Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)

Chia sẻ: Lang Liêu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:48

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án này là tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, một thành phần chính của nhóm chất curcuminoid được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, ở tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền của nhiều nước để điều trị các chứng viêm, đau nhức, các bệnh về da như các vết thương và các vết lở loét, cũng như sự bất thường của chu kỳ kinh nguyệt. Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin và các dẫn xuất của nó như demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin là nhóm hợp chất chính tạo nên các hoạt tính sinh học quan trọng của củ nghệ. Các nghiên cứu gần đây cho thấy curcuminoid, đặc biệt là curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý rộng như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u và bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid). Hiện nay, các gen tham gia trong quá trình chuyển hóa curcuminoid ở nghệ vàng (C. longa) đã được xác định và phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai nhóm gen type III polyketide synthase là gen diketide-CoA synthase (DCS) và các gen curcumin synthase (CURS1, CURS2 và CURS3). Tuy nhiên, các gen tham gia tổng hợp curcuminoid ở loài nghệ đen đến nay vẫn chưa được công bố. Elicitor là những chất hóa học được dùng để tác động vào con đường chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp các chất có giá trị dược phẩm hoặc các dược phẩm thực vật trong nuôi cấy tế bào thực vật. Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)” nhằm xác định các loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng để điều hòa tăng biểu hiện của các gen type III
2 polyketide synthase trong con đường phenylpropanoid ở tế bào nghệ đen. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ cung cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò của SA, YE và MeJA như là những chất điều hòa dương tính của biểu hiện gen ở loài dược liệu có giá trị này. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu lý thuyết Cải thiện mức độ biểu hiện của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 tham gia trong con đường chuyển hóa phenylpropanoid sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro bằng một số elicitor. Mục tiêu thực nghiệm Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, một thành phần chính của nhóm chất curcuminoid được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, ở tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro. 3. Nội dung và phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao bằng cách bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. - Phân lập các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS tham gia trong quá trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) ở nghệ đen. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor như YE, SA và MeJA lên mức độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid và khả năng tích lũy curcumin trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro. Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu được tiến hành trong phạm vi phòng thí nghiệm./.
3 4. Đóng góp mới của luận án - Các nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây nghệ đen trước đây đều chưa sử dụng AgNO3 để tăng hiệu quả nuôi cấy, trong nghiên cứu này, bổ sung AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm tạo cây in vitro, nuôi cấy callus) đều làm tăng hiệu quả của quá trình nuôi cấy so với các nghiên cứu trước đây. - Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid, các gen này tương đồng 99% so với các gen tương ứng ở cây nghệ vàng và đã được đăng ký trên ngân hàng gen với các mã số lần lượt là MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835. Các gen này đều có sự biểu hiện ở trong củ và callus của cây nghệ đen. - Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp curcumin ở cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của gen này quyết định trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được. - Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của một số loại elicitor (dịch chiết nấm men và salicilic acid) lên khả năng tích lũy curcumin và mức độ biểu hiện của các gen liên quan. Giá trị tốt nhất thu được khi xử lý dịch chiết nấm men (1 g/L) sau 5 ngày nuôi cấy, mức độ biểu hiện cao hơn 2,78 lần so với đối chứng. 5. Cấu trúc luận án Luận án được trình bày trong trang A4, không bao gồm Phụ lục. Trong đó, phần Mở đầu 4 trang, phần Tổng quan tài liệu 33 trang, phần Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu 11 trang, phần Kết quả nghiên cứu 40 trang, phần Bàn luận 16 trang, Kết luận và Kiến nghị 1 trang, Danh mục các công trình công bố 1 trang, Tài liệu tham khảo 21 trang và phần Phụ lục 13 trang. Luận án có 169 tài liệu tham khảo, trong đó có 161 tài liệu tiếng Anh. Phần kết quả nghiên cứu có 9 bảng và 26 hình.
4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cây nghệ đen Nghệ đen là cây thân thảo sống nhiều năm hoặc hàng năm, cao khoảng 1-1,5m; có củ (thân rễ) hình trứng, có khía chạy dọc, củ tỏa theo hình chân vịt; cây mẫm và chắc. Cây có nhiều củ, ngoài củ chính ra còn có những củ phụ, vỏ củ có màu xám, bên trong củ có màu vàng lưu huỳnh nhạt hoặc vàng sáng, khi già có nhiều vòng màu xanh tím. Củ nghệ khô có mùi thơm camphor nhẹ và có vị đắng hơi cay. Nghệ đen là loài thảo dược có củ chứa các nhóm chất chủ yếu như tinh dầu (sesquiterpene và monosesquiterpene) và curcuminoid (curcumin, demethoxy-curcumin và bisdemethoxycurcumin). Ngoài ra, củ nghệ còn chứa một số hợp chất khác như tinh bột, chất dẻo và các chất có vị đắng như tannin, flavonoiod. 2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật trong sản xuất hợp chất thứ cấp Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng dụng lâu dài trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các chất dùng trong y học. Hướng nghiên cứu này sẽ dẫn đến sự ổn định về mặt chất lượng và số lượng sản phẩm, ít phụ thuộc vào tự nhiên. Đồng thời, là nguồn nguyên liệu cho những thí nghiệm sinh lý, hóa sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp chất thứ cấp khác nhau. 3. Elicitor và các ứng dụng Elicitor được định nghĩa như là một chất cơ bản mà khi đưa một lượng nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì có thể khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào. Sự kích kháng thực vật (elicitation) là quá trình cảm ứng tăng cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp nhờ tác động của các elicitor, giúp cho cây chống lại các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh như tác nhân gây bệnh hoặc
5 điều kiện sinh thái khắc nghiệt. Đến nay, đã có nhiều công trình ứng dụng elicitor để kích thích sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy in vitro thực vật. Các nghiên cứu đều cho thấy sự tích lũy của những chất này đã tăng lên đáng kể so với đối chứng sau khi được xử lý với loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng. Một số loài cây đã được nuôi cấy có bổ sung elicitor như Dioscorea zingiberensis, Digitalis lanata, Hypericum triquetrifolium, Portulaca oleracea, Psoralea corylifolia, Silene vulgaris, Alstonia scholaris, Hypericum perforatum, Scrophularia kakudensis, cây thủy tùng (Taxus baccata), Artemisia annua… Đối với các loài thuộc chi nghệ, việc nuôi cấy có bổ sung elicitor cũng đã được thực hiện như nuôi cấy cây nghệ xanh (C. aeruginosa), cây nghệ vàng (C. longa), và cây nghệ C. mangga. 4. Các gen tham gia tổng hợp curcuminoid Tham gia vào chu trình tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng có nhiều enzyme xúc tác cho nhiều phản ứng trung gian khác nhau, phần lớn các gen/enzyme này đều đã được nghiên cứu cả về đặc điểm, chức năng cũng như biểu hiện tái tổ hợp. Trong số đó, các enzyme thuộc nhóm polyketide synthase type III đóng vai trò hết sức quan trọng. Gen diketide-CoA synthase (DCS) mã hóa diketide-CoA synthase là một enzyme thuộc nhóm polyketide synthase type III xúc tác tạo thành feruloyldiketide-CoA từ feruloyl-CoA và malonyl-CoA. Gen curcumin synthase (CURS) mã hóa enzyme xúc tác tạo thành curcuminoid từ cinnamoyldiketide-N-acetylcysteamine và feruloyl-CoA. Hoạt động đồng thời của DCS và CURS khi có sự hiện diện của feruloyl-CoA và malonyl-CoA sẽ tạo ra nhiều curcumin, trong khi một mình CURS cho hiệu quả tổng hợp curcumin thấp cùng với sự hiện diện của feruloyl-CoA và malonyl-CoA.
6 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là sự biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp curcuminoid trong tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe). 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro Chồi mầm sau khi khử trùng (1-1,5 cm) được cấy lên môi trường cơ bản MS có sucrose 20 g/L, agar 8 g/L, bổ sung BAP 3 mg/L, IBA 0,5 mg/L và nước dừa 20% (v/v) để tái sinh cụm chồi. Chồi in vitro tái sinh được chuyển lên môi trường tương tự như trên nhưng thêm AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để thăm dò khả năng nhân cụm chồi. Các chồi in vitro (3-4 cm) được nuôi trên môi trường MS bổ sung NAA 2 mg/L và AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để thăm dò khả năng tạo rễ. Nuôi cấy callus Gốc lá (leaf-base) (0,2×1 cm) được nuôi trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L để tạo callus. Các callus sơ cấp sau đó được cắt thành các khối nhỏ (đường kính ~ 2 mm) cấy chuyển lên môi trường mới có 2,4-D 1 mg/L + KIN hoặc NAA từ 0,5-2 mg/L hoặc AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để tăng sinh. Nuôi cấy tế bào Chuyển 3 g callus 2 tuần tuổi vào bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường MS lỏng có sucrose 20 g/L, bổ sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L, nuôi lắc 150 vòng/phút trong 18 ngày. 2.2.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số từ lá nghệ đen được tách chiết bằng phương
7 pháp CTAB theo Babu và cs. (2014) có cải tiến. Khuếch đại PCR DNA tổng số của nghệ đen được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại các gen dựa vào các cặp primer đặc hiệu của chúng được thiết kế dựa trên các gen tương ứng của cây nghệ vàng (Bảng 2.1). Bảng 2.1. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. Gen Primer Trình tự nucleotide (5’- 3’) Chiều dài ước tính của sản phẩm PCR (bp) DCS-F GTCGTTTCTGTGACCTTCTC CzDCS ~ 1400 DCS-R CTTTTGGATGCAGACTGGAACA CURS1-F CTGCGACTGCGAGAAGAAGC CzCURS1 ~ 1250 CURS1-R CAGATAGACAGCCATACAAACC CURS2-F GCACGCGTTTTCTTGCTAATC CzCURS2 ~ 1300 CURS2-R GATCGTGTTCATAATTCACTGG CURS3-F CTAGCTAGCTGCAATTCGTT CzCURS3 ~ 1250 CURS3-R GTGCTAGCTTAGCTTGACGTA Tạo dòng và chú giải gen Sản phẩm PCR được tinh sạch, gắn vào vector pGEM®T-Easy bằng T4 DNA ligase (Promega, Mỹ) và biến nạp vào tế bào E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Trình tự nucleotide của sản phẩm PCR được xác định bằng phương pháp dideoxy terminator. Xây dựng cây phả hệ Vùng CDS của các gen DCS, CURS1, CURS2, CURS3 của cây nghệ đen và nghệ vàng được sử dụng để xây dựng cây phả hệ thông qua phần mềm MEGA7. 2.2.3. Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid
8 Xử lý elicitor Elicitor được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau (MeJA 25-150 µM, SA 50-150 µM và YE 0,1-1,5 g/L) và tại các thời điểm khác nhau (thời điểm ban đầu hoặc ngày thứ 5). Phân tích RT-PCR Mức độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid trong các mẫu khác nhau được phân tích bằng kỹ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR) với các primer đặc hiệu cho các đoạn chỉ thị của các gen này. Bảng 2.2. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. Gen Primer Trình tự nucleotide (5’- 3’) Chiều dài Nhiệt độ gắn (bp) (oC) ID-F TGCTCCGAGGTCACCGTGC CzDCS 272 55 ID-R GGTCAGCCCAATTTCGCGG IC1-F CCGCTGGAAGGAATTGAAAAA CzCURS1 286 55 IC1-R GAGCTTGTCCGGGCTCAGCTG IC2-F CCACCTCCGCGAGGTGGGGCT CzCURS2 211 55 IC2-R GCGGTGGCCAGCTTGCTCTGT IC3-F CACCTGAGGGAAATCGGCTGG CzCURS3 202 50 IC3-R GCGAGCTTCCCCTGTTCCAGC 2.2.3.3. Phân tích HPLC Tách chiết curcumin được tiến hành theo phương pháp của Paramapojn và Gritsanapan (2009). Hàm lượng curcumin được xác định dựa theo đường chuẩn curcumin. 2.2.4. Xử lý thống kê Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả thí nghiệm được tính trung bình và phân tích ANOVA bằng Duncan’s test với p
9 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thiết lập nuôi cấy tế bào 3.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro 3.1.1.1. Tái sinh chồi  Sử dụng chồi in vitro nguyên vẹn. Ở môi trường đối chứng (ĐC), chồi đỉnh bắt đầu kéo dài từ ngày thứ 3 và sau đó xuất hiện các chồi mới từ ngày thứ 5. Trên các môi trường có bổ sung AgNO3, chồi đỉnh bắt đầu kéo dài và hình thành các chồi mới muộn hơn 1 ngày. Các môi trường có bổ sung AgNO3 đều cho tỷ lệ tạo chồi mới cao hơn hoặc tương đương ĐC. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in vitro nguyên vẹn. AgNO3 (mg/L) Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) ĐC 100 5,4ab 6,3ab 0,5 100 5,6ab 7,1a 1,0 100 6,1ab 6,9ab 1,5 100 6,4a 6,6ab 2,0 100 5,1b 6,2b ĐC: đối chứng không bổ sung AgNO 3, chú thích này dùng chung cho các bảng 3.2 và 3.3. Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 (Duncan’s test), chú thích này dùng chung cho tất cả các bảng (ngoại trừ bảng 3.7).  Sử dụng chồi in vitro chẻ đôi. Số liệu ở bảng 3.2 cho thấy tất cả môi trường được thăm dò đều có khả năng tái sinh chồi tương tự như thí nghiệm chồi in vitro nguyên vẹn. Nhìn chung, so với chồi nguyên vẹn thì chồi chẻ đôi có hiệu quả tái sinh chồi mới cao (7,5/6,4 chồi).
10 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in vitro đã được chẻ đôi. AgNO3 (mg/L) Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) ĐC 100 5,6c 3,4c 0,5 100 5,9bc 3,6bc 1,0 100 6,6b 3,9a 1,5 100 7,5a 3,7b 2,0 100 6,1bc 3,6bc 3.1.1.2. Tạo rễ in vitro Khi kết hợp NAA với AgNO3, tất cả môi trường thăm dò đều có khả năng tạo rễ. Ở các môi trường có AgNO3 rễ hình thành sớm hơn, chỉ sau 3 ngày nuôi cấy và số lượng cũng nhiều hơn ĐC. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro. AgNO3 (mg/L) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ/mẫu Chiều dài rễ (cm) c ĐC 100 18,3 0,6c 0,5 100 20,0bc 0,7ab 1,0 100 22,5b 0,7ab 1,5 100 27,0a 0,8a 2,0 100 20,8bc 0,8a 3.1.2. Nuôi cấy callus 3.1.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng khá rõ rệt lên sinh trưởng của callus. Nhìn chung, ở môi trường có 2,4- D 1 mg/L + KIN từ 1-1,5 mg/L callus sinh trưởng mạnh hơn ĐC; đường kính trung bình của chúng khoảng 1,53-1,56 cm, khối lượng tươi và khối lượng khô tương ứng từ 0,84-0,9 g và 83,15-84,11 mg. 3.1.2.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA Kết quả trình bày ở bảng 3.5 cho thấy hiệu quả kích thích sinh
11 trưởng callus của NAA dường như không bằng KIN. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen. Khối lượng KIN (mg/L) Đường kính (cm) Tươi (g) Khô (mg) ĐC 1,35c 0,68c 61,24c 0,5 1,48abc 0,79b 79,03b 1,0 1,53ab 0,84ab 83,15a 1,5 1,56a 0,90a 84,11a 2,0 1,38bc 0,85ab 80,37b ĐC: đối chứng là môi trường có 2,4-D 3 mg/L và BA 3 mg/L. Chú thích này dùng chung cho các bảng 3.5 và 3.6. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen. Khối lượng NAA (mg/L) Đường kính (cm) Tươi (g) Khô (mg) c c ĐC 1,35 0,65 60,89c 0,5 1,45abc 0,70abc 64,39c 1,0 1,56a 0,79a 80,16a 1,5 1,50ab 0,76ab 73,91b 2,0 1,44bc 0,69bc 63,23c 3.1.2.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và AgNO3 Kết quả nghiên cứu cho thấy ở tất cả môi trường được thăm dò, sinh trưởng của callus đều tăng so với ĐC, môi trường có AgNO3 1,5 mg/L callus có khối lượng khô cao nhất (62,43 mg) (Bảng 3.6).
12 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của AgNO3 từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen. Khối lượng AgNO3 (mg/L) Đường kính (cm) Tươi (g) Khô (mg) ĐC 1,28b 0,53c 48,21c 0,5 1,38ab 0,59bc 49,78c 1,0 1,41a 0,65ab 56,87b 1,5 1,45a 0,71a 62,43a 2,0 1,35ab 0,67ab 58,18b 3.1.3. Nuôi cấy tế bào nghệ đen Kết quả trình bày ở hình 3.3 cho thấy pha thích nghi của tế bào khá ngắn, tế bào sớm chuyển qua pha tăng trưởng và tăng sinh liên tục từ 2 đến 14 ngày nuôi cấy sau đó giảm dần. Sinh khối tươi đạt cực đại là gần 170 g/L, tương đương với khối lượng khô khoảng 15 g/L. 9.00 0.90 7.50 0.75 Khối lượng tươi (g/bình) Khối lượng khô (g/bình) 6.00 0.60 4.50 0.45 3.00 0.30 1.50 Sinh khối tươi 0.15 Sinh khối khô 0.00 0.00 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen. 3.2. Nhận dạng các gen sinh tổng hợp curcuminoid 3.2.1. Phân lập gen
13 Các gen DCS, CURS1, CURS2 và CURS3 của nghệ đen có chiều dài lần lượt là 1382 bp, 1240 bp, 1288 bp và 1265 bp (Hình 3.6). Các gen này được đặt tên tương ứng là CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 và đã đăng ký trên GenBank với các mã số sau: MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835. Để xác định các vùng intron/exon trên các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 có nguồn gốc từ DNA tổng số, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp khác nhau. Kết quả cuối cùng cho thấy các gen CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 chỉ có 1 vùng intron trong khi gen CzDCS có 2 vùng intron. Vùng intron/exon giả định của 4 gen được minh họa ở hình 3.7. Hình 3.6. Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA tổng số của nghệ đen. M1 và M2: DNA size marker (100 bp BioRad và 1 kb DNA Ladder Geneaid), 1: CzDCS, 2: CzCURS1, 3: CzCURS2, 4: CzCURS3. Do có sự tương đồng cao giữa các gen tổng hợp curcuminoid của nghệ đen và nghệ vàng, chúng tôi đã xây dựng cây phả hệ các gen này. Kết quả trình bày ở hình 3.16 cho thấy nhóm gen nghiên cứu có giá trị bootstrap rất cao, thể hiện đặc tính cùng nguồn gốc và chức năng (orthologs and paralogs) của các gen này giữa 2 loài. Trên cây
14 phả hệ, nhóm các gen CURS tạo thành 1 nhóm với độ tương đồng rất cao, mức độ sai khác giữa các gen chỉ từ 0,1-0,2. Các gen DCS cũng có độ tương đồng khá cao và tạo thành một nhóm trên cây phả hệ. Hình 3.7. Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. Trong đó, intron (đường thẳng), exon (hình hộp) và vị trí của nó. Số 1 là nucleotide đầu tiên trong mã mở đầu. Cấu trúc chung của chuỗi protein mã hóa được thể hiện bên dưới (màu cam). Vị trí các vùng được xác định bằng công cụ InterProScan. Hình 3.16. Cây phả hệ của các gen sinh tổng hợp curcuminoid. 3.2.2. Phân tích biểu hiện của các gen sinh tổng hợp curcuminoid Để nghiên cứu sự biểu hiện của các gen sinh tổng hợp
15 curcuminoid trong 2 cấu trúc khác nhau của nghệ đen (củ và callus), chúng tôi sử dụng phương pháp RT-PCR sau đó xác định độ sáng của băng DNA trên hình ảnh điện di. Phân tích dữ liệu RT-PCR của 4 gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 ở củ và callus cho thấy tất cả chúng đều có sản phẩm khuếch đại, chứng tỏ các gen này đều biểu hiện ở cả 2 loại mô nói trên (Hình 3.17). Kết quả này còn minh chứng cho nhận định cơ chế sinh tổng hợp curcuminoid của nghệ đen cũng xuất hiện trong quá trình nuôi cấy in vitro, và callus là nguyên liệu thích hợp để phát triển hệ thống nuôi cấy tế bào nhằm mục đích sản xuất curcumin. Hình 3.17. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. M: DNA size marker (1 kb), 1-3-5-7: củ, 2-4-6-8: callus, A: CzDCS, B: CzCURS1, C: CzCURS2, và D: CzCURS3. Để củng cố nhận định trên, chúng tôi đã phân tích hàm lượng curcumin, một thành phần chính của nhóm curcuminoid, ở các mẫu trên bằng HPLC. Kết quả cho thấy cả hai dịch chiết củ và callus đều có chứa peak curcumin với thời gian lưu tương tự curcumin chuẩn. 3.3. Ảnh hưởng của elicitor lên quá trình sinh tổng hợp curcuminoid 3.3.1. Thăm dò ảnh hưởng của các elicitor lên biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid
16 Kết quả phân tích RT-PCR cho thấy khi xử lý methyl jasmonate (25-150 mM), mức độ biểu hiện của gen CURS1 gần như không thay đổi so với đối chứng (Hình 3.22A) trong khi CURS3 có chiều hướng tăng lên (Hình 3.22B). Khi xử lý salicilic acid (50-150 mM), mức độ biểu hiện của 2 gen này đều tăng so với đối chứng, trong đó gen CURS1 tăng mạnh nhất khi xử lý ở nồng độ 100 mM trong khi gen CURS3 mạnh nhất ở nồng độ 150 mM. Khi xử lý bằng dịch chiết nấm men, mức độ biểu hiện của các gen chỉ tăng ở nồng độ 0,7-1,0 g/L, các công thức xử lý còn lại các gen đều có mức độ biểu hiện thấp hơn so với đối chứng. Chúng tôi nhận thấy MeJA ít có ảnh hưởng lên sự biểu hiện của các gen CURS, trong khi đó SA và YE có ảnh hưởng lớn đến mức độ biểu hiện của các gen này. Các nồng độ xử lý elicitor được lựa chọn là salicilic acid 100 mM và dịch chiết nấm men 1 g/L, các công thức xử lý này sẽ được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của tất cả các gen ở các thời điểm xử lý khác nhau về sau. 3.3.2. Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid Kết quả phân tích hình ảnh điện di các sản phẩm RT-PCR cho thấy sự biểu hiện của các gen ở tế bào nghệ đen đã được xử lý elicitor mạnh hơn đối chứng là tế bào không xử lý (Hình 3.23). Mức độ biểu hiện của các gen này được đánh giá thông qua độ sáng của các băng DNA đã cho thấy các tế bào có xử lý cao hơn khoảng 1,14-3,64 lần so với không xử lý (Bảng 3.8). Nhìn chung, YE có tác dụng kích thích tốt hơn so với SA, cường độ tổng số của các băng DNA đạt 71.528 so với 31.625 (hơn khoảng 2,3 lần).
17 Bảng 3.8. Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ở các gen tổng hợp curcuminoid. Đối SA (100 µM) YE (1 g/L) Gen chứng 0 5 0 5 CzDCS 4706 5312 6146 5113 13425 CzCURS1 6881 7810 10766 32576 13524 CzCURS2 4646 6186 8510 12139 17783 CzCURS3 4414 4146 6203 21700 12664 Tổng số 20647 23455 31625 71528 57397 Tăng so với ĐC 1,00 1,14 1,53 3,46 2,78 0 và 5 là ký hiệu elicitor được bổ sung vào môi trường ở thời điểm ban đầu hoặc ngày thứ 5 của quá trình nuôi cấy. Hình 3.23. Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. A: CzDCS, B-D: CzCURS1-3, E: RNA tổng số. 1: đối chứng (tế bào không xử lý elicitor), 2 và 4: tế bào được xử lý SA và YE tại thời điểm ban đầu. 3 và 5: tế bào được xử lý SA và YE vào ngày thứ 5 của quá trình nuôi cấy. M: DNA size marker (1 kb DNA Ladder).
18 3.3.3. Tích lũy curcumin Sinh trưởng của tế bào nghệ đen ở tất cả các công thức xử lý elicitor đều bị ức chế đáng kể, sinh khối tươi thu được cao nhất chỉ đạt 105,20 g/L (9,80 g khô) so với 154,20 g/L (12,80 g khô) ở đối chứng. Tuy nhiên, có sự tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen khi phân tích RT-PCR với sự tích lũy curcumin khi phân tích bằng HPLC. Ảnh hưởng của YE lên cao hơn so với khi xử lý bằng SA và ĐC. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các elicitor lên sinh trưởng và tích lũy curcumin trong tế bào nghệ đen Sinh trưởng tế bào Curcumin Elicitor Khối lượng Khối lượng khô (mg/g) tươi (g) (g) YE(1) 105,20b 9,80b 0,92d YE(2) 97,6c 8,40c 1,44a SA(1) 69,00d 6,20d 1,14c (2) d d SA 63,20 6,00 1,32b Đối chứng (I) 154,2a 12,80a 0,57f Đối chứng (II) - - 0,78e Elicitor được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở thời điểm ban đầu (1) hoặc sau 5 ngày (2). Đối chứng (I): tế bào không xử lý elicitor. Đối chứng (II): củ nghệ đen 10 tháng tuổi. Hình 3.25. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5 ngày nuôi cấy.
19 Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Thiết lập nuôi cấy tế bào 4.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro Đối với quá trình tái sinh chồi, nghiên cứu của Loc và cs (2005) cho thấy môi trường có bổ sung 3 mg/L BAP cho hiệu quả tốt nhất, số chồi/mẫu đạt 2,3 và chiều cao chồi đạt 3,42 cm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng công thức môi trường này để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO3. Kết quả nghiên cứu cho thấy số chồi tạo thành cao hơn (3,3 so với 2,3 chồi) và chiều dài chồi cũng cao hơn (4,1 cm so với 3,42 cm). Như vậy, AgNO3 đã có tác dụng trong việc nâng cao hiệu quả của quá trình tái sinh chồi. Môi trường tốt nhất để tạo rễ theo Loc và cs (2005) là 2 mg/L NAA, khi bổ sung AgNO3 vào môi trường này, chúng tôi nhận thấy 1,5 mg/L AgNO3 cho hiệu quả tốt nhất. So với nghiên cứu trước đây của Loc và cs (2005) thì kết quả thu được của chúng tôi tốt hơn, số rễ/mẫu nhiều hơn (27,0 so với 18,5), rễ tạo thành cũng dài hơn (0,80 cm so với 0,51 cm). Qua các kết quả nghiên cứu về nhân giống, chúng tôi nhận thấy bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng cao hiệu suất nhân giống, các chỉ tiêu nghiên cứu đều tăng lên từ 25-50%. 4.1.2. Nuôi cấy callus và tế bào cây nghệ đen Loc và cs. (2006, 2008) đã nghiên cứu sản xuất sinh khối tế bào cây nghệ đen thông qua nuôi cấy callus, callus đã được tạo thành khi nuôi cấy mảnh lá trên môi trường có chứa 3 mg/l BAP và 3 mg/l 2,4-D. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách nuôi 3 g callus tươi trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml cùng loại môi trường. Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc bổ sung AgNO3 vào môi
20 trường nuôi cấy đã làm tăng khả năng sinh trưởng của tế bào. Sau 14 ngày nuôi cấy, sinh khối tươi đạt cực đại là gần 8,5 g/bình, tương đương với khối lượng khô khoảng 0,75 g/bình, cao hơn kết quả nghiên cứu trước đây của Tuan và cs. (2011) (khoảng 0,66 g khô/bình) hay Miachir và cs. (2004) (quy đổi tương đương 5,33 g tươi/bình). Bên cạnh đó, thời gian đạt sinh trưởng cực đại của chúng tôi (14 ngày) cũng ngắn hơn rất nhiều so với các nghiên cứu đã công bố như trong nghiên cứu của Mello và cs. (2001) là 35 ngày hay Miachir và cs. (2004) là 20 ngày. Thời gian nuôi cấy ngắn sẽ góp phần làm tăng hiệu quả của quá trình sản xuất curcumin. 4.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid 4.2.1. Phân lập gen tổng hợp curcuminoid Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy có sự tương đồng lớn giữa các gen của nghệ đen với nghệ vàng (xấp xỉ 99%). Các phân tích trình tự cũng cho thấy các gen thuộc tất cả loài của trong chi Curcuma có sự tương đồng rất lớn, thậm chí ngay ở các vùng không mã hóa. Chính sự tương đồng cao trong trình tự của các gen này dẫn đến sẽ có sự tương đồng cao trong các trình tự amino acid của các protein được mã hóa. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các sản phẩm PCR đặc hiệu cho tất cả các gen, điều này chứng tỏ cây nghệ đen chứa tất cả các gen này. So sánh kết quả phân lập của chúng tôi với các kết quả đã công bố trên cây nghệ vàng có thể thấy các gen giữa hai loài này có độ tương đồng rất cao, lên đến 99%. 4.2.2. Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid Thông qua quá trình xử lý elicitor, vai trò của các gen cũng đã được thể hiện. Khi xử lý YE ở thời điểm ban đầu, mật độ băng DNA của gen CzDCS là 5.133 trong khi tổng mật độ của 3 gen CzCURS là