Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo các dòng đậu tương kháng bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow)

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được mẫu giống đậu tương chứa gen kháng bệnh gỉ sắt và chỉ thị phân tử ADN liên kết chặt với các gen kháng hữu hiệu. Chọn tạo được một số dòng/giống đậu tương tốt, chứa gen kháng bệnh gỉ sắt hữu hiệu với các mẫu nấm gây bệnh gỉ sắt ở Việt Nam bằng ứng dụng chỉ thị phân tử ADN.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo các dòng đậu tương kháng bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN KHỞI ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN TẠO CÁC DÕNG ĐẬU TƢƠNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT (Phakopsora pachyrhizi Sydow) CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG MÃ SỐ: 9 62 01 11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2018
Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS. PHAN HỮU TÔN TS. NGUYỄN THANH TUẤN Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN THỊ TRÂM Hội Giống cây trồng Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. LÃ TUẤN NGHĨA Trung tâm Tài nguyên thực vật Phản biện 3: TS. VŨ ĐÌNH CHÍNH Học viện Nông nghiệp Việt Nam Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow gây ra, là một trong những bệnh hại chính trên cây đậu tương, làm giảm nghiêm trọng đến năng suất ở nhiều nước châu Á trong đó có Việt Nam (Nguyễn Thị Bình và cs., 2007). Để phòng chống bệnh có nhiều biện pháp khác nhau, trong đó chọn tạo và trồng giống kháng bệnh mang lại hiệu quả kinh tế cao, không gây ô nhiễm môi trường, tạo nông sản sạch. Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện có 7 gen kháng bệnh, được ký hiệu lần lượt là Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5, Rpp6 và Rpp1b (Bromfield and Hartwig, 1980; McLean and Byth, 1980; Bromfield and Melching, 1982; Hartwig and Bromfield, 1983; Hartwig, 1996; Garcia et al., 2008; Li et al., 2012; Hossain et al., 2014). Phần lớn các gen kháng này cũng đã được lập bản đồ và xác định các chỉ thị phân tử ADN liên kết. Theo đó, gen kháng Rpp1 được xác định nằm trên nhiễm sắc thể (NST) số 18 và liên kết với 2 chỉ thị Sct_187 và Sat_064 với khoảng cách di truyền là 0,4 cM (Hyten et al., 2007); Rpp2 nằm trên NST số 16, liên kết với chỉ thị Sat_255, Satt620 và Satt215 với khoảng cách di truyền lần lượt là 8,1 cM, 4,3 cM và 4,3 cM (Abdelnoor et al., 2007); Rpp3 nằm trên NST số 6, liên kết với các chỉ thị Satt460, Sat_263 và Sat_251 với khoảng cách di truyền lần lượt là 0,5 cM, 0,9 cM và 4,1 cM (David et al., 2009); Rpp4 trên NST số 18, liên kết với chỉ thị Satt288 và Sat_191 với khoảng cách di truyền là 1,19 cM và 6,24 cM (Abdelnoor et al., 2007) và gen kháng Rpp5 nằm trên NST số 3, liên kết với chỉ thị Sat_275 và Sat_280 với khoảng cách di truyền là 4,6 cM và 6,3 cM (Gacia et al., 2008; Khanh et al., 2013). Tuy nhiên, vì mỗi tác giả sử dụng những vật liệu mẫu giống để xác định chỉ thị phân tử liên kết có khác nhau nên khoảng cách di truyền mỗi chỉ thị với mỗi gen cũng có thể khác nhau. Ngoài ra, khoảng cách di truyền của gen có thể thay đổi theo từng genome, đồng thời khi áp dụng trong chọn giống phân tử còn tùy thuộc vào loại chỉ thị và điều kiện cơ sở vật chất. Vì thế, trước khi tiến hành chọn giống phân tử nói chung và chọn giống kháng bệnh gỉ sắt nói riêng thì cần phải lựa chọn được những chỉ thị có liên kết chặt với gen kháng hữu hiệu với các chủng nấm bệnh quan tâm và là loại chỉ thị dễ thực hiện. Để chọn tạo thành công giống đậu tương Việt nam kháng bệnh gỉ sắt bằng ứng dụng chỉ thị phân tử ADN thì cần thiết phải có nguồn gen kháng phong phú, tiếp đến phải đánh giá nguồn gen và xác định được các gen kháng hữu hiệu đối với các chủng nấm gỉ sắt Việt nam và lựa chọn những chỉ thị phân tử có liên kết chặt với mỗi gen kháng rồi tiến hành lai quy tụ nhiều gen kháng hoặc gen kháng hữu hiệu vào giống tốt để tạo ra các dòng, giống kháng bệnh bền vững là việc làm cần thiết và cấp bách hiện nay. 1
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định được mẫu giống đậu tương chứa gen kháng bệnh gỉ sắt và chỉ thị phân tử ADN liên kết chặt với các gen kháng hữu hiệu. - Chọn tạo được một số dòng/giống đậu tương tốt, chứa gen kháng bệnh gỉ sắt hữu hiệu với các mẫu nấm gây bệnh gỉ sắt ở Việt Nam bằng ứng dụng chỉ thị phân tử ADN. 1.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Một số giống đậu tương thu thập, nhập nội và chọn tạo trong nước, mẫu nấm bệnh gỉ sắt phân lập ở Việt nam, các gen kháng bệnh gỉ sắt và chỉ thị phân tử ADN liên kết. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu - Đề tài thực hiện tại Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm và Viện Bảo vệ thực vật từ năm 2013 đến năm 2017 - Khảo sát một số đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng và khả năng kháng bệnh gỉ sắt của tập đoàn 70 mẫu giống đậu tương và các thế hệ con lai; 3 mẫu nấm phân lập bệnh gỉ sắt thu thập từ các địa phương khác nhau ở Việt Nam; 5 gen kháng bệnh gỉ sắt Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 và các chỉ thị phân tử liên kết đã được công bố. 1.4. TÍNH MỚI VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN - Phát hiện được một số mẫu giống đậu tương tốt và 28 mẫu giống chứa từ 1 đến 3 gen kháng bệnh gỉ sắt trong tập đoàn 70 mẫu giống, làm cơ sở dữ liệu giúp các nhà chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt tham khảo sử dụng. - Xác định được 3 gen kháng hữu hiệu (Rpp2, Rpp4 và Rpp5), kháng tốt với các mẫu nấm gây bệnh gỉ sắt đậu tương ở Việt Nam và lựa chọn được 3 chỉ thị phân tử ADN liên kết chặt với 3 gen kháng hữu hiệu là: Satt620 liên kết chặt với gen Rpp2 ở khoảng cách di truyền là 3,33cM; Satt288 với gen Rpp4 là 2,50cM và Sat_275 với gen Rpp5 là 4,16 cM. - Chọn tạo thành công 13 dòng đậu tương tốt chứa 1 hoặc 2 gen kháng hữu hiệu với các mẫu nấm gây bệnh gỉ sắt ở Việt Nam. Trong đó, 2 dòng VD1- 2-1 (Đ9) và VD1-9-1 (Đ10), triển vọng có nhiều đặc điểm tốt đã gửi khảo nghiệm Quốc gia. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học góp phần khẳng định thêm tính hiệu quả của phương pháp chọn tạo giống cây trồng có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử ADN. 2
- Sản phẩm của đề tài là dữ liệu về nguồn gen kháng hữu hiệu, chỉ thị phân tử ADN liên kết chặt với gen kháng, các dòng/giống đậu tương chứa 1-2 gen kháng hữu hiệu với bệnh gỉ sắt là dữ liệu khoa học tham khảo cho các nghiên cứu tiếp sau về chọn tạo giống kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tương. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Hai dòng/giống đậu tương (Đ9 và Đ10) có nhiều đặc điểm nông sinh học tốt, ngắn ngày, năng suất đạt ≥ 2,5 tấn/ha ở vụ Xuân, chứa gen kháng hữu hiệu Rpp2 kháng được nhiều chủng nấm bệnh gỉ sắt ở Việt Nam, góp phần đa dạng hóa bộ giống đậu tương ở phía Bắc Việt Nam. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT ĐẬU TƢƠNG Cùng với sự tăng lên về diện tích, sản lượng đậu tương của thế giới cũng tăng lên nhanh chóng qua các năm. Năm 1960 sản lượng đậu tương thế giới đạt 25,20 triệu tấn, năm 1990 tăng lên 104,19 triệu tấn. Đến năm 2000, sản lượng đậu tương toàn thế giới đạt 151,41 triệu tấn, tăng 6 lần so với năm 1960. Đến năm 2016 sản lượng đậu tương toàn thế giới đạt 323,70 triệu tấn, tăng gần 12,6 lần so với năm 1960. Ở Việt Nam theo Phạm Văn Thiều (2006), đậu tương được trồng ở nước ta từ rất sớm. Tuy nhiên, trước cách mạng tháng 8/1945 diện tích trồng còn ít (30.000 ha năm 1944). Sau khi đất nước thống nhất (1976) diện tích trồng mới được bắt đầu mở rộng. Những năm gần đây, diện tích và sản lượng đậu tương có nhiều biến động và có xu hướng giảm dần về diện tích. Diện tích trồng đậu tương của nước ta năm 1995 là 121,10 nghìn ha, tăng dần qua các năm và đạt cao nhất vào năm 2005 với 204,10 nghìn ha sau đó giảm xuống còn 146,20 nghìn ha vào năm 2009, đến năm 2016 diện tích toàn quốc chỉ còn 110,0 nghìn ha (FAO, 2017). 2.2. BỆNH GỈ SẮT, PHÂN BỐ VÀ TẦM QUAN TRỌNG Nấm gỉ sắt gây bệnh được phát hiện đầu tiên ở Nhật bản vào năm 1902 và lần lượt được ghi nhận ở Đông Nam Á và Australia vào năm 1934, ở Ấn Độ vào năm 1951 (Sharma and Mehta, 1996), Hawaii năm 1994 (Killgore and Heu, 1994) và ở châu Phi vào năm 1996 (Akinsanmi, 2001). Ở Nam Mỹ, tại Brazil mức độ gây hại của bệnh này đầu tiên được ghi nhận vào năm 2001 (Yorinori et al., 2005). Tiếp sau năm đó bệnh hại được thông báo ở Argentina, Bolivia và Colombia (Rossi et al., 2003). Năm 2004, bệnh gỉ sắt đậu tương được công bố đầu tiên ở nước Mỹ (Schneider et al., 2005). Tại những vùng bị nhiễm bệnh nặng, thu hoạch có thể giảm tới 80%. Một số nước đã thông báo về mức độ thiệt hại do bệnh gỉ sắt đậu tương gây ra như ở Thái Lan làm giảm năng suất từ 10-40%, ở Ấn Độ giảm từ 10-90%, nam Trung Quốc là 10-50%, ở Đài Loan là 23-90% và giảm 40% là ở Nhật Bản (Jason and Pedersen, 3
2009). Báo cáo sớm nhất về các biến chủng gây bệnh của nấm Phakopsora pachyrhizi sydow là từ Đài Loan vào năm 1966 (Lin, 1966). Sau đó, tại Úc vào năm 1980 người ta đã xác định và phân lập được 2 chủng nấm bệnh (McLean & Byth, 1980). Kể từ đó, các chủng khác nhau của nấm P. pachyrhizi đã được xác định và phân lập trên toàn cầu. Nghiên cứu tính độc của các chủng P. pachyrhizi của một số tác giả sau này (Schmitz et al., 2014; Reis et al., 2015; Song et al., 2015; Chang et al., 2016) đều nhận định chung rằng tính kháng của các gen kháng chỉ có khả năng duy trì trong một thời gian ngắn là do quá trình biến đổi tạo ra chủng sinh lý mới của nấm bệnh liên tục xảy ra. Ở Việt Nam, nghiên cứu của Pham et al. (2009), cho rằng tính độc của các chủng P. pachyrhizi là không ổn định đối với một số kiểu gen kháng nhất định. Tuy nhiên, đã có sự nhất quán giữa kiểu gen kháng với các chủng nấm bệnh ở Việt Nam trong một thời gian dài. Ví dụ, giống ĐT2000 có khả năng kháng cao đối với chủng nấm phân lập ở Việt Nam từ năm 1990 (Nguyễn Thị Bình, 1990), đến nay ĐT2000 vẫn kháng mạnh với nhiều chủng nấm biểu hiện cho kiểu vết bệnh RB điển hình và có chỉ số AUDPC thấp. Nên hiện nay ĐT2000 thường được dùng làm giống đối chứng kháng chuẩn trong các nghiên cứu về nấm bệnh gỉ sắt (Nguyễn Thị Bình và cs., 2007; Vũ Thanh Trà, 2013). 2.3. ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN ĐẬU TƢƠNG Theo Nelson (2009), hiện nay trên thế giới có trên 70 quốc gia đang sở hữu khoảng 170.000 mẫu giống đậu tương, 30% trong số này là các mẫu giống đặc hữu và chỉ có 10% là mẫu giống đậu tương dại. Nước đang sở hữu nguồn gen đậu tương phong phú và đa dạng nhất phải kể đến là Trung Quốc và Mỹ. Hai nước này đang bảo tồn tập đoàn các giống đậu tương lớn nhất thế giới, thu thập từ nhiều nước khác nhau như Australia, Brazil, Đức, Nhật Bản, Ấn Độ, Thụy Điển, Nga (Dong et al., 2001). Các mẫu giống này được gieo trồng, đánh giá và phân loại theo một số tiêu chí về đặc điểm hình thái, kiểu sinh trưởng, đặc điểm nông sinh học, thời gian sinh trưởng, năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu với các điều kiện vô và hữu sinh, phục vụ các chương trình lai tạo giống khác nhau. Ở Việt Nam, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã thu thập và đang bảo tồn trên 500 mẫu giống đậu tương nhập nội và địa phương. Kết quả khảo sát, đánh giá cho thấy nhiều giống địa phương có khả năng chống chịu tốt với nóng, hạn và sâu bệnh, nhưng có năng suất thấp, chất lượng trung bình. Các giống nhập nội thường có hạt to, năng suất cao và chất lượng tốt (Nguyễn Huy Hoàng, 1992). Để xác định nguồn gen đậu tương kháng gỉ sắt, Miles et al. (2006), đã đánh giá tính kháng/ nhiễm của 16.000 mẫu giống đậu tương tại Mỹ bằng lây nhiễm nhân tạo với 5 chủng P. Pachyrhizi. Kết quả cho thấy, có 850 mẫu giống 4
có khả năng chống chịu một phần hoặc có phản ứng kháng, chiếm khoảng 5% toàn bộ nguồn gen của USDA. Các nghiên cứu sau đó đã xác định được một số kiểu gen kháng khác nhau (Laperuta et al., 2008; Pierozzi et al., 2008; Harris et al., 2015). Hiện nay, ở châu Á nhiều mẫu giống đậu tương mang các gen kháng bệnh chuyên biệt đã được Trung tâm Rau màu thế giới (VWRDC) công bố và giới thiệu (Yamanaka et al., 2015). Nghiên cứu ở Việt Nam đã xác định được một số mẫu giống đậu tương có tính kháng cao với bệnh gỉ sắt là Nhất Tiến HLLS, DT95, Cao Bằng U8325 và ĐT2000, Đậu tương hạt xanh, Vàng Mường Khương... (Nguyễn Thị Bình, 1990; Nguyễn Thị Bình và cs., 2007; Vũ Thanh Trà, 2013). 2.4. DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở ĐẬU TƢƠNG VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT Nghiên cứu của Bromfield and Hartwig (1980), nhận thấy giống đậu tương khác nhau trồng cạnh nhau, trong cùng điều kiện có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt. Điều này chứng tỏ các giống có chứa gen kháng gây lên. Trên cơ sở phân tích quần thể F1 và F2 tổ hợp lai giữa cặp bố mẹ kháng và nhiễm, tác giả khẳng định gen quy định tính kháng là trội so với tính nhiễm. Sau đó nhiều nghiên cứu tiếp đều khẳng định, tính kháng bệnh gỉ sắt là trội và do 7 gen đơn quy định, ký hiệu là Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5, Rpp6 và Rpp1b (McLean and Byth, 1980; Bromfield and Melching, 1982; Hartwig and Bromfield, 1983; Hartwig, 1986; Garcia et al., 2008; Li et al., 2012; Paul et al., 2013; Hossain et al., 2014; Liu et al., 2016). Tuy nhiên, mỗi gen kháng trên chỉ kháng được với một số chủng bệnh nhất định mà không kháng được với tất cả các chủng nên cùng một giống có thể biểu hiện kháng khi trồng ở nơi này nhưng lại bị nhiễm khi được trồng ở nơi khác. (Monteros et al., 2007; Yorinori et al., 2005; Garcia et al., 2008; Barbosa et al., 2013; Langenbach et al., 2016). Quy tụ nhiều gen kháng vào một giống được coi là biện pháp hữu ích nhất hiện nay trong chiến lược chọn tạo giống kháng phổ rộng (Campe et al., 2014). Một khả năng khác để tăng cường tính kháng của cây trồng với sâu bệnh hại là xác định và khai thác các gen kháng đơn có khả năng kháng hữu hiệu với nhiều chủng bệnh khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Narusaka et al., 2009; Atamian et al., 2012; Cooper et al., 2013; Morales et al., 2013; Seung et al., 2016). Nghiên cứu của Pham et al. (2010), cho thấy gen kháng Rpp1 và Rpp3 mẫn cảm với chủng bệnh gỉ sắt ở Việt Nam, trong khi đó gen kháng Rpp2 và Rpp4 lại kháng tốt. Hiện nay, hầu hết các gen kháng bệnh gỉ sắt đã được lập bản đồ xác định các chỉ thị phân tử liên kết. Theo đó, gen kháng Rpp1 nằm trên NST số 18, liên kết chặt với 2 chỉ thị Sct_187 và Sat_064 với khoảng cách di truyền là 0,4 cM (McLean and Byth, 1980; Hyten et al., 2007); Rpp2 nằm trên NST 5
số 16, liên kết với chỉ thị Sat_255, Satt620 và Satt215 với khoảng cách di truyền lần lượt là 8,1 cM, 4,3 cM và 4,3 cM (Hartwig & Bromfield, 1983; Silva et al., 2008), Rpp3 nằm trên NST số 6, liên kết với các chỉ thị Satt460, Sat_263 và Sat_251 với khoảng cách di truyền lần lượt là 0,5 cM, 0,9 cM và 4,1 cM (Hartwig and Bromfield, 1983; Monteros et al., 2006; Hyten et al., 2009; David et al., 2009); Rpp4 trên NST số 18, liên kết với chỉ thị Satt288 và Sat_191 với khoảng cách di truyền là 1,19 cM và 24,8 cM (Hartwig, 1986; Silva et al., 2008), gen kháng Rpp5 nằm trên NST số 3, liên kết với chỉ thị Sat_275 và Sat_280 với khoảng cách di truyền là 4,6 cM và 6,3 cM (Gacia et al., 2008) và gen kháng Rpp6 nằm trên nhiễm sắc thể số 18 liên kết chặt với chỉ thị Satt324 và Satt394 (Li et al., 2012). Tuy nhiên, mức độ liên kết của mỗi chỉ thị ADN với mỗi gen phụ thuộc vào khoảng cách di truyền giữa chúng và có thể khác nhau tùy mỗi nguồn vật liệu sử dụng. Vì thế, để sử dụng các chỉ thị này trong chọn tạo giống kháng bệnh bằng chỉ thị phân tử thì nhà chọn giống cần xác định lại độ liên kết thực của từng chỉ thị với mỗi gen kháng trên nguồn vật liệu nghiên cứu của mình. 2.5. ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG Hiện nay, một số chỉ thị phân tử ADN được sử dụng phổ biến trong các chương trình chọn giống phân tử như RAPD, SSR, STS, SNP. Kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều loại đối tượng cây trồng khác nhau ở Việt Nam như lúa, ngô, đậu tương, lạc, chuối... trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài (Bùi Văn Thắng và cs., 2003; Phan Hữu Tôn., 2005), phân tích và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn ở mức độ phân tử (Đinh Thị Phòng, 2008). Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên nhiều đối tượng cây trồng trong đó có đậu tương (Barakat et al., 2009). Các chỉ thị SSR đã được dùng để chọn dòng kháng bệnh khảm virus ở cây đậu tương (Akkaya et al., 1992), xác định đa dạng di truyền ở đậu tương (Vũ Thanh Trà và cs., 2006; Triệu Thị Thịnh và cs., 2010). Một vài mô hình MAS đã được các nhà khoa học đưa ra và phân tích cặn kẽ hơn (Avise, 2012, Charcosset and Moreau, 2004; Shingh et al., 2011; Prasanna et al., 2010). Theo một số mô hình, chỉ cần tiến hành lai qua 4 thế hệ chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn lọc có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế. Thành công của MAS còn phụ thuộc vào vị trí của chỉ thị so với gen quan tâm (Basyirin et al., 2009). Hiện nay, việc ứng dụng MAS ở Việt Nam trong chọn tạo giống đã đạt được nhiều thành tựu trên nhiều đối tượng cây trồng như lúa, ngô, đậu tương... (Phan Hữu Tôn và cs., 2005; Huyen et al., 2012; Dương Xuân Tú và cs., 2016) 6
Gần đây, các nhà khoa học đã đưa ra một phương pháp chọn giống phân tử mới – đó là “Chọn giống hồi giao nhờ chỉ thị phân tử - Marker Assited Backcrossing – MABC” (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa một gen quý hoặc nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt. Ở Việt Nam, nhóm tác giả của Viện Di truyền nông nghiệp đã chọn tạo thành công các dòng mang gen/ QTL Saltol chịu mặn và Sub1 chịu gập có nền di truyền của giống lúa trồng phổ biến ở Việt Nam như Bắc Thơm 7- Saltol, AS996- Saltol, Bắc Thơm 7- Sub1, AS996- Sub1, Khang Dân 18- Sub1, OM6976- Saltol (Le et al., 2011; 2012) 2.6. MỘT SỐ THÀNH TỰU TRONG CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU TƢƠNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Công tác chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt trên thế giới trong những năm qua đã đạt được nhiều thành tựu to lớn. Trung tâm Nghiên cứu và phát triển rau màu thế giới (WVRDC) đã chọn tạo và giới thiệu được hàng trăm giống đậu tương mang gen kháng với bệnh gỉ sắt như PI 200492, PI 462312, PI 230970, PI 230971, PI 293871A, PI 239871B, PI 459024, PI 459025, Tainung 4, Taita Kaohsiung No.5, Wayne... (dẫn theo Langenbach et al., 2016). Tại Brazil, các giống An-76, BR01-18437, UFO 001, UFO 006, UFO 007, UFO 009 và UFO 0013 kháng cao với bệnh gỉ sắt đã được chọn tạo (Neto, 2007; Martins and Juliatti, 2012). Tại Châu Phi, IITA đã chọn tạo thành công giống đậu tương TGX 1835-10E, có khả năng kháng với các chủng chủng bệnh gỉ sắt ở miền Trung, miền Đông, miền Tây và miền Nam châu Phi. TGX 1835-10E có khả năng kháng với tất cả các chủng bệnh đã biết tại Nigienia và là giống kháng được sử dụng phổ biến trong sản xuất tại Uganda (Hassan et al., 2014). Gần đây, Nhật Bản đã thành công khi sử dụng chỉ thị phân tử quy tụ nhiều gen kháng gỉ sắt vào các giống đậu tương như No6-12-B (Rpp4 + Rpp5), Oy49-4 (Rpp2 + Rpp3 + Rpp4) và No6-12-1 (Rpp2 + Rpp4 + Rpp5) (Yamanaka et al., 2015). Ở Việt Nam, các nghiên cứu gần đây về chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt phần lớn chỉ tập trung vào đánh giá đa dạng nguồn vật liệu, các nghiên cứu về chọn tạo giống kháng còn rất hạn chế. Khanh et al. (2013), đã bước đầu thành công trong ứng dụng MABC lai chuyển gen kháng Rpp5 có trong giống đậu tương ĐT2000 vào giống HL203. Bùi Chí Bửu và cs. (2013), đã chọn tạo thành công giống đậu tương HLĐN 29 theo phương pháp hồi giao từ tổ hợp lai HLĐN 1 x Kettum. Như vậy, công tác nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt trên thế giới trong những năm qua đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, nhiều 7
giống mang gen kháng đã được chọn tạo và đưa vào sản xuất, trong đó có những giống được tích hợp từ 2 – 3 gen kháng và thể hiện khả năng kháng cao với các chủng bệnh gỉ sắt. Tuy nhiên công tác nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt ở Việt Nam cho đến nay còn rất nhiều hạn chế. Phương pháp chọn tạo sử dụng vẫn chủ yếu là phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống. Nhiều nghiên cứu về đánh giá tính kháng bệnh gỉ sắt trên tập đoàn các mẫu giống đậu tương địa phương của Việt Nam đã khẳng định một số mẫu giống có khả năng kháng cao với bệnh gỉ sắt như ĐT2000, Nhất Tiến HLLS, Cao Bằng U8325, DT95... đây là nguồn gen quý có thể khai thác phục vụ công tác lai tạo giống đậu tương mới kháng bệnh gỉ sắt ở Việt Nam tuy nhiên, các mẫu giống này hiện nay vẫn chưa được phát hiện mang những gen kháng gì trong các gen kháng đã được công bố bằng sử dụng chỉ thị phân tử. Ngoài ra, chúng ta vẫn còn rất hạn chế trong việc nghiên cứu xác định các gen kháng hữu hiệu với các chủng bệnh gỉ sắt theo các vùng sinh thái. PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 70 mẫu giống đậu tương địa phương và nhập nội; 3 chủng nấm gây bệnh gỉ sắt (IS-15: Miền Bắc; IS-17: Miền Trung; IS-28: Miền Nam); 12 cặp mồi chỉ thị SSR liên kết với các gen kháng đã công bố. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ công tác lai tạo và chọn lọc các dòng đậu tương theo mục tiêu - Lựa chọn chỉ thị phân tử ADN liên kết chặt với gen kháng bệnh - Lai tạo và chọn lọc dòng đậu tương mới 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Đánh giá đặc điểm nông học, hình thái, năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu thực hiện trong vụ Xuân 2013, bố trí theo phương pháp khảo sát tập đoàn, tuần tự, không nhắc lại, mỗi giống trồng 10m2, đối chứng là giống DT84. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá theo QCVN 01- 68:2011/BNNPTNT cho cây đậu tương - Nhiễm bệnh và đánh giá tính kháng theo Nguyễn Thị Bình và cs. (1990). Từng chủng nấm được duy trì thường xuyên trên giống mẫn cảm (ĐT12) trồng trong lồng lưới cách ly. - Lựa chọn chỉ thị phân tử: Sử dụng quần thể F2 của các tổ hợp lai giữa giống mẫn cảm bệnh làm mẹ, bố là các giống chuẩn kháng. Đánh giá kiểu gen 8
kháng bằng chỉ thị phân tử nghiên cứu, đánh giá kiểu hình kháng/ nhiễm bằng lây nhiễm nhân tạo. Khoảng cách liên kết (cM) giữa chỉ thị ADN và gen kháng được tính dựa trên tần số trao đổi chéo giữa gen kháng và chỉ thị khi hình thành giao tử ở F1 và biểu hiện (%) sai khác về kiểu gen và kiểu hình ở thế hệ F2 - Lai tạo và chọn lọc: Lai tạo theo phương pháp truyền thống, sử dụng chỉ thị phân tử chọn cá thể mang gen mục tiêu ở các thế hệ phân ly (MAS) và chọn cá thể nhận ở các phép lai lại (MABC). So sánh dòng triển vọng, bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD), 3 lần nhắc lại, đối chứng là giống DT84. 3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu thí nghiệm so sánh dòng triển vọng được phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm IRRISTAT 5.0 theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) và thống kê bằng chương trình Excel. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU 4.1.1. Đánh giá nông sinh học và năng suất Kết quả theo dõi một số đặc điểm nông sinh học các mẫu giống đậu tương cho thấy, chiều cao cây các mẫu giống đậu tương có sự biến động lớn từ 27,1 cm đến 70,5 cm và phần lớn các mẫu giống có chiều cao cây trung bình, điển hình như AK03, TL7, Đ8, OMDN122 và DT96. Đa số các mẫu giống có chiều cao đóng quả tập trung trong khoảng từ 11 - 13 cm. TGST của các mẫu giống dao động từ 81 - 105 ngày, có 12 mẫu giống có TGST thuộc nhóm ngắn ngày, điển hình là giống Đ2601, M103, AK03, DT84, Parent và D43. Còn lại phần lớn các mẫu giống có TGST thuộc nhóm trung và dài ngày Kết quả đánh giá về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất cho thấy, các giống có số quả/ cây cao (> 38 quả) như AK03, Đ8, TL7, AK03 và M103. Còn lại phần lớn các mẫu giống có số quả trên cây dao động từ 25- 35 quả. Có 4 mẫu giống có tỷ lệ quả 3 hạt lớn > 40% là AK03, DT84, TL7 và Đ9804. Còn lại đa số mẫu giống có tỷ lệ quả 3 hạt dao động từ 10 – 30%. Về khối lượng nghìn hạt, có 27 mẫu giống có M1000 hạt thuộc nhóm hạt to, điển hình như như Đ8, DT84 và DT96. Kết quả đánh giá về năng suất cho thấy các mẫu giống có năng suất dao động từ 2,0g (Parent) – 11,9g (M103). Có 12 mẫu giống cho năng suất cao (> 10g/ cây) là các giống Đ9804, Đ2101, Đ8, ĐT26, TL7, AK03, M103 và DT84. Những mẫu giống còn lại có năng suất cá thể thuộc nhóm trung bình khá, dao động trong khoảng từ 5 – 8 g/cây. Qua kết quả đánh giá đặc nông sinh học, năng suất nhận thấy một số mẫu giống đậu tương tốt (TGST < 100 ngày, năng suất cá thể ≥ 10g) có thể sử dụng trong lai tạo giống mới như Đ9804, Đ2101, Đ8, TL7, AK03, DT84, M103, ĐH4... 9
4.1.2. Phát hiện nguồn gen đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt Sử dụng 12 chỉ thị phân tử ADN khảo sát 70 mẫu giống đậu tương. Cụ thể, để phát hiện gen kháng Rpp1 sử dụng 2 chỉ thị Sct_187 và Sat_064; Phát hiện gen kháng Rpp2 sử dụng 3 chỉ thị Satt215, Satt620 và Sat_255; Phát hiện gen kháng Rpp3 sử dụng 3 chỉ thị Satt460, Sat_251 và Sat_263. Phát hiện gen kháng Rpp4 sử dụng 2 chỉ thị Sat_191 và Satt288; Phát hiện gen kháng Rpp5 sử dụng 2 chỉ thị Sat_275 và Sat_280. Đối chứng phát hiện gen là những giống chỉ thị PI chứa đơn gen kháng nhất định. Mẫu giống nào cho đa hình vạch band kháng có kích thước giống với đối chứng kháng thì được kết luận là có mang gen kháng đó. Hình điện di đại diện đối với gen Rpp2, Rpp4 và Rpp5 được đưa ra trong Hình 4.1 và kết quả phát hiện gen kháng được trình bày ở bảng 4.1. Giếng 1: Marker; Giếng 2: Đ/c nhiễm V74 không chứa gen cho vạch băng kích thước 330bp; Giếng 3: Đ/c kháng PI230970 chứa gen kháng Rpp2 cho vạch băng có kích thước 285bp; Giếng 4, 6, 7, 8 và 11 là các mẫu giống chứa gen kháng, giếng 5,9,10 và 12 là các mẫu giống không Chỉ thị Satt620 chứa gen kháng Rpp2. Giếng 1: Marker; Giếng 2: Đ/c nhiễm giống V74 cho vạch băng có kích thước 245bp; Giếng 3: Đ/c kháng PI459025B mang gen Rpp4 cho vặch băng có kích thước 260bp; Giếng 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 và 12 là các mẫu giống chứa gen kháng Rpp4, giếng 9 là giống không chứa gen Rpp4. Chỉ thị Satt288 Giếng 1: Marker; Giếng 2: Đ/c nhiễm V74 cho vạch band có kích thước 255bp; Giếng 3: Đ/c kháng PI200256 mang gen Rpp5 cho vệt band có kích thước 275bp; Giếng 5, 6, 7, 9, 11, 12 là các mẫu giống chứa gen kháng và giếng 4, 8, 10 là các mẫu giống không chứa gen kháng Rpp5 Chỉ thị Sat_275 Hình 4.1. Ảnh điện di phát hiện gen kháng với chỉ thị Satt620, Satt288, Sat_275 10
Kết quả bảng 4.1 cho thấy, có 5 mẫu giống được phát hiện chứa gen kháng Rpp1, 2 mẫu giống được phát hiện chứa gen kháng Rpp2, 5 mẫu giống chứa gen kháng Rpp3, 2 mẫu giống chứa gen kháng Rpp4 và 7 mẫu giống chứa gen kháng Rpp5. Đặc biệt một số mẫu giống chứa đồng thời nhiều gen kháng như Nhất Tiến HLLS chứa 3 gen Rpp2, Rpp4 và Rpp5, Cao Bằng U8325 chứa 2 gen Rpp1 và Rpp2, giống ĐT2000 chứa 2 gen Rpp2 và Rpp5, giống Như Khê chứa 2 gen Rpp2 và Rpp4 và giống DT95 chứa 2 gen Rpp1 và Rpp4. Bảng 4.1. Kết quả phát hiện gen kháng bệnh gỉ sắt bằng ứng dụng chỉ thị phân tử ADN vụ Xuân 2013 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm Gen kháng Mẫu giống mang gen Tổng Rpp1 Parent, HL07-15, DT90, Đ8, ĐH4 5 Rpp2 D43, Chandra 2 Rpp3 Dòng 1 OT, 104 Tím, Đ2501, Đ2102, HLĐN1 5 Rpp4 OMDN112, ĐT26, 2 CLVR64, ĐVN11, ĐVN10, TL2901, Rpp5 7 TL87008, Dòng 1 – 2, MTĐ652-5 Rpp1 + Rpp2 Cao bằng 1 Rpp1 +Rpp4 DT95, PI647082 2 Rpp2 +Rpp4 Như Khê 1 Rpp2 +Rpp5 ĐT2000, ĐT92 2 Rpp2 +Rpp4 +Rpp5 NHất Tiến HLLS 1 Tổng 28 Để đánh giá kiểu hình của các mẫu giống chứa gen và không chứa gen có kháng được một số chủng nấm gỉ sắt đại diện cho 3 vùng sinh thái Việt Nam hay không. Các mẫu giống đậu tương trong tập đoàn được tiến hành lây nhiễm trong điều kiện nhân tạo với các chủng nấm bệnh gỉ sắt phân lập đại diện thu thập từ 3 vùng miền khác nhau của Việt Nam (Bắc -Trung - Nam). Kết quả đánh giá (bảng 4.2) cho thấy, có 19 mẫu giống biểu hiện tính kháng với chủng nấm IS – 15 (đại diện khu vực miền Bắc), 22 mẫu giống biểu hiện kháng với chủng nấm IS – 17 (đại diện khu vực miền Trung) và 22 mẫu giống biểu hiện kháng với chủng IS – 28 (đại diện khu vực miền Nam). Có 13 mẫu giống biểu hiện tính kháng với cả 3 chủng nấm gây bệnh, đại diện như OMDN1, Như Khê, D43, ĐVN11... 11
Bảng 4.2. Kết quả đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh gỉ sắt bằng nhiễm bệnh nhân tạo năm 2013 tại Từ Liêm, Hà Nội Nguồn bệnh Nguồn bệnh T T Mẫu giống IS- IS- IS- Mẫu giống IS - IS- IS- T T 15 17 28 15 17 28 1 OMDN112 K K K 36 Đ9804 K K K 2 PI647083 N N N 37 LS14 N N N 3 DT96 N N N 38 Đ2501 N N N 4 Parent N N N 39 ĐVN10 N N K 5 Cúc BH nâu N N N 40 TL2901 K N K 6 Như khê K K K 41 Đ2101 K K K 7 DT95 K K K 42 TL2902 N N N 8 MAC01 N N N 43 Đ2102 K N N 9 Dòng 1 OT N N N 44 Đ8 N N N 10 OMDN29 N N N 45 ĐT92 K K K 11 PI647082 N K K 46 Đ2601 N N N 12 ĐT26 K K K 47 TL7 N K K 13 PI647084 K K K 48 ĐT20 N N N 14 Dòng 4 OT N N N 49 AK03 N N N 15 Dòng 3 OT N N N 50 ĐH4 N N N 16 C.Bằng U8325 K K K 51 VX-1 N N N 17 C5C6 N N N 52 DT84 N N N 18 HL203 N N N 53 N.Tiến HLLS K K K 19 Dòng 2 OT N N N 54 DT99 N N N 20 CLVR 64 N N K 55 M103 N N N 21 104 Tím N K N 56 ĐT22 N N N 22 DT 2001 N N N 57 HLĐN1 K K N 23 HL 07-5 N N N 58 HLĐN29 K N N 24 HL07-2 N N N 59 PI457023 K K K 25 DT2008 N N N 60 L098-11 N N K 26 HL07-15 N N N 61 MTĐ750 N K N 27 104 Trắng N K N 62 Dòng 1-2 N N K 28 D43 K K K 63 MTĐ652-5 N K K 29 Chandra K K N 64 PI200492 N N N 30 DT90 K N N 65 PI230970 K K K 31 ĐT2000 K K K 66 PI462312 K N N 32 ĐVN12 N N N 67 PI459025B K K K 33 DT2007 N N N 68 PI200256 N K K 34 ĐVN11 K K K 69 V74 N N N 35 LS16 N N N 70 ĐT12 N N N Ghi chú: - K: Kháng; -N: Nhiễm 12
Nghiên cứu khả năng kháng của từng gen kháng với 3 chủng nấm gỉ sắt Việt Nam cho thấy, những mẫu giống chỉ chứa một gen kháng Rpp1 hoặc Rpp3 như HL07-15, Đ8, ĐH4, Dòng 1 OT, Đ2501, Đ2102 và 2 dòng kháng chuẩn là PI200492 (Rpp1) và PI462312 (Rpp3) hầu hết cho phản ứng nhiễm với cả 3 chủng nấm gây bệnh. Trong khi đó, các mẫu giống chỉ chứa duy nhất gen kháng Rpp2 hoặc Rpp4 như D43, Chandra, OMDN112, ĐT26...và 2 dòng kháng chuẩn là PI23097 (Rpp2) và PI459025B (Rpp4) biểu hiện kháng tốt với cả 3 chủng nấm gây bệnh gỉ sắt đậu tương ở Việt Nam. Những mẫu giống chứa gen kháng Rpp5 như CLVR 64, ĐVN 10, ĐVN 11, MTĐ 652-5 và dòng kháng chuẩn PI200256 (Rpp5) hầu hết cho phản ứng nhiễm với chủng bệnh thuộc khu vực miền Bắc là IS - 15 nhưng kháng rất tốt với chủng bệnh thuộc khu vực các tỉnh miền Nam là IS - 28. Từ kết quả này, có thể kết luận gen kháng Rpp2 và Rpp4 là 2 gen kháng hữu hiệu với các chủng nấm bệnh gỉ sắt Việt Nam, gen Rpp5 kháng hữu hiệu với chủng bệnh chỉ ở khu vực miền Nam Việt Nam. Một số mẫu giống mang các gen kháng hữu hiệu trên như Như Khê, DT95, ĐT2000, Cao Bằng U8325, Nhất Tiến HLLS, ĐT92, OMDN112, PI230970, PI459025B có thể sử dụng làm vật liệu lai tạo trong chọn giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt ở Việt Nam 4.2. KẾT QUẢ LỰA CHỌN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT VỚI GEN QUY ĐỊNH TÍNH KHÁNG Gen và chỉ thị nằm cùng trên 1 NST hoặc nhóm liên kết, F1 khi hình thành giao tử, trao đổi chéo xảy ra ở những đoạn NST tương đồng do đó có thể gen và chỉ thị không cùng đi về 1 giao tử (bị phá vỡ liên kết) dẫn đến sự sai khác ở F2 về kiểu gen được xác định bằng chỉ thị và kiểu hình do kiểu gen qui định. Dựa vào tỷ lệ sai khác giữa kiểu gen (được xác định bằng các chỉ thị) và kiểu hình (thông qua đánh giá nhân tạo) trên quần thể phân ly F2 để tính tỷ lệ giao tử trao đổi chéo (giữa gen và chỉ thị) của F1, theo qui ước 1% chao đổi chéo = 1cM. Kết quả phân tích kiểu gen kháng kết hợp với đánh giá tính kháng/nhiễm của các cá thể trong quần thể F2 của các tổ hợp lai được trình bày trong bảng 4.3. Kết quả phân tích cho thấy các chỉ thị được lựa chọn có liên kết với gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tương tương đối chặt, khoảng cách di truyền < 5cM: Rpp2 liên kết với chỉ thị Satt620 ở khoảng cách di truyền 3,33cM; Rpp4 liên kết với chỉ thị Satt288 ở khoảng cách di truyền 2,5 cM và Rpp5 liên kết với chỉ thị Sat_275 ở khoảng cách di truyền 4,16cM. Các chỉ thị được lựa chọn (Satt620 – Rpp2; Satt288 – Rpp4; Sat_275 – Rpp5) được sử dụng để nhận diện gen kháng trong lai tạo và chọn lọc dòng đậu tương kháng bệnh gỉ sắt trong tập đoàn vườn dòng chọn. 13
Bảng 4.3. Kết quả phân tích kiểu gen kháng bằng chỉ thị phân tử kết hợp với đánh giá kiểu hình bằng nhiễm bệnh nhân tạo trên quần thể phân ly F2 Chỉ Kiểu Tổng số Số cá thể Số cá thể Trao đổi Tổ hợp thị gen cá thể Kháng Nhiễm chéo (cM) RR 46 43 3 Satt215 Rr 51 47 4 7,50 rr 23 2 21 RR 28 26 2 V74 × PI230970 (Rpp2) Satt 620 Rr 66 65 1 3,33 rr 26 1 25 RR 41 39 2 Sat_255 Rr 53 50 3 5,00 rr 26 1 25 RR 39 37 2 Sat_191 Rr 67 63 4 6,67 rr 14 2 12 V74 × PI459025B (Rpp4) RR 36 34 2 Satt288 Rr 65 65 0 2,50 rr 19 1 18 RR 40 38 2 Sat_ 275 Rr 55 53 2 4,16 rr 25 1 24 V74 × PI200256 (Rpp5) RR 38 35 3 Sat_ 280 Rr 62 60 2 5,83 rr 20 2 18 4.3. LAI TẠO VÀ CHỌN LỌC DÕNG ĐẬU TƢƠNG THEO MỤC TIÊU Trên cơ sở kết quả đánh giá tập đoàn các mẫu giống đậu tương vật liệu, kết hợp kế thừa các kết quả nghiên cứu đã được công bố, chúng tôi đã thiết lập và lai tạo được 18 tổ hợp lai theo mục tiêu nghiên cứu trong vụ Xuân 2013, các mẫu giống sử dụng làm bố là các mẫu giống mang gen kháng và có tính kháng cao với bệnh gỉ sắt ở Việt Nam như ĐT2000, Nhất Tiến HLLS, Cao Bằng U8325, DT95, MTĐ652-5, PI459025, MTĐ750 và một số dòng chuẩn kháng... Các mẫu giống sử dụng làm mẹ là các dòng, giống có thời gian sinh trưởng ngắn, tiềm năng năng suất cao như DT84, TL7, AK03, M103, Đ8, ĐH4, HL07-15... Hạt lai được gieo trồng trong điều kiện nhà lưới để phát triển thế hệ F1, tiến hành loại bỏ cây tự thụ. Các tổ hợp có con lai sinh trưởng, phát triển tốt, tiềm năng năng suất cao được lựa chọn tiếp tục tự thụ phát triển quần thể phân ly F2 phục vụ chọn lọc dòng phân ly ứng dụng MAS (Marker – Assisted – Selection). Một số tổ hợp lai có mẹ là các giống đậu tương năng suất cao cần cải tiến tính kháng với bệnh gỉ sắt như AK03, ĐH4, DT84, TL7, Đ8 được sử dụng cho lai backcross liên tục đến thế hệ BC3F1. Ở thế hệ phân ly F2 của các 14
tổ hợp lai đơn, bằng MAS chọn được 132 cây có chứa gen Rpp2, 91 cây chứa gen Rpp4, 42 cây chứa gen Rpp5 và 10 cây có chứa cả Rpp2 và Rpp5 đồng hợp tử. Hạt của từng cây mang gen đồng hợp tử sẽ được hỗn lại gieo thành dòng thế hệ F3. Từ thế hệ F3 chọn cây tốt có kiểu hình đẹp với mục tiêu: thời gian sinh trưởng ngắn (≤ 100 ngày), hạt to (≥ 160g), tiềm năng năng suất cao (≥ 25 tạ/ ha), cao cây trung bình 40 – 60 cm; phân cành nhiều, chống đổ điểm 1 – 2. Các dòng chọn lọc cùng tổ hợp được gieo tuần tự cạnh bố mẹ xen kẽ 10 dòng. Kết quả đến vụ Thu Đông 2014, chọn được 137 dòng đạt yêu cầu ở thế hệ F5, trong đó có 60 dòng tốt, độ thuần cao được đánh giá sơ bộ trong vụ Xuân 2015 và chọn được 13 dòng triển vọng ở thế hệ F7 gồm: VD1-1-1 và VD1-1-2 chọn từ tổ hợp Đ8 x ĐT2000; VD1-2-1, VD1-2-2 từ tổ hợp TL7 x ĐT2000; VD1-3-1, VD1-3-7 từ TL7 x DT95; VD1-4-4 từ M103 x DT95; VD1-9-1 từ AK03 x DT2000; VD1-10-1, VD1-10-3, VD1-10-4 chọn từ DT84 x ĐT2000 và VD1-12-2 từ AK03 x DT95 và VD1-13-2 từ TL7 x ĐT92. Các dòng này được đưa vào đánh giá khẳng định lại đặc điểm tốt và so sánh giống vụ hè 2015. Một số dòng còn lại được bổ sung bảo tồn trong tập đoàn nguồn gen các mẫu giống đậu tương của Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm. Trong vụ hè 2015, những dòng đậu tương triển vọng thế hệ F7 được đánh giá lại về khả năng duy trì gen kháng, tính kháng bệnh gỉ sắt, đặc điểm nông sinh học, sinh trưởng phát triển, năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu sâu bệnh đồng ruộng. Kết quả kiểm tra lại gen kháng và tính kháng gỉ sắt trình bày ở bảng 4.4 cho thấy hầu hết những dòng mang gen kháng Rpp2 như: VD1-1-1, VD1-2-1, VD1-4-4, VD1-9-1 và VD1-13-2 hoặc chứa gen kháng Rpp4 như: VD1-3-1 và VD1-3-7 đều biểu hiện kháng tốt với cả 3 chủng nấm đại diện ở Việt Nam; vết bệnh có màu nâu đen đặc trưng (kiểu RB), tốc độ phát triển của bệnh chậm (AUDPC thấp tương tự ĐT2000), mức độ hình thành bào tử ít (điểm ≤ 3). Riêng dòng VD1-1-2 (Rpp2); VD1-2-2 (Rpp2& Rpp5); VD1- 12-2 (Rpp4) không biểu hiện kháng điển hình, bề mặt lá xuất hiện 2 kiểu vết bệnh TAN và RB, chỉ số AUDPC cao hơn giống ĐT2000, mức hình thành bào tử đạt điểm 4. Điều này có thể lý giải mặc dù cùng mang gen kháng nhưng trên nền genome khác nhau cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng kháng khác nhau. Hoặc trong thực tế có trường hợp mẫu giống không chứa gen kháng nào nhưng vẫn kháng tốt với bệnh đó có thể giải thích là do sự trao đổi chéo xảy ra giữa gen kháng và chỉ thị phân tử trong quá trình sinh sản. Kiểu gen quy định tính trạng được nhận biết bằng sự có mặt của chỉ thị liên kết. Khi trao đổi chéo xảy ra giữa chỉ thị và gen trong hình thành giao tử và tự do tổ hợp trong thụ tinh tạo ra một số ít cá thể chỉ có chỉ thị mà không có gen và ngược lại chỉ có chứa gen nhưng không chứa chỉ thị. Điều này chứng tỏ việc ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn lọc gen có một mức độ chính xác nhất định. 15
Bảng 4.4. Kiểm tra gen kháng và đánh giá kiểu hình kháng bệnh gỉ sắt các dòng triển vọng thế hệ F7 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm Phản ứng với bệnh Chứa IS - 15 IS - 17 IS - 28 Stt Dòng gen Chỉ số MĐ Chỉ số MĐ Chỉ số MĐ kháng AU HTBT KVB AU HTBT KVB AU HTBT KVB DPC (điểm) DPC (điểm) DPC (điểm) 1 VD1-1-1 Rpp2 660 3 RB 560 2 RB 550 3 RB 2 VD1-1-2 Rpp2 980 1 MIX 920 1 TAN 680 3 MIX 3 VD1-2-1 Rpp2 600 3 RB 580 2 RB 680 3 RB Rpp2, 4 VD1-2-2 550 3 RB 680 3 RB 620 3 RB Rpp5 5 VD1-3-1 Rpp4 560 1 RB 690 1 RB 570 1 RB 6 VD1-3-7 Rpp4 1050 4 RB 1246 3 RB 1100 4 RB 7 VD1-4-4 Rpp4 800 3 RB 900 4 RB 980 3 RB 8 VD1-9-1 Rpp2 600 3 RB 530 3 RB 570 2 RB Rpp2, 9 VD1-10-1 610 3 RB 590 2 RB 640 3 RB Rpp5 10 VD1-10-3 Rpp2 700 1 RB 625 3 RB 690 1 RB 11 VD1-10-4 Rpp2 640 4 RB 700 5 RB 690 1 RB 12 VD1-12-2 Rpp4 620 3 RB 560 3 MIX 550 2 RB 13 VD1-13-2 Rpp2 820 4 RB 625 2 RB 810 4 RB 14 Đ8 - 870 4 TAN 765 TAN 890 4 TAN 15 TL7 - 950 4 TAN 820 3 MIX 865 4 TAN 16 DT95 Rpp4 720 2 RB 620 2 RB 635 3 RB 17 AK03 - 1010 5 TAN 990 4 TAN 875 3 TAN 18 DT84 - 980 4 TAN 725 3 TAN 830 3 MIX 19 ĐH4 - 760 3 MIX 690 3 MIX 760 4 TAN 20 M103 - 810 3 MIX 725 4 TAN 810 4 TAN 21 PI230970 Rpp2 720 4 RB 690 2 RB 700 1 RB 22 PI459025B Rpp4 650 2 RB 630 2 RB 620 2 RB 23 PI200256 Rpp5 1020 4 TAN 940 2 MIX 950 4 RB Rpp2, 24 ĐT2000 690 1 RB 680 1 RB 695 1 RB Rpp5 25 V74 - 1060 4 TAN 1460 5 TAN 1320 5 TAN Ghi chú: AUDPC: Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian MD HTBT - Mức độ hình thành bào tử: Đánh giá theo thang điểm từ 1 – 5 KVB – Kiểu vết bệnh: Đánh giá theo màu sắc vết bệnh trên lá RB: Phản ứng kháng (Vết bệnh có màu nâu đỏ) TAN: Phản ứng nhiễm (Vết bệnh có màu nâu vàng) MIX: Phản ứng trung gian (xuất hiện cả vết bệnh màu nâu đỏ và nâu vàng) 16
Song song với việc kiểm tra lại gen kháng và đánh giá kiểu hình kháng, 13 dòng triển vọng được đánh giá về đặc điểm nông sinh học, năng suất và khả năng chống chịu đồng ruộng (bảng 4.5). Bảng 4.5. Đặc điểm nông sinh học và năng suất các dòng đậu tƣơng triển vọng vụ Hè 2015 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm Chiều Số Tỷ lệ KL. Chống cao TGST chắc quả 3 1000 NSTT Stt Tên dòng đổ cây (ngày) quả/ hạt hạt (tạ/ha) (điểm) (cm) cây (%) (g) 1 VD1-1-1 56,4 92 35,2 15,2 173 23,5 2 2 VD1-1-2 58,0 90 33,9 14,6 174 22,4 2 3 VD1-2-1 47,0 86 39,5 28,6 185 25,0 1 4 VD1-2-2 34,9 90 23,3 17,5 175 18,9 1 5 VD1-3-1 38,1 95 34,6 19,5 172 21,8 3 6 VD1-3-7 56,7 86 39,7 25,1 181 25,1 3 7 VD1-4-4 56,2 86 39,5 20,5 173 22,2 1 8 VD1-9-1 47,8 98 40,8 27,1 180 25,8 1 9 VD1-10-1 47,0 95 32,7 18,6 171 23,2 2 10 VD1-10-3 38,3 92 29,3 17,8 170 21,8 3 11 VD1-10-4 56,5 95 39,9 25,4 182 25,2 1 12 VD1-12-2 56,5 88 33,5 22,0 172 22,2 1 13 VD1-13-2 48,3 87 30,5 18,9 174 21,2 2 14 DT84 56,5 90 31,2 25,5 172 22,5 1 CV% 9,4 LSD 0,5 2,3 Kết quả cho thấy, đa số các dòng đều có chiều cao cây thuộc nhóm trung bình (40 – 60 cm), có TGST < 100 ngày, chống đổ tốt (điểm 1-2). Đánh giá năng suất cho thấy, các dòng đều cho năng suất thực thu khá cao, đạt từ 21,2 tạ/ha (VD1-13-2) đến 25,8 tạ/ha (VD1-13-2), trong khi DT84 cho năng suất thực thu đạt 22,5 tạ/ha. Như vây, có 4/13 dòng cho năng suất thực thu cao hơn đối chứng ở mức có ý nghĩa là VD1-2-1 (25,0 tạ/ha), VD1-3-7 (25,1 tạ/ha), VD1-9-1 (25,8 tạ/ha) và VD1-10-4 (25,2 tạ/ha). 17
Bảng 4.6. Một số đặc điểm chính 2 giống đậu tƣơng Đ9 và Đ10 vụ Thu Đông 2015 và Xuân 2016 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm Giống Đ9 Giống Đ10 DT84 (đ/c) Stt Chỉ tiêu Đông Xuân Đông Xuân Đông Xuân 1 Kiểu sinh trưởng HH HH HH HH HH HH 2 Dạng cây Đứng Đứng Đứng Đứng Đứng Đứng 3 Dạng lá chét Trứng Trứng TN TN TN TN 4 Màu sắc lá XN XN Xanh Xanh Xanh Xanh 5 Màu sắc hoa Tím Tím Tím Tím Tím Tím 6 Màu sắc vỏ quả Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng 7 Màu sắc vỏ hạt VS VS Vàng Vàng Vàng Vàng 8 Màu sắc rốn hạt Nâu Nâu Nâu Nâu Nâu Nâu 9 TGST (ngày) 85 100 92 102 84 98 10 Chiều cao cây (cm) 45,5 65,3 52,5 60,3 45,8 55,0 11 Số cành cấp 1 2,4 3,5 2,5 4,0 2,0 2,5 12 Sâu cuốn lá (%) 6-8 6-8 6-8 6-8 6-8 6-8 13 Sâu đục quả (%) 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3 14 Bệnh gỉ sắt (1 – 9) 1-3 1- 3 1-3 1- 3 1-3 1- 3 15 Bệnh phấn trắng (1–5) 1-2 1 -2 1-2 1 -2 1-2 1 -2 15 Bệnh lở cổ rễ (%) 5-6 5-6 5-6 5-6 5-6 5-6 17 Bệnh sương mai (1–9) 1-3 1-3 1-3 1-3 1-3 1-3 18 Tính tách quả (1 – 5) 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 19 Tính chống đổ (1 – 5) 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 20 Số quả/ cây (quả) 38,6 42,0 41,6 44,5 36,0 38,5 21 Số hạt/quả 2,3 2,5 2,2 2,4 2,2 2,5 22 KL.1000 hạt (g) 165 165 180 180 170 170 23 NSTT (tạ/ha) 23,0 25,2 22,5 25,5 20,0 22,5 Ghi chú: HH: Hữu Hạn; TN: Trứng Nhọn; XN: Xanh Nhạt; VS: Vàng Sáng Tuy nhiên, trong 4 dòng tốt trên chỉ có 2 dòng VD1-2-1 và VD1-9-1 là có khả năng kháng tốt với bệnh gỉ sắt bằng gây nhiễm bệnh nhân tạo, được đặt tên lần lượt là Đ9 và Đ10 và gửi khảo nghiệm VCU trong vụ Đông 2015 và Xuân 2016 (bảng 4.6). Tại các điểm khảo nghiệm, giống Đ9 có TGST vụ Đông là 85 ngày và 18