Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài "Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn" nhằm đánh giá được thành phần loài và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của một số chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập được ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ). Mời các bạn cùng tham khảo luận án.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI NGU N THỊ THÙ VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƢỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.42.01.07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2022
Công trình được hoàn thành tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS Dƣơng Minh Lam 2. GS.TS Ngô Sỹ Hiền Phản biện 1: PGS. TS Lê Thanh Bình Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phản biện 2: PGS. TS Vũ Nguyên Thành Viện Công nghệ thực phẩm Phản biện 3: PGS. TS Trần Văn Tuấn Đại học Quốc gia Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi …..giờ … ngày … tháng… năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
1 MỞ ĐẦU Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng. Đây là nhóm nấm có vai trò rất quan trọng đối với hệ sinh thái. Cho đến nay có gần 2000 loài nấm ký sinh côn trùng được ghi nhận. Nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp như: Cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid, terpenoid... Các chất chuyển hóa thứ cấp từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính mạnh đã và đang thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Trong đó đáng chú ý là nhóm hoạt chất cyclooligomer depsipeptide. Cyclooligomer depsipeptide (COD) là một nhóm đặc biệt của nonribosomal peptid gồm 2, 3 hoặc 4 đơn phân. Trong đó mỗi đơn phân được cấu tạo bởi ít nhất một 2-hydroxycarboxylic acid và một 2-amino acid. COD được sinh tổng hợp nhờ hệ enzyme non-ribosomal peptide synthetase (NRPSs). COD là hoạt chất tự nhiên được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật, tảo, hải miên, và một số loại sinh vật biển khác. Trong các nhóm COD thì COD từ nấm ký sinh côn trùng là một nhóm rất quan trọng, chiếm tỷ lệ lớn nhất. Cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính sinh học rộng, bao gồm khả năng gây độc ở thực vật, gây độc tế bào, kháng vi rút, diệt côn trùng, chống sốt rét, chống khối u, ức chế hoạt động của một số loại enzyme cũng như là hạn chế sự hình thành các amyloid ở bệnh Alzheimer. Đặc biệt trong các nghiên cứu gần đây cho thấy COD từ nấm ký sinh côn trùng rất có tiềm năng trong phòng chống ung thư, ức chế sự sinh trưởng của một số dòng ung thư khác nhau ở người. Hiện nay, các hoạt chất COD từ nấm ký sinh côn trùng được coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên mới rất tiềm năng ứng dụng trong y dược. Trên thế giới việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng cũng như COD từ nấm ký sinh côn trùng bắt đầu từ rất sớm. Điển hình như nghiên cứu về tách chiết enniatin A từ nấm Fusarium orthocera var. enniatinum của Gaumann (1947), nghiên cứu về sinh tổng hợp cyclodepsipeptide D- D-, L-L-, và D-L- Cyclodi- (β-seryloxy- propionyl) của Hassal và cộng sự (1967) hay nghiên cứu về cấu trúc của beauvericin từ nấm của Hamill và cộng sự (1969),... Trải qua hơn 70 năm, nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng vẫn thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng và ứng dụng của chúng đã được công bố. Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào đa dạng nấm ký sinh côn trùng hoặc sử dụng sinh khối nấm để sản xuất các chế phẩm ứng dụng làm thuốc trừ sâu, tiêu biểu như nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Thị Lộc (2006),
2 Phạm Thị Thùy (2010), Phạm Văn Nhạ (2013),… Nghiên cứu về COD từ nấm ký sinh côn trùng là vấn đề rất mới mẻ, hiện chưa có một công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam đề cập tới vấn đề này. Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn Quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) là hai khu vực có độ đa dạng sinh học nổi bật ở miền Bắc Việt Nam. Được thiên nhiên ưu đãi về điều kiện tự nhiên vì thế hệ động thực vật ở hai khu vực này rất phong phú, không chỉ có giá trị nghiên cứu khoa học, bảo tồn nguồn gen mà còn có ý nghĩa trong phát triển kinh tế, khai thác tài nguyên thiên nhiên (đặc biệt là tài nguyên sinh vật). Với những khu rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ở đây có rất nhiều loài động thực vật quý hiếm hiện hữu và đặc trưng cho vùng núi phía Bắc. Tuy nhiên khu hệ nấm ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn còn chưa có nhiều nghiên cứu. Những hiểu biết về đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế. Đặc biệt, hầu như không có bất kỳ nghiên cứu nào về nấm gây bệnh côn trùng ở hai khu vực này. Nhằm bổ sung các hiểu biết về nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng cũng như góp phần xây dựng danh mục nguồn gen, bảo tồn đa dạng sinh học các loài nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn”. Mục tiêu đề tài Đánh giá được thành phần loài và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của một số chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập được ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ). Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Nấm được phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ). - Phạm vi nghiên cứu: Phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp COD. Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường và điều kiện nuôi cấy thu nhận COD, tách chiết, tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học của COD từ chủng nấm đã tuyển chọn. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và nghiên cứu đa dạng nấm ký sinh côn trùng từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn. - Tuyển chọn các chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide.
3 - Nghiên cứu định loại chủng nấm đã tuyển chọn bằng phương pháp hình thái và sinh học phân tử. - Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy, sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide cho chủng nấm đã tuyển chọn ở quy mô phòng thí nghiệm. - Nghiên cứu thu hồi, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của cyclooligomer depsipeptide. - Nghiên cứu khảo sát một số hoạt tính sinh học của các phân đoạn trong quá trình tách chiết cyclooligomer depsipeptide. Những đóng góp mới của luận án - Là luận án đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện (từ khâu phân lập, tuyển chọn, định loại, nghiên cứu các đặc điểm lên men thu nhận, tách chiết, tinh sạch, khảo sát hoạt tính sinh học của COD) về một chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps có khả năng sinh tổng hợp COD và có tiềm năng ứng dụng. - Đây là luận án đầu tiên công bố về đa dạng nấm ký sinh côn trùng và khả năng sinh tổng hợp COD của chủng nấm phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ). - Lần đầu tiên ghi nhận sự có mặt của loài nấm Cordyceps cateniannulata tại Việt Nam. - Là công bố đầu tiên trên thế giới về Cordyceps cateniannulata có khả năng sinh tổng hợp COD. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 158 trang, bao gồm các phần sau: Mở đầu: 4 trang Chương 1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu: 37 trang Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 15 trang Chương 3. Kết quả và Thảo luận: 71 trang Kết luận và Kiến nghị: 2 trang Tài liệu tham khảo: Luận án tham khảo được 12 tài liệu tiếng Việt, 209 tài liệu tiếng nước ngoài, 02 trang Web. Phụ lục: Luận án có 11 phụ lục các kết quả phân tích, trình tự ADN, phổ.
4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Trong chương này, sáu vấn đề liên quan đến các nghiên cứu trong luận án này đã được tổng quan. Đó là: (1.1) Nấm và nấm ký sinh côn trùng; (1.2) Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide; (1.3) Nhu cầu dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy của nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide; (1.4) Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng; (1.5) Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam. Trong phần (1.1) Nấm và nấm ký sinh côn trùng, giới thiệu về nấm (mục 1.1.1), sơ lược về nấm ký sinh côn trùng và các hoạt chất trao đổi chất thứ cấp từ nấm ký sinh trùng (mục 1.1.2) đã được trình bày cụ thể. Trong phần (1.2) Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide, các nội dung về cấu trúc hóa học, các dạng COD từ nấm và hoạt tính của COD đã được tổng quan (mục 1.2.1). Đa dạng nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide (Một số chi nấm ký sinh côn trùng phổ biến sinh tổng hợp COD, Nấm Cordyceps spp. sinh tổng hợp COD - mục 1.2.2) và con đường sinh tổng hợp COD ở nấm (mục 1.2.3) được trình bày cụ thể từ trang 18 đến trang 25. Phần (1.3) Nhu cầu dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy của nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide, chúng tôi đã tổng quan về: Lựa chọn môi trường nuôi cấy, độ pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ. Trong phần (1.4) Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng, các bước tách chiết, tinh sạch, các phương pháp trong nghiên cứu cấu trúc COD đã được tổng quan và mô tả cụ thể. Trong phần (1.5) Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam, các hướng nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp COD trên thế giới và Việt Nam đặc biệt là ở khu vực nghiên cứu đã được tổng quan. CHƢƠNG II: NGU ÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trong chương này, các Nguyên vật liệu và đối tƣợng nghiên cứu được trình bày trong mục (2.1) bao gồm: (2.1.1) Đối tượng nghiên cứu; (2.1.2) Hóa chất và thiết bị; (2.1.3) Môi trường. Các Phƣơng pháp nghiên cứu (mục 2.2) được chia thành 05 nhóm chính như sau: 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật học gồm các phương pháp: Phương pháp phân lập, Phương pháp giữ giống, Phương pháp ho t h h ng n m t y n
5 h n, Phương pháp t y n h n h ng n m inh y looligom depsipeptide, Phương pháp ông khô, Phương pháp lự h n môi t ường dinh dưỡng và iề kiện n ôi y phù hợp ho inh t ưởng và tí h lũy COD h ng t y n h n, Đánh giá ho t tính gây ộ tế bào th o phương pháp MTT, Phương pháp ánh giá ho t tính kháng vi inh vật ki m ịnh, Đánh giá ho t tính hống oxi h . 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử gồm các phương pháp: Tá h hiết ADN tổng ố, Nhân bội ADN, Phương pháp giải t ình tự. 2.2.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide gồm các phương pháp: Phương pháp tá h hiết á hợp h t từ inh khối n m, Phương pháp xá ịnh tú h h á hợp h t h, Thự nghiệm tá h hiết, tinh h hợp h t COD từ inh khối n m C. cateniannulata CPA14V. 2.2.4. Phương pháp phân tích gồm các phương pháp: Phương pháp xá ịnh inh khối khô (CDW), Phương pháp ịnh lượng COD t ong inh khối n m. 2.2.5. Phương pháp toán học. CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn 3.1.1. Kết quả phân lập và nghiên cứu đặc điểm của nấm ký sinh côn trùng ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn Kết quả từ 24 mẫu ký chủ thuộc các bộ côn trùng Blattodea, Hemiptera, Coleoptera, Hymenoptera và Lepidoptera, 24 chủng nấm đã được phân lập, thuần khiết và bảo quản cho các nghiên cứu tiếp theo. Ký hiệu các chủng lần lượt là: CPA1, CPA3, CPA5, CPA13V, CPA14V, CPA15, CPA16, CPA31, CPA40, CPA44, XS01, XS07, XS12, XS36, XS37, XS38, XS57, XS65, XS66, XS67, XS69, XS71, XS77, XS83. Tiến hành phân loại 24 chủng nấm ký sinh côn trùng đã phân lập được dựa trên đặc điểm hình thái mẫu vô tính, hữu tính ngoài tự nhiên; đặc điểm nuôi cấy và trình tự ITS của một số chủng các chủng nấm. Kết quả xác định được các chủng đã phân lập thuộc các chi Aschersonia (01 mẫu), Purpureocillium (01 mẫu), Beauveria (08 mẫu), Cordyceps (06 mẫu), Isaria (05 mẫu), và Ophiocordyceps (03 mẫu). Kết quả cụ thể được thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.25 dưới đây.
6 Bảng 3.1. Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc Họ nấm Chi Số Chủng Ký chủ mẫu Clavicipitaceae Aschersonia 01 XS01 Hemiptera Cordycipitaceae Beauveria 08 CPA5 Coleoptera CPA15 Coleoptera CPA16 Lepidoptera CPA44 Coleoptera XS36 Coleoptera XS37 Coleoptera XS38 Hymenoptera XS83 Lepidoptera Cordyceps 06 CPA3 Coleoptera CPA13V Lepidoptera CPA14V Blattodea CPA31 Lepidoptera XS57 Hymenoptera XS67 Hymenoptera Isaria 05 CPA40 Blattodea XS07 Lepidoptera XS66 Hymenoptera XS69 Lepidoptera XS71 Lepidoptera Ophiocodycipitaceae Ophiocordyceps 03 CPA1 Hymenoptera XS12 Hymenoptera XS65 Hymenoptera Purpureocillium 01 XS77 Coleoptera
7 Hình 3.25. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập tại khu vực nghiên cứu
8 3.1.2. Một số nhận xét về đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn Kết quả 33,3% các chủng đã phân lập thuộc chi Beauveria, tiếp theo là chi Cordyceps (25%) và Isaria (20,8%). Sự xuất hiện loài thuộc chi Aschersonia ký sinh trên Hemiptera là lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam. Trong 5 bộ ký chủ, Hymenoptera có số mẫu 07/24 mẫu thu thập được và là ký chủ của nhiều chi nấm nhất trong nghiên cứu bao gồm Ophiocordyceps, Cordyceps, Beauveria, và Isaria. Tương tự bộ ký chủ Coleoptera có số mẫu 07/24 mẫu thu thập được và là ký chủ của 3/6 chi nấm trong nghiên cứu (Beauveria, Cordyceps và Purpureocillium). Trong nghiên cứu này, Cordyceps spp. được tìm thấy trên 4 bộ ký chủ nhưng không tìm thấy trên Hemiptera. Chủng nấm Isaria được tìm thấy ở bộ côn trùng Blattodae trong nghiên cứu là một ghi nhận mới. Có sự khác biệt nhỏ giữa hai khu vực nghiên cứu. Ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, 10 mẫu nấm ký sinh côn trùng thu được trong 02 đợt thu mẫu được phân loại vào 4/6 chi nghiên cứu. Trong khi ở Vườn quốc gia Xuân Sơn, 14 mẫu nấm thu được trong 01 đợt thu mẫu được phân loại vào 6/6 chi nghiên cứu. 3.2. Khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của các chủng nấm ký sinh côn trùng đã phân lập Kết quả cho thấy, 19/24 (79%) chủng nấm phân lập được có khả năng sinh tổng hợp COD trung bình từ 0,11 - 4,98 mg/g. Tất cả các chủng thuộc chi Beauveria đều có khả năng sinh COD, trong khi 83.3% các chủng Cordyceps và 60% các chủng Isaria có khả năng này. Phát hiện này đã chứng minh rằng các loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae rất có tiềm năng trong sản xuất COD và rất đáng để nghiên cứu. Bốn chủng Isaria sp. XS69, Isaria sp. CPA40, Cordyceps sp. CPA14V và Beauveria sp. CPA16 có khả năng sinh COD cao nhất, đạt 3,48, 3,88, 4,81, và 4,98 mg/g, trong khi sinh khối CDW tích lũy lần lượt đạt 9,38, 10,42, 9,84, và 5,81 g/l. Trong các chủng này thì chủng Cordyceps sp. CPA14V được tìm thấy trên ký chủ thuộc bộ côn trùng Blattodea có khả năng sinh 47.29 mg/l sau 6 ngày nuôi cấy. Chủng nấm Cordyceps sp. CPA14V rất có tiềm năng, cần phải có thêm các nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy và sản xuất COD từ chủng này.
9 Bảng 3.2. Khả năng sinh tổng hợp COD của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc ở khu vực nghiên cứu Chủng CDW (g/l) COD (mg/g) COD (mg/l) a a Aschersonia sp. XS01 3,97 ±0,053 0,00 ±0,000 0,00a±0,000 Beauveria sp. CPA5 7,11c±0,123 1,09f±0,045 7,72f±0,131 Beauveria sp. CPA15 7,23c±0,082 1,07f±0,074 7,7lf ±0,438 Beauveria sp. CPA16 5,81b±0,050 4,98o±0,025 28,97i±0,275 Beauveria sp. CPA44 11,05l±0,123 0,11a±0,012 1,18ab±0,089 Beauveria sp. XS36 8,04e±0,070 0,58e±0,021 4,64de+±0,144 Beauveria sp. XS37 11,55mn±0,041 0,51de±0,019 5,85ef±0,14 Beauveria sp. XS38 10,23k±0,106 1,25f±0,033 12,8g+±0,329 Beauveria sp. XS83 13,29p±0,057 2,77h±0,110 30,15i±0,945 b ab Cordycep sp. CPA3 6,08 ±0,065 0,2 ±0,041 1,2ab±0,186 Cordyceps sp. CPA13V 11,77mn±0,180 2,61i±0,029 30,69ik±0,568 Cordyceps sp. CPA14V 9,84i±0,094 4,81n±0,074 47,29m±0,144 Cordyceps sp. CPA31 14,07q±0,054 0,00a±0,000 0,00a±0,000 Cordyceps sp. XS57 8,6f±0,102 0,46cde±0,009 3,98cde±0,041 Cordyceps sp. XS67 8,48f±0,204 2,86k±0,110 24,27h±1,071 Isaria sp. CPA40 10,42k±0,070 3,88m±0,021 40,39l±0,054 Isaria sp. XS07 12,76o±0,029 1,88g±0,082 23,95h±0,775 Isaria sp. XS66 8,62f±0,102 0,00a±0,000 0,00a±0,000 Isaria sp. XS69 9,38h±0,140 3,48l±0,213 32,59k±1,102 Isaria sp. XS71 11,85n±0,017 0,00a±0,000 0,00a±0,000 Ophiocordyceps sp. CPA1 7,61d±0,090 0,62e±0,029 4,72de±0,122 Ophiocordyceps sp. XS12 8,08e±0,143 0,06a±0,005 0,46a±0,029 Ophiocordyceps sp. XS65 11,48m±0,016 0,00a±0,000 0,00a±0,000 Purpureocillium sp. XS77 9,05g±0,176 0,45cde±0,029 4,1cde±0,127
10 3.3. Định loại chủng nấm CPA14V bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử 3.3.1. Đặc điểm hình thái của chủng nấm CPA14V Hình 3.27. Đặc điểm hình thái của chủng Cordyceps sp. CPA14V a) Tr ng thái vô tính ngoài tự nhiên a ch ng n m Cordyceps sp. CPA14V; b) Bào tử ch ng Cordyceps sp. CPA14V; c) Khuẩn l c ch ng Cordyceps sp. CPA14V t ên môi t ường Sabouraud; d) Khuẩn l c ch ng Cordyceps sp. CPA14V t ên môi t ường Czapek-Dox; ) Bào tử và ống inh bào tử ch ng Cordyceps sp. CPA14V t ên môi t ường Czapek-Dox ( l b : b, =10 µm; c,d=2cm) Đặc điểm hình thái trạng thái sinh sản vô tính của chủng nấm CPA14V đã phân lập giống với các đặc điểm của chi Paecoelomyces, một trong những chi nấm ở trạng thái vô tính của các loài Cordyceps. 3.3.2. Định loại chủng nấm CPA14V bằng phương pháp sinh học phân tử Vật liệu di truyền của chủng nấm CPA14V đã tuyển chọn được tách chiết để khuếch đại trình tự gen ITS, LSU và Rpb1 bằng phản ứng PCR, sản phẩm được gửi sang công ty First BASE (Singapore) để tiến hành xác định trình tự nucleotide. Trình tự nucleotide của chủng nấm CPA14V được sử dụng để so sánh với các trình tự liên quan có sẵn trong Ngân hàng gen NCBI cho thấy rằng các trình tự tương tự nhất là các loài Cordyceps. Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm CPA14V được xây dựng dựa trên trình tự các vùng gen ITS, LSU và Rpb1 bằng phương pháp Neighbor Joining với bootstrap 1000 sử dụng phần mềm Mega X, lần được các kết quả như hình 3.28, 3.29, 3.30.
11 Hình 3.28. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen ITS
12 Hình 3.29. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen LSU
13 Hình 3.30. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên 3 vùng gen ITS, LSU và Rpb1 Qua phân tích cây phát sinh chủng loại khi sử dụng đơn lẻ từng vùng gen mục tiêu ITS, LSU, Rpb1 và kết hợp cả ba vùng gen trên khẳng định chủng nấm CPA14V nghiên cứu thuộc loài Cordyceps cateniannulata, chi Cordyceps, họ Cordycipitaceae. Như vậy, thông qua phân tích cây phát sinh chủng loại và đặc điểm hình thái có thể kết luận chủng CPA14V là loài Cordyceps cateniannulata CPA14V. Lần đầu tiên ghi nhận sự có mặt của loài nấm này ở Việt Nam. 3.4. Nghiên cứu môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V. Các môi trường dinh dưỡng lựa chọn để nghiên cứu bao gồm 05: Môi trường PGB; môi trường Sabouraud (SBR); môi trường MM; môi trường Czapek-Dox (CzD); môi trường FDM. Các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng nghiên cứu
14 bao gồm: pH môi trường, nguồn cacbon, nguồn nitơ. Kết quả nghiên cứu được trình bày cụ thể từ trang 99 đến 108 bản toàn văn của luận án tiến sỹ này. a) Khả năng inh t ưởng c a ch ng n m C. cateniannulata CPA14V trong 05 lo i môi t ường nghiên ứu b) Khả năng inh tổng hợp COD c a ch ng n m C. cateniannulata CPA14V trong 05 lo i môi t ường nghiên ứu Hình 3.31. Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V trong 05 loại môi trƣờng nghiên cứu
15 Hình 3.32 Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V Hình 3.33. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V
16 Hình 3.34. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường Czapek-Dox (CzD) với độ pH môi trường 8, nguồn cacbon là glucose, nguồn nitơ là cao nấm men, rất phù hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V. Khi sử dụng môi trường này kết hợp với nuôi lắc 150 vòng/phút trong thời gian 6 ngày ở nhiệt độ 25oC chúng tôi thu được kết quả 65,789 ± 2,186g/l COD. Kết quả cụ thể được thể hiện ở hình 3.31, 3.32, 3.33, 3.34. 3.5. Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ C. cateniannulata CPA14V 3.5.1. Tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide từ C. cateniannulata CPA14V ở quy mô phòng thí nghiệm Tiến hành tách chiết và tinh sạch COD từ chủng nấm nghiên cứu. Các kết quả về: Chuẩn bị sinh khối mẫu, ngâm chiết và tạo cặn chiết, phân lập các chất từ cao chiết dichloromethane (CCD) bằng sắc ký cột và một số yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận COD được trình bày cụ thể từ trang 108 đến trang 114 của bản toàn văn luận án. Kết quả nghiên cứu tách chiết và tinh sạch COD từ chủng C. cateniannulata CPA14V cho thấy trình tự sử dụng dung môi chiết phù hợp là dichloromethane, nước, n-hexane và kết hợp với hệ thống sắc kí bản mỏng, sắc kí cột thường với silicagel, sắc ký pha đảo với YMC RP 18 và sắc ký ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 và kết tinh bằng axeton cho hiệu suất (0,37% CDW) và tinh sạch beauvericin cao (98,1%). Hiệu suất chiết và tinh sạch tốt nhất ở điều kiện siêu âm sinh khối với dichloromethane trong 2 giờ, ở nhiệt độ 50oC (xem hình 3.35, 3.36, 3.37, 3.38).
17 Hình 3.35. Qui trình thu nhận COD (CC1) qui mô phòng thí nghiệm
18 Hình 3.36. Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm lƣợng CC1 Hình 3.37. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng CC1 Hình 3.38. Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hàm lƣợng CC1