xem như loài lai xa. Nhánh thứ nhất gồm 16 chủng nấm được phân lập cùng với 4 chủng nấm EU530654, EU530656, EU530657 và EU530660 phân lập tại Việt Nam và 3 chủng nấm AF291871 (Hàn Quốc), KU363833 (Ấn Độ) và KY682175 (Trung Quốc) đã được định danh và đăng ký là loài Beauveria bassiana, tách biệt với một nhánh nhỏ gồm hai