Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 9420116 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2019
Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS. TS. Đồng Huy Gới Phản biện 2: GS. TS. Đậu Ngọc Hào Phản biện 3: GS. TS. Chu Hoang Mậu Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại Viện Công nghệ sinh học Vào hồi ……giờ….., ngày…..tháng…..năm 2019. Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Công nghệ sinh học Trang web của Bộ GD & ĐT NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̀ , Hô Thi Th ̃ ̣ ́ ̣ ̀ 2017). Tách dòng và đồng biểu Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̃ ̀ hiện gen mã hóa hai loại kháng nguyên vỏ GP5ecto (vùng ngoại bào) và M của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Tap chi Khoa hoc ̣ ́ ̣ ̣ ự nhien va Cong ngh ĐHQGHN: Khoa hoc T ̂ ̀ ̂ ẹ, T ̂ ạp 33(1S): 150158. ̂ 2. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ̀ , Hô Thi Th ương, Nguyên Thu Giang, Pham Thi ̃ ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ 2017). Biểu Vân, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ́ ̃ ̀ hiện và tinh sạch protein M của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trong lá thuốc lá Nicotinana benthamiana. Tap chí ̣ Công nghệ Sinh hoc̣ 15(3): 547554. 3. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ương, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung ̀ , Hô Thi Th ̣ ́ ̣ ̃ ̀ 2018). Xác định khả năng kích thích tạo kháng thể đặc Nam, Chu Hoang Ha ( ̀ hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp GP5ELP của virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên động vật thí nghiệm. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y. Tập 25(5): 3542. 4. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ương, Nguyễn Thu Giang, Pham Bich ̀ , Hô Thi Th ̣ ́ ̣ ̀ 2018). Nghiên cứu tối ưu các Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̃ ̀ điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M của virus PRRS trong lá cây thuốc lá Nicotinana benthamiana. Tap chí Công ngh ̣ ệ Sinh hoc̣ 16(2): 293300. 5. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̣ ́ ̣ ̀ , Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ̃ ̀ ̀ (2018). Đánh giá khả năng kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu của kháng
nguyên M và GP5ectom/PRRSV được sản xuất từ thực vật trên chuột bạch. Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2018: 194199. 6. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̀ , Hô Thi Th ̃ ̣ ́ ̣ ̀ 2016). Đánh giá sự biểu hiện tạm Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̃ ̀ thời kháng nguyên GP5 tái tổ hợp của virus PRRS trong mô lá thuốc lá Nicotinana tabacum. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lần thứ IV, khu vực phía nam, 2016: “Ứng dụng Công nghệ sinh học vào thực tiễn”; P1 14:57. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hi ểm trên lợn do virus gây ra. Ở Việt Nam, bệnh còn đượ c gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữ đại chúng) do lợn mắc bệnh th ường b ị xung huy ết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh. PRRS gây thiệt hại kinh t ế r ất l ớn ở nh ững n ước có bệnh. PRRS đượ c phát hiện ở Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nướ c Mỹ phải chịu những thi ệt hại do b ệnh này ướ c tính khoảng 664 tri ệu USD cho vi ệc tiêu huy l ̉ ợn chêt, l ́ ợ n ôm, chi phi chông dich ́ ́ ́ ̣ ̀ ử ly môi tr va x ́ ươ ̀ng. Ở Việt Nam, dich PRRS do virus th ̣ ể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào năm 2007. Từ đo đên nay, dich đa ́ ́ ̣ ́ ện ở hâu hêt cac đia ph ̃ xuât hi ̀ ́ ́ ̣ ươ ng trong cả nươ ́c. Theo thống kê của Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS t ại 8 huy ện c ủa 4 t ỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Ngh ệ An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc b ệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị tiêu huỷ. PRRS đã anh hủ ̛ở ng nặng nê t̀ ới nganh chan nuoi l ̀ ̆ ̂ ợn trong n ước. B ệnh v ẫn xu ất hiện ở một số địa phươ ng và có tính chất 23 năm một lần. Điều này cũng cho thấy nguy cơ xuất hiện tr ở l ại c ủa d ịch b ệnh này trong thời gian tới. Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và nhượ c độc. Cac vaccine vô ho ́ ạt thươ ̀ng an toan nh ̀ ưng kh ả năng bao h ̉ ộ thâp. Cac vaccine ́ ́ nhượ c độc bao h ̉ ộ tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về tính an toàn của các loaị vaccine này. Vaccine nhược độc có thể giam dân m ̉ ̀ ức bao h ̉ ộ do giam m ̉ ưc t ́ ương đông v ̀ ới chung m ̉ ới (nếu có) va ban thân virus vaccine sau nhiêu lân truyên nhi ̀ ̉ ̀ ̀ ̀ ễm ́ ̉ đột biên tr cũng co thê ́ ở thanh c ̀ ường độc. Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao. Hiện nay, d ịch ch ỉ xu ất hi ện l ẻ t ẻ, trong nh ững năm gần đây hầu như không có dịch, một phần là nhờ biện pháp chủ động tiêm phòng cho lợn. Virus gây Hội chứng rối loạn sinh s ản và hô hấp ở lợn ở nướ c ta hiện nay được xác định là thể độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch chủ yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử trùng, vệ sinh tru ồng tr ại, cách ly và tiêu huỷ lợn bệnh ...). Để phòng chống virus thể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp.
Nhu cầu về các loại vaccine PRRS th ế h ệ m ới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an toàn và hiệu quả hơn là vấn đề cấp thiết. Protein GP5 và M là những protein c ấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV) được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV. Các kháng thể kháng GP5 và M ở lợn là các kháng thể có khả năng trung hoà PRRSV. Sự kết hợp đoạn peptit miền ngoài của kháng nguyên GP5 (GP5ecto) được cho là chứa các epitope trung hoà của GP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo được protein tái tổ hợp heterodimer GP5ectoM có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và trở thành một trong những ứng viên tiềm năng để phát triển sản xuất vaccine chống PRRSV. Kháng nguyên của virus PRRS có thể đượ c sản xuất trong hệ thống th ực vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thông qua phươ ng pháp biểu hiện gen tạm thời. H ệ th ống bi ểu hi ện gen t ạm th ời ở th ực v ật b ằng ph ương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm như: Mức độ biểu hiện kháng nguyên cao, có thể sản xuất ở quy mô lớn, phươ ng pháp thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnh hưở ng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá, cung cấp kháng nguyên cho mục đích sản xuất vaccine chống ch ủng virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra. Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án được thực hiện với đề tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới. Mục tiêu cụ thể Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) và gp5ectom của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M , GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc lá. Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM trên động vật thí nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu
(1) Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m/gp5opt/gp5ectom mã hoá kháng nguyên MELP/ GP5ELP /GP5ectoMELP và tạo chủng Agrobacterium mang vector tương ứng; (2) Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m/ gp5opt/ gp5ectom ở lá cây thuốc lá N. benthamiana. Biểu hiện tạm thời và tinh sạch các kháng nguyên MELP/ GP5ELP/ GP5ectoMELP tái tổ hợp; (3) Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể của kháng nguyên MELP/ GP5ELP/ GP5ectoMELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. 4. Đóng góp mới của luận án Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về việc thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ectom mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP của chủng virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợp M ELP, GP5ELP và GP5ectoMELP có khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó, kháng nguyên GP5ecto (vùng ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoMELP) kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên MELP, GP5ELP riêng lẻ. Kháng nguyên GP5ectoMELP và GP5ELP là hai ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ectom mã hóa cho các kháng nguyên tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin like polypeptide (ELP); biểu hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ectom mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP của chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng A. tumefaciens mang các vector này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS. Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ A. tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng
để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP, GP5ectoMELP hoặc các protein tái tổ hợp khác. Kháng nguyên tái tổ hợp GP5ELP và GP5ectoMELP được tạo ra trong đề tài luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam. 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 131 trang (Từ Mở đầu đến Kết luận và kiến nghị, không bao gồm Danh mục các công trình công bố, Tóm tát luận án bằng Tiếng Anh, tài liệu tham khảo và các phụ lục), được chia thành các phần: Mở đầu gồm 5 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 37 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 17 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu, 47 trang; Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu, 22 trang; Kết luận và đề nghị: 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang; Tóm tắt luận án bằng tiếng anh: 7 trang; Luận án có 7 bảng số liệu, 51 hình. Ngoài ra, tài liệu tham khảo: 229 tài liệu tham khảo, trong đó 14 tài liệu tiếng Việt và 215 tài liệu tiếng Anh; Phụ lục: 5 trang; Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 16 tài liệu trong nước, 217 tài liệu nước ngoài với các nội dung liên quan, bao gồm: (1) Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, như: Sơ lược tình hình dịch bệnh; bệnh tích của PRRS; virus PRRS; (2) Vaccine phòng PRRS: Vaccine sống nhược độc; vaccine vô hoạt; các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV; (3) Biểu hiện tạm thời kháng nguyên của PRRSV ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium, như: Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ A. tumefaciens; quá trình thẩm lọc nhờ A. tumefaciens; một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật. Với các dẫn liệu thu thập được, kết quả phân tích cho thấy Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) do virus PRRS (PRRSV) gây ra, là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở lợn, được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 và đã lây lan ở nhiều quốc gia trên thế giới, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn. PRRSV là loai virus RNA không ôn đinh, thay đôi nhanh chóng ca vê đ ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ ̀ ặc tính di truyêǹ và kháng nguyên, có tốc độ tiến hóa nhanh nhất trong số các virus RNA. Điều này, gây ra nhiều khó khăn cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng PRRS. Hiện nay, trên thế giới đã có hơn 20 loại vaccine thương mại phòng PRRS. Các vaccine được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ yếu là vaccine sống – nhược độc và vaccine vô hoạt. Vaccine vô hoạt thường an toàn, có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sàng nhưng hiệu quả bảo hộ không cao. Vaccine nhược độc tạo ra miễn dịch bảo hộ tốt với các chủng tương đồng nhưng mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng mới, có nguy cơ phát triển độc tính trở lại, bản thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm có thể đột biến trở thành cường độc. Ở Việt nam, phát hiện bệnh PRRS lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn giống 51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam và dịch bệnh nặng xuất hiện từ năm 2007 cho đến nay. Công ty Hanvet đã nghiên cứu và sản xuất thành công vaccine PRRS
nhược độc chủng Hanvet 1.VN để phòng chống PRRS ở Việt Nam. Tuy nhiên, do sự biến đổi di truyền phức tạp c ủa PRRSV, các loại vaccine đang lưu hành trên thực địa hiện nay đang mất dần hiệu lưc. Virus gây dịch tai xanh ở nước ta hi ện nay được xác định là thể độc lực cao, thuọc ch ̂ ủng PRRSV Băc My type II, ́ ̃ tương đồng với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc nên việc phòng bệnh khó khăn, dịch cũng nguy hiểm hơn và cần phải có vacxin phù hợp. Để nâng cao hiệu quả phòng chống PRRS, việc nghiên cứu sản xuất các loại vaccine thế hệ mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới của PRRSV hiện nay là rất cần thiết. Vaccine tiểu đơn vị được sản xuất trong thực vật phòng PRRS là hướng nghiên cứu đã được đánh giá là có nhiều triển vọng và ưu điểm như ổn định và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi phí sản xuất thấp. Protein GP5 và M là những protein c ấu trúc chính của virus PRRS được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống virus PRRS. Nhi ều h ệ th ống bi ểu hi ện GP5 và M của PRRSV đã đượ c thử nghiệm. Biểu hiện gen tạm th ời ở th ực v ật b ằng ph ương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium là phươ ng pháp để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm đã được chứng minh, như: Hàm lượ ng kháng nguyên cao, có thể sản xuất với số lượ ng lớn, chi phí thấp, thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như mô lá. Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen và tính kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh và các thành tựu đạt được về biểu hiện, sản xuất vaccine tiểu đơn vị trong thực vật phòng chống bệnh virus là căn cứ để chúng tôi thực hiện đề tài luận án này. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi khuẩn Chủng Escherichia coli DH5α; A. tumefaciens C58C1; chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pIBT35S2bCMV/ pIBT35SHCPro PVY. 2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật Vector nhân dòng pRTRA chứa đoạn promoter 35S và đoạn 100xELP ( pRTRA 35SH5HistagCmyc100xELP) (Scheller và đồng tác giả, 2006; Hoang, 2012). Vector pCB301Kan (Xiang et al., 1999); Plasmid pGEMPRRS (VN07196) mang gen m và gp5 phân lập từ virus PRRS chủng Việt Nam; vector pBSK mang đoạn gen gp5opt (gp5 optimize) đã được tối ưu mã di truyền. Cây thuốc lá Nicotiana benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C; Lợn con 20 ngày tuổi; tế bào MARC 145 và chủng virus PRRS 07196. 2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Cặp mồi nhân gen gp5opt là GP5optimizeBamHI F và GP5optimizeBamHI R; cặp mồi nhân gen gp5ectom là GP5ecto NcoIF và GP5ecto pspOMIR, MpspOMIF và MBamHIR; cặp mồi nhân gen m là MBamHIF và MBamHIR; cặp mồi giải trình tự vector là 35SSQF và 35STerm.
2.1.4. Hóa chất Kit tách chiết plasmid, kit thôi gel và kit tinh sạch DNA (QIAGEN), thang DNA 1 ̣ Kb, thang protein (Fermentas), cac loai enzyme c ́ ắt giới hạn cua Fermentas. ̉ Các hoá chất Yeast extract, Agarose, Trypton, v.v. các loại kháng sinh kanamycin, rifamycine và các hóa chất thông dụng khác của các hãng Merck, Sigma,v.v. Kháng thể kháng Cmyc, kháng thể antimouse IgG cộng hợp HRP (Promega USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl), kháng thể rabit antipig IgG cộng hợp Peroxidase, hóa chất hiện màu TMB, DAB, kit hiện phim (Thermo Scientific), Protein (H5pII)3 v.v. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nhân dòng gen m, gp5opt và gp5ectom và ghép nối vào vector pRTRA Đoạn gen m và gp5ectom được nhân dòng bằng PCR sử dụng khuôn là plasmid pGEMPRRS (VN07196) và đoạn gen gp5opt được nhân dòng từ khuôn là plasmid pBSK mang gen gp5opt với các mồi đặc hiệu tương ứng. Thành phần phản ứng PCR bao gồm 0,3 μM primer, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 5 μl đệm 10X Pwo SuperYield PC, 20 ng DNA khuôn trong tổng số 50 µl hỗn hợp. Chu ̣ trình nhiêt nh ư sau: 940C/ 3 phút; 32 chu kỳ với 940C/ 30 giây, 550C/ 50 giây, 720C/ 1 phút; tiếp đó là 720C/ 10 phút và sản phẩm được giữ ở 40C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được tinh sạch và xử lý với enzyme cắt giới hạn đã được thiết kế để ghép nối vào plasmid pRTRA 35SHistagCmyc100xELP và biến nạp vào E. coli theo phương pháp sốc nhiệt của Sambrook và đtg (2012). Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh 50 mg/l kanamycin. Vector tái tổ hợp được tách chiết từ các khuẩn lạc dương tính (ColonyPCR) được giải trình tự và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7 (DNAstarinc, Madison, WI, USA). 2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector pCB301 mang gen m/ gp5opt/ gp5ectom Vector nhân dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen m, gp5opt và gp5ectom và vector pCB301 cùng được phân cắt bằng enzyme HindIII. Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao gồm 35SmHistagCmyc100xELP; 35Sgp5optHistagCmyc100xELP; 35Sgp5ectomHistagCmyc100xELP và được ghép nối vào vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase và được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt (Sambrook et al., 2012). Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được thực hiện trên môi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng phản ứng ColonyPCR. Các vector tái tổ hợp pCB301 mang gen m/ gp5opt/gp5ectom, được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn HindIII và NcoI. Các vector chuyển gen sau đó được biến nạp vào chủng A. tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện. Tách chiết và tinh sạch plasmid: Plasmid được tách chiết theo phương pháp của Sambrook và cộng sự (2012). Sử dụng bộ Kit do hãng Fermentas cung cấp để tinh sạch plasmid. Phương pháp xử lý DNA bằng enzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bộ Kit sử dụng enzyme. 2.2.3. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá
2.2.3.1. Chuẩn bị dịch khuẩn Chủng A. tumefaciens mang vector pCB301 35SmHistagCmyc100xELP hoặc pCB301 35Sgp5optHistagCmyc100xELP hoặc pCB301 35Sgp5ectomHistag Cmyc100xELP và chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pIBT35S2bCMV hoặc vector pIBT35SHCPro PVY được nuôi trong môi trường YEB có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/ph, 1218h ở 280C cho đến khi mật độ vi khuẩn OD600 đạt 0,5 1,0. Vi khuẩn được thu nhận sau khi ly tâm dịch nuôi ở tốc độ 5.000 v/ph trong 15 phút. Cặn khuẩn của 2 chủng được hòa tan trong đệm MES tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp. Dịch khuẩn có thể dùng riêng rẽ hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích của thí nghiệm. 2.2.3.2. Phương pháp biến nạp gen đích vào lá cây thuốc lá Quá trình biến nạp được tiến hành với cây thuốc lá trồng từ 3 8 tuần. Cây được úp ngược và nhấn chìm toàn bộ phần lá vào bình chứa dịch khuẩn đã được chuẩn bị ở trên, tiếp theo chuyển hệ thống này vào bình hút chân không. Áp suất bình hút chân không được chỉnh tới tới 27 inches Hg, hút trong 1,5 phút, sau đó giảm áp suất bình về áp suất không khí và mở nắp. Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục nuôi và chăm sóc trong buồng sinh trưởng. 2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp trong lá cây thuốc lá 2.2.4.1. Đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ biểu hiện gen Để đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ đến mức độ biểu hiện của các gen m, gp5opt và gp5ectom trong lá thuốc lá, dịch A. tumefaciens mang vector pCB301 chứa gen m/ gp5opt/ gp5ectom được lây nhiễm vào lá hoặc dịch vi khuẩn này kết hợp với dịch A. tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT35S2bCMV/ pIBT35SHCPro PVY, với lệ dịch (1:1) (xâm nhiễm kép). Mẫu lá được thu sau 3, 4, 5, 6 ngày sau biến nạp, tách chiết protein tổng số để đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển. Mức độ biểu hiện gen chuyển được đánh giá bằng phương pháp lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc. 2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone Thí nghiệm được bố trí với dịch A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và A. tumefaciens chứa vector pIBT35SHCPro PVY, không được bổ sung AS và bổ sung AS với nồng độ 450 µM và 600 µM. 2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn dùng cho biến nạp Thí nghiệm đánh giá mật độ khuẩn được tiến hành với với dịch khuẩn có giá trị OD600 từ 0,2; 0,5; 1,0 (gồm chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và chủng A. tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT35SHCPro PVY, lượng dịch 2 lít với tỷ lệ 1:1) và bổ sung AS ở nồng độ 450 µM). 2.2.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi của lá được xâm nhiễm Thí nghiệm: Lá non gồm các lá thứ 1, 2, 3 từ ngọn xuống; lá bánh tẻ gồm những lá tại vị trí chính giữa của thân cây; lá già gồm những lá 1, 2, 3 từ gốc lên.
2.2.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi cây Cây thuốc lá 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tuần tuổi ; các lá non và lá bánh tẻ được cho xâm nhiễm với dịch khuẩn (gồm chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu và chủng A. tumefaciens mang vector pIBT35SHCPro PVY, OD600 = 0,5) với nồng độ AS 450 µM. 2.2.5. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số Protein tổng số từ mẫu lá được tách chiết bằng dịch chiết PBS và bảo quản ở 20 C. Hàm lượng protein tổng số được đo ở bước sóng 595 nm theo phương pháp o của Bradford (1976) với đường chuẩn được xây dựng dựa vào protein BSA chuẩn đã biết trước nồng độ. 2.2.6. Điện di SDSPAGE và lai Western blot Protein hòa tan tổng số được phân tách trên gel polyacrylamide (10%) theo phương pháp của Laemmli (1970). Sau khi điện di protein tổng s ố trên gel SDSPAGE, sau đó đượ c chuyển lên màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng ở 25V, 1.3A trong 20 phút. Màng chứa kháng nguyên đượ c phủ bằng sữa tách bơ 5% (pha trong dung d ịch PBS 0,05% Tween) trong 5h; màng đượ c ủ với kháng thể kháng Cmyc qua đêm; sau đó, màng được ủ với kháng thể 2 antimouse IgG có gắn HRP (đối với mẫu huyết thanh chuột) hoặc antipig IgG g ắn peroxidase (đối với các mẫu huyết thanh lợn). Phát hiện sự có mặt của kháng nguyên tái tổ hợp bằng cách ngâm màng lai trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất DAB trong 15 phút (Phan, 2012). 2.2.7. Tinh sạch protein M, GP5 và GP5ectoM 2.2.7. 1. Tối ưu nồng độ PEG trong quá trình thu nhận protein đích Thí nghiệm: PEG 8000 được bổ sung ở dải nồng độ (2% 10%) vào 2 ml dịch chiết lá thực vật chuyển gen. Dịch chiết lá sau đó được ly tâm ở 13.000 v/p, trong 30 phút, ở 4oC. Protein dịch được biến tính và kiểm tra mức độ thu nhận protein đích bằng lai Western blot. 2.2.7.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp mITC Protein tái tổ hợp gắn ELP được tinh sạch bằng phương pháp mITC theo phương pháp của Phan, 2012. 2.2.7.2. Phương pháp tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch Tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch dựa sử dụng protein chuẩn (ScFvcmyc) đã biết trước hàm lượng và đo bằng phương pháp Bradford. 2.2.8. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 2.2.8.1. Gây miễn dịch trên chuột Kháng nguyên tái tổ hợp sau khi tinh sạch được sử dụng để gây miễn dịch trên chuột bạch 6 tuần tuổi với hàm lượng 5 µg/con chuột. Kháng nguyên được trộn đều, đồng nhất với chất bổ trợ với tỷ lệ 1:1 . Chuột được chia làm 5 nhóm. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc (đối chứng dương); nhóm 2: Tiêm PBS (đối chứng âm), nhóm 3: Tiêm kháng nguyên MELP; nhóm 4: Tiêm kháng nguyên GP5ELP; nhóm 5: Tiêm kháng nguyên GP5ectoMELP. Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng
Hanvet 1.VN một lần duy nhất. Các nhóm 2, 3, 4, 5 được tiêm nhắc lại 3 lần. Mẫu máu được lấy để chiết huyết thanh tại ba thời điểm: Ngày 0 (Trước khi tiêm), 21 và 35. Phân tích huyết thanh chuột sau 2 lần tiêm và sau 3 lần tiêm bằng ELISA và Western blot. 2.2.8.2. Gây miễn dịch trên lợn Lợn con 3 tuần tuổi khỏe mạnh, âm tính với kháng thể kháng PRRSV được chia thành bốn nhóm, mỗi nhóm 3 con lợn. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN; nhóm 2: Tiêm dịch chiết lá thuốc lá không chuyển gen (WT); nhóm 3: Tiêm dịch chiết thô chứa protein GP5ELP (150 µg/ml); nhóm 4: Tiêm dịch chiết thô chứa protein GP5ectoMELP (150 µg/ml). Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược độc một lần duy nhất. Các nhóm 2, 3 và 4 được tiêm nhắc lại 3 lần: ngày 0, 14 và 28. 2.2.8.3. Xác định kháng thể kháng GP5ELP và GP5ectoMELP trong huyết thanh lợn Mẫu máu của lợn được lấy để chiết huyết thanh tại bốn thời điểm: Ngày 0, 14, 28, 35 và 49. Các huyết thanh chiết từ các mẫu máu của lợn thí nghiệm được sử dụng với vai trò là kháng thể 1 cho việc xác định kháng thể IgG đặc hiệu bằng ELISA, Western blot và phản ứng IPMA. Tất cả các huyết thanh lợn đã được pha loãng 20 lần. Khả năng sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu của từng loại kháng nguyên tương ứng được tính toán sau lần tiêm thứ 2 và thứ 3. Phương pháp ELISA: Để kiểm tra các kháng thể có mặt trong huyết thanh chuột/lợn, sử dụng các phiến ELISA giám sát dịch tễ huyết thanh học của PRRS đã được gắn sẵn các kháng nguyên của PRRSV tự nhiên. Tiếp theo đĩa được phủ với huyết thanh (đã được pha loãng 100 lần), trong 2 giờ; rửa đĩa 5 lần với PBS 1X; phủ đĩa với kháng thể antimouse IgG có gắn HRP (kháng thể 2) với độ pha loãng 500 lần, trong 2 giờ; rửa lại bằng dung dịch PBS 1X 5 lần. Đĩa được hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất TMB, 15 phút, sản phẩm phản ứng cho màu xanh, sau đó cố định màu bằng HCl 1N, màu của phản ứng được đo ở bước sóng 450 nm. Phương pháp Western blot: Phản ứng lai Western được thực hiện như mục 2.2.6.2 với thay đổi kháng thể thứ nhất được dùng trong trường hợp này là kháng thể trong huyết thanh của chuột/lợn. Lai miễn dịch chéo: Phản ứng Western blot được thực hiện với kháng nguyên tái tổ hợp; kháng thể sơ cấp là kháng huyết thanh của nhóm chuột/lợn được tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN; kháng thể thứ cấp là antimouse IgG gắn HRP (Đối với huyết thanh chuột)/ antipig IgG gắn peroxidase (Đối với huyết thanh lợn). Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp (IPMA): Phương pháp thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 840021:2014 về Bệnh động vật. Xử lý và phân tích thống kê kết quả thực nghiệm : Phân tích thống kê được thực hiện trên chương trình Ecxel sử dụng phương pháp Student’ ttest p ≤ 0,05 là có ý nghĩa thống kê. 2.3. Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Phòng thử nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học và Trung tâm chẩn đoán thú y TƯ. Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ectom và tạo chủng Agrobacterium mang vector 3.1.1. Vector pCB301 mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp Elastin like polypeptide (MELP) 3.1.1.1. Tạo vector pRTRA 35SmHistagCmyc100xELP Gen m (528 bp) được khuếch bằng PCR và ghép nối thành công vào vector pRTRA tạo thành vector tái tổ hợp pRTRA 35S mHistagCmyc100xELP; sau đó vector được biến nạp tế bào E. coli. Kết quả đã được kiểm tra bằng kỹ thuật colonyPCR và bằng cắt enzyme giới hạn (Hình 3.1). Vector pRTRA 35SmHistagCmyc100xELP và vector chuyển gen pCB301 được xử lý bằng cùng HindIII; sản phẩm thu được là: Đoạn DNA gồm cấu trúc 35SmHistagCmyc100xELP có kích thước khoảng 3,0 kb và khung vector pCB301 mở vòng có kích thước khoảng 5,5 kb. Hình 3.1. Tao vector tách dòng pRTRA 35SmHistagCmyc100xELP. (A): Sản phẩm PCR nhân gen m; (B): Sản phẩm colonyPCR chọn dòng vi khuẩn; (C): Sản phẩm cắt pRTRA tái tổ hợp bằng BamHI.3.1.1.2. Thiết kế vector pCB301 35S mHistag Cmyc100xELP Khung vector pCB301 được ghép nối với cấu trúc cassette 35S mHistagCmyc 100xELP tạo vector chuyển gen pCB301 35SmHistagCmyc100xELP. Kết quả kiểm tra bằng kỹ thuật colonyPCR và bằng cắt enzyme giới hạn (3.2) cho thấy đã thiết kế thành công vector pCB301 mang cassette 35SmHistagCmyc100xELP đảo chiều với cassete gen chọn lọc (Nos pro nptIIINos ter). Vector chuyển gen có cassette đảo chiều này được dùng để biến nạp vào A. tumefacines phục vụ cho thí nghiệm biểu hiện tạm thời. Hình 3.2. Kết quả thiết kế vector pCB301 35SmHistagCmyc100xELP . (A): Vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp được cắt bằng HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ hợp cắt bằng NcoI; (C): Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35SmHistagCmyc 100xELP đảo chiều với cassete Nos pronptIIINos ter.
Vector chuyển gen pCB301 35SmHistagCmyc100xELP được biến nạp vào chủng A. tumefaciens C58C1. Kết quả đã tạo thành công chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector chuyển gen pCB301 35SmHistagCmyc100xELP. 3.1.2. Vector chuyển gen mã hoá kháng nguyên GP5ELP 3.1.2.1. Tạo vector pRTRA 35Sgp5optHistagCmyc100xELP Gen gp5opt (510 bp) được khuếch đại bằng PCR và ghép nối vào vector pRTRA; sau đó vector được biến nạp tế bào E. coli. Hình 3.3. Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35Sgp5optHistagCmyc100xELP. (A): PCR nhân gen gp5opt; (B): Sản phẩm colonyPCR chọn dòng vi khuẩn mang pRTRA tái tổ hợp; (C): Sản phẩm cắt pRTRA tái tổ hợp bằng BamHI. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật colonyPCR và bằng cắt enzyme giới hạn cho thấy đã tạo thành công pRTRA 35Sgp5optHistagCmyc100xELP (Hình 3.3). 3.1.2.2. Thiết kế vector pCB301 35Sgp5optHistagCmyc100xELP Kết quả đã thiết kế thành công vector pCB301có cassette gen 35Sgp5optHistag Cmyc100xELP đảo chiều so với cassette gen NOS pronptIIINOS ter (Hình 3.4). Hình 3.4. Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35Sgp5optHistagCmyc 100xELP. (A): Vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp được cắt bằng HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ hợp cắt bằng NcoI; (C): Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35Sgp5optHistagCmyc100xELP đảo chiều. Đã tạo được chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pCB301 35Sgp5opt HistagCmyc100xELP. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR. 3.1.3. Vector chuyển gen mã hoá hỗn hợp kháng nguyên GP5ectoMELP 3.1.3.1. Tạo vector pRTRA 35S gp5ectomHistagCmyc100xELP Đoạn gen gp5ecto (192 bp) mã hóa cho một đoạn protein GP5 vùng ngoại bào (GP5 ectodomain) và gen m (528 bp) mã hóa protein M đượ c khuếch đại đơn lẻ bằng phản ứng PCR v ới c ặp m ồi đặc hiệu tươ ng ứng. Sản phẩm PCR nhân gen
gp5ecto đượ c cắt bằng NcoI và pspOMI; sản phẩm PCR nhân gen m đượ c cắt bằng pspOMI và BamHI và đồng thời cắt vector pRTRA 35SHistagCmyc 100xELP bằng NcoI và BamHI; sau đó, ghép nối 3 sản phẩm cắt này với nhau đã tạo được vector tái tổ hợp pRTRA 35Sgp5ectomHistagCmyc100xELP (Hình 3.5). Hình 3.5. Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35Sgp5ectomHistagCmyc100xELP. 3.1.3.2. Thiết kế vector chuyển gen pCB301 35Sgp5ectom HistagCmyc100xELP Kết quả cắt vector pRTRA35Sgp5ectomHistagCmyc100xELP và vector pCB301 bằng HindIII, sau đó ghép nối cassette 35Sgp5ectomHistagCmyc 100xELP với khung vector pCB301 mở vòng đã tạo được vector pCB301 mang cassette 35Sgp5ectomHistagCmyc100xELP đảo chiều so với cassett e gen kháng kháng sinh (NOS pronptIIINOS ter) (Hình 3.6). Đã tạo được chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pCB301 35Sgp5ectomHistagCmyc100xELP. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR. Hình 3.6. Kết quả phân tích kiểm tra vector pCB301 mang gen gp5ectom mã hóa kháng nguyên GP5ectoM dung hợp ELP. 3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M, GP5, GP5ectoM dung hợp ELP trong cây thuốc lá 3.2.1. Anh h ̉ ưởng của vector hỗ trợ đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Kết quả cho thấy, vector hỗ trợ pIBT35SHCPro PVY mang gen mã hóa protein HcPro PVY hỗ trợ tăng cường biểu hiện kháng nguyên MELP, GP5ELP và GP5ectoM tốt hơn so vector hỗ trợ pIBT35S2bCMV mang gen mã hóa protein 2b CMV (Hình 3.7). Vì vậy, HcPro PVY được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pIBT35S2bCMV và pIBT35SHCPro PVY đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kế quả lai Western sử dụng kháng thể kháng Cmyc. 3.2.2. Anh h ̉ ưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Thí nghiệm với 2 nồng độ AS là 450 µM và 600 µM; kết quả cho thấy sử dụng nồng độ AS 450 µM là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các protein tái tổ hợp ở lá thuốc lá (Hình 3.8). Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các gen mã hóa các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc. 3.2.3. Anh h ̉ ưởng của mật độ vi khuẩn đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Hình 3.9. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các kháng nguyên MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP được xác định bằng lai Western.
Thí nghiệm biến nạp được tiến hành với dịch khuẩn có các giá trị OD600 là 0,2; 0,5 và 1,0. Kết quả thu được cho thấy mật độ vi khuẩn với giá trị OD600 = 0,5 là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELPở lá thuốc lá (Hình 3.9). 3.2.4. Anh h ̉ ưởng của tuổi sinh lý của lá đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Kết quả thu được cho thấy tuổi sinh lý của lá ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu quả biểu hiện gen tạm thời. Lá non và lá bánh tẻ là thích hợp nhất cho biểu hiện của các gen mã hóa các kháng nguyên MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP tái tổ hợp. Hình 3.10. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến biểu hiện tạm thời các gen mã hoá cho các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot. 3.2.5. Anh h ̉ ưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP Kết quả thu được cho thấy, cây thuốc lá ở 4 6 tuần tuổi là thích hợp để sử dụng cho biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng nguyên nghiên cứu. Hình 3.11. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các protein tái tổ hợp đượ c xác định bằng lai Western blot. 3.2.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá các protein tái tổ hợp (MELP, GP5ELP, GP5ectoMELP) trong điều kiện đã được tối ưu
Hình 3.12. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP bằng lai miễn dịch dựa vào protein chuẩn đã được định lượng H5pII. Kết quả phân tích cho thấy mức độ biểu hiện của các protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP, tương ứng là 0,75%; 0,48% và 0,95 % protein hòa tan tổng số, tương ứng là 52,4 mg/kg; 35 mg/kg và 66,8 mg/kg lá tươi (Hình 3.12). 3.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP 3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch Nồng độ 6% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên MELP là tốt nhất (Hình 3.13). Hình 3.13. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên MELP. Kết quả cho thấy, nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên GP5ELP là tốt nhất (Hình 3.14). Hình 3.14. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ELP. Nồng độ 8% PEG 8000 bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên GP5ectoMELP là tốt nhất (Hình 3.15). Hình 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ PEG8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM ELP. 3.3.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp MELP, GP5ELP và GP5ectoMELP bằng phương pháp mITC 3.3.2.1. Tinh sạch protein MELP
Hình 3.16. Đánh giá sự tinh sạch của protein MELP bằng SDSPAGE và lai miễn dịch. A, B: 1: Dịch chiết thô trước xử lý; 2: Dịch chảy qua màng; 3: Protein MELP tách rửa khỏi màng; (C): Protein MELP thu nhận được sau khi tinh sạch. Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein MELP tái tổ hợp (66 kDa) bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.16). Định lượng protein thu nhận được bằng phương pháp đo Bradford, lai miễn dịch và phần mềm Image J, cho thấy đã tinh sạch và thu nhận đúng protein MELP (hình 3.17) với hiệu suất thu hồi là 86,5%, mức độ tinh sạch là 82,1%. Hình 3.17. Định lượng protein tái tổ hợp MELP bằng lai miễn dịch. ScFV-Cmyc (đối chứng dương) được đưa vào giếng với các nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng. 3.4.2.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5ELP Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein GP5ELP tái tổ hợp bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.18). Hiệu suất thu hồi protein GP5 ELP là 98%, mức độ tinh sạch là 81,1%. Hình 3.18. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5ELP bằng lai Western blot và điện di SDSPAGE. 1 2 3 4 5 6