Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng Curcuma longa L. nhằm định hướng tăng năng suất và chất lượng củ nghệ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án nhằm nghiên cứu và khai thác nguồn vi sinh vật vùng rễ cây nghệ, đặc biệt là các nhóm vi khuẩn và nấm vùng rễ hữu hiệu của cây nghệ vàng C. longa, để tạo cơ sở xaayd ựng hệ thống quản lý dinh dưỡng tổng hợp thích hợp cho cây nghệ trồng tại Việt Nam, giúp nâng cao năng suất và chất lượng củ nghệ một cách an toàn và bền vững.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng Curcuma longa L. nhằm định hướng tăng năng suất và chất lượng củ nghệ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hoàng Kim Chi NGHIÊN CỨU KHU HỆ VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG Curcuma longa L. NHẰM ĐỊNH HƢỚNG TĂNG NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƢỢNG CỦ NGHỆ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: GS. TS. Lê Mai Hương Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Trần Thị Như Hằng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ....’, ngày … tháng … năm …… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Curcumin và các chất curcuminoid là thành phần hoạt chất có giá trị trong củ của cây nghệ vàng Curcuma longa L.. Trong những năm vừa qua, trước nhu cầu lớn về curcumin để phục vụ công nghiệp dược nhằm tạo ra các loại thuốc điều trị bệnh hiệu quả, lượng nghệ trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng đang đứng trước thực trạng không đáp ứng đủ nguyên liệu cho sản xuất. Vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách cải tiến kỹ thuật canh tác và bảo quản sau thu hoạch cây nghệ, kết hợp sử dụng công nghệ sinh học để làm tăng phẩm chất và hàm lượng chất chính của đối tượng nghiên cứu. Trong bối cảnh cần phát triển nền nông nghiệp bền vững và duy trì cân bằng sinh thái thì việc canh tác sử dụng quá nhiều phân bón hóa học cần phải hạn chế, đồng thời cần chú trọng hơn đến chế phẩm sinh học có thành phần chính là các vi sinh vật hữu hiệu. Ngày nay, qua nhiều nghiên cứu đã và đang thực hiện, vai trò của các vi sinh vật vùng rễ trong việc thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp trong thực vật nói chung và các curcuminoid trong cây nghệ nói riêng đã được xác định và chứng minh. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng Curcuma longa L. nhằm định hướng tăng năng suất và chất lượng củ nghệ”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Mục tiêu của luận án nhằm nghiên cứu và khai thác nguồn vi sinh vật vùng rễ cây nghệ, đặc biệt là các nhóm vi khuẩn và nấm 1
vùng rễ hữu hiệu của cây nghệ vàng C. longa, để tạo cơ sở xaayd ựng hệ thống quản lý dinh dưỡng tổng hợp thích hợp cho cây nghệ trồng tại Việt Nam, giúp nâng cao năng suất và chất lượng củ nghệ một cách an toàn và bền vững. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Nội dung nghiên cứu chính của luận án bao gồm: (i) Nghiên cứu mối liên hệ giữa chế độ bón phân đạm hóa học và năng suất của cây nghệ; (ii) Phân lập và nghiên cứu hoạt tính một số nhóm vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng; (iii) Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi sinh vật vùng rễ và mối liên hệ với chế độ bón phân đạm hóa học cho năng suất cao; (iii) Nghiên cứu tạo chế phẩm và khả năng tập nhiễm một số vi sinh vật trong chế phẩm vào rễ cây nghệ vàng. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Cây nghệ vàng Cucuma longa L. và hợp chất curcumin trong củ nghệ Cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng Zingiberaceae. Các loài thực vật thuộc họ Gừng phân bố chủ yếu ở Nam và Đông Nam Á, đa dạng nhiều nhất ở Ấn Độ và Thái Lan với ít nhất 40 loài, tiếp đó là Bangladesh, Indonesia, Myanma và Việt Nam [38] [39]. Thành phần hóa học của củ nghệ vàng Thành phần hóa học của củ nghệ vàng C. longa có chứa khoảng 6,3-7% protein, 5,1-7,5% chất béo, 3,5-5% khoáng chất, 69,4% carbonhydrate và khoảng 9,5-13,1% nước [43]. Thành phần chất chính của củ nghệ vàng gồm có các curcuminoid và tinh dầu nghệ (gồm các turmerone thơm (ar-turmerone), α-turmerone và β- 2
turmerone). Trong thành phần của các sản phẩm curcumin bán trên thị trường (còn gọi là curcumin mix) có chứa khoảng 77% curcumin tinh sạch (Cur), 17% DMC và 3% BDMC [44]. Kết quả nghiên cứu của Naama và cs. (2013) cho thấy, curcumin và DMC kém bền hơn BDMC [45]. Xét về hoạt tính chống oxy hóa và ức chế khối u thì curcumin là chất có hoạt tính mạnh nhất, tiếp theo là DMC va cuối cùng là BDMC [46] [44]. Hoạt tính sinh y dược học của hoạt chất curcumin trong củ nghệ vàng Tính đến nay đã có rất nhiều công trình liên quan đến hoạt tính sinh học của củ nghệ vàng, kết quả nghiên cứu của các công trình này đã khẳng định tác dụng của củ nghệ vàng nói chung và hoạt chất curcumin trong củ nghệ vàng nói riêng. Chỉ tính đến năm 2011 đã có khoảng 7000 công trình nghiên cứu liên quan đến các hoạt tính sinh học của curcumin, trong đó nổi bật là các hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư. Ngoài ra, hợp chất tự nhiên này còn được phát hiện là có hoạt tính điều biến các phân tử truyền tín hiệu trong cơ thể như các chemokines, cytokines, các gene ức chế khối u, các phân tử kết dính, microRNAs, v.v. [47]. 1.2. Vi sinh vật vùng rễ cộng sinh với cây nghệ vàng Vùng rễ (rhizosphere) được định nghĩa là một vùng nhỏ bao quanh rễ thực vật và chịu ảnh hưởng bởi hoạt động sống của rễ [70] [71] [72]. Trong vùng rễ này, có rất nhiều nhóm VSV có mối quan hệ tương tác với rễ thực vật và với môi trường đất. Các nghiên cứu đã chứng minh khu hệ vi sinh vật vùng rễ (VSVVR) ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật, cũng như khả năng chống chịu các áp lực vô sinh và hữu sinh ảnh hưởng đến quá trình hấp thụ dinh dưỡng vào tế bào thực vật, quá trình trao đổi các tín hiệu hóa học, và tác động tới hoạt tính enzyme trong qua trình trao đổi chất [73] [74]. Chẳng hạn, vi khuẩn PGPR ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp tới 3
nguồn N và P cho thực vật, kích thích sinh trưởng và phát triển, giảm hỗ trợ các VSV gây bệnh và điều chỉnh sức đề kháng của thực vật với các tác động ngoại cảnh [75] [76]. Ở chiều ngược lại, thực vật cũng có thể làm thay đổi khu hệ VSVVR bằng cách điều chỉnh các nguồn vật chất năng lượng và các tín hiệu trong đất. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng có ít nhất 21% lượng carbon được cố định trong quá trình quang hợp của thực vật được vận chuyển vào đất bằng nhiều cách khác nhau, chẳng hạn như các chất tiết thực vật, qua đó làm thay đổi cấu trúc quần xã VSVVR [77]. Ở ngũ cốc, lượng chất đồng hóa sau quá trình quang hợp được vận chuyển khoảng 30-60% xuống đất, trong đó có khoảng 40-90% được xuất theo dạng chất tiết, và các chất này đóng vai trò chính yếu trong mối quan hệ chặt chẽ giữa rễ thực vật và các VSV vùng rễ [78]. Số lượng và cấu trúc của khu hệ VSVVR phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau, như điều kiện nhiệt độ, các đặc tính lý hóa của đất, thành phần và cấu trúc của khu hệ vi sinh vật trong đất tại điểm trồng, các giai đoạn phát triển của thực vật và kiểu gene của thực vật [79]. Từ các kết quả nghiên cứu nêu trên, có thể nhận thấy việc nghiên cứu biện pháp nhằm làm tăng năng suất và chất lượng cây trồng phải gắn với nghiên cứu khu hệ VSVVR thực vật của mỗi đối tượng nhất định. Đối với cây nghệ vàng C. longa, đã có một số nghiên cứu trên hệ VSV cộng sinh thực vật nói chung và vùng rễ nói riêng, đây sẽ là cơ sở để ta đề xuất được những phương thức phát triển năng suất nghệ một cách bền vững và thân thiện với môi trường. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Giống nghệ và mùa vụ 4
Giống nghệ được sử dụng trong nghiên cứu là nghệ Hưng Yên (Curcuma longa var. Hung-yen), được trồng tại xã Đại Tập, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên (20o47’35” N, 105o56’42” E). 2.1.2. Hóa chất, trình tự mồi, môi trường và bộ chủng VSV 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu mẫu và xác định các chỉ số lý hóa của mẫu đất Thu mẫu: Các mẫu vùng rễ (bao gồm đất và phần rễ cây) được lấy ở độ sâu 10-15 cm dưới mặt đất bằng các dụng cụ thu mẫu vô trùng. Sau khi thu, mẫu được giữ trong các túi nilon sạch và được bảo quản ở thùng xốp 4oC cho đến khi tiến hành phân lập VSV. Xác định các chỉ số lý hóa của đất 2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng phân bón N đến năng suất nghệ Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 4-12/2016 và được lặp lại 4-12/2017. Lập 16 ô thí nghiệm tiêu chuẩn, mỗi ô thí nghiệm có diện tích 10 m2, theo 4 chế độ bón: N0, N150, N350 và N500 với phân N thay đổi từ 0 đến 500 kg.ha-1.y-1 kết hợp bón P và K (400:200 kg.ha-1.y-1). Mẫu đất được thu ở độ sâu 10-15 cm, tại 5 điểm thu trong mỗi lô thí nghiệm theo mô hình W-pattern của Thomas (1985) [115]. Xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: Chiều cao cây (cm); Số lượng lá/cây; Năng suất tươi (kg/ha); Hệ số khối lượng khô/khối lượng tươi (%); Hàm lượng các chất curcuminoid. Sau khi xử lý, nghệ khô dạng bột được chiết theo phương pháp chiết siêu âm (35 KHz, 25oC, 15 min) bằng hệ dung môi chiết ethanol/nước (70:30, v/v) theo mô tả của Mandal & cs. (2009) [116]. 5
Hàm lượng curcuminoid trong cặn chiết ethanol được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo Jayaprakasha và cs. (2006) [46]. 2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng phân bón N đến đa dạng khu hệ VSVVR cây nghệ Tách DNA tổng số từ các mẫu đất vùng rễ cây nghệ DNA tổng số được chiết bằng kit PowerSoil® DNA Isolation (Mo Bio Laboratories, Qiagen, Đức) và do nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano drop (Nanodrop 2000c, Thermo Fisher Scientific, USA), điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC. Giải trình tự metagenome amplicons Thư viện giải trình tự amplicons được tạo bằng bộ kit TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation (Illumina, USA) và chất lượng thư viện được đánh giá bằng hệ thống Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, USA) trước khi giải trình tự trên máy Illumina Hiseq 2500 (Illumina, USA). Phân tích tin sinh học Luồng phân tích đa dạng khu hệ VSV vùng rễ cây nghệ được thực hiện nhờ công cụ Qiime2 (https://qiime2.org/) [118]. Quá trình phân tích gồm 3 bước chính, đó là: (i) Tiền xử lý; (ii) Xác định vị trí phân loại; và (iii) Phân tích đa dạng và hiển thị hóa.  Tiền xử lý: Sử dụng công cụ kiểm soát chất lượng của Qiime (V1.7.0, http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html) [146] và thuật toán UCHIME (http://www.drive5.com/usearch/ manual/uchime_algo.html) [148].  Xác định vị trí phân loại: Sử dụng phần mềm Uparse (Uparse v7.0.1001, http://drive5.com/uparse/) [149], sở dữ liệu 6
Unite (https://unite.ut.ee/) [150] và Silva (https://www.arb- silva.de/) [151].  Phân tích đa dạng và hiển thị hóa  Một số chỉ số liên quan đến đa dạng khu hệ VSV Các chỉ số Shannon-Weaver (H), Simpson (D1), Chao1 và chỉ số ACE được xác định với công cụ Qiime 2.  Phân tích thành phần/tọa độ chính Phương pháp phân tích thành phần chính (PCA) và Phân tích tọa độ chính (PCoA) bằng phần mềm R (v 3.1.2, R Core Team 2014).  Đường cong rarefaction  Phân tích thống kê: Sử dụng phân tích phương sai ANOVA và Tukey’s Honest Significant Difference. 2.2.4. Phân lập vi khuẩn PGPR và xác định hoạt tính kích thích sinh trưởng Phân lập vi khuẩn vùng rễ có khả năng hòa tan phosphate vô cơ: Sử dụng phương pháp pha loãng và cấy trải trên đĩa thạch IPA [138]. Xác định khả năng sinh IAA: Sử dụng phương pháp Salkowski cải tiến [139]. Xác định khả năng kháng nấm gây bệnh ở thực vật: Sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch theo Ahmad & cs. (1998) [140]. Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của các PGPR: Các đặc điểm đươc xác định theo khóa phân loại Bergey’s [141, 142]. Xác định tên phân loại dựa trên trình tự đoạn gene 16S rDNA: Trình tự đoạn gene 16S rDNA của các chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi Pr16F-Pr16R và so sánh với các trình tự đã công bằng công cụ BLASTN, phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.0 [144] và MEGA X [145] [146]. 7
2.2.5. Phân lập nấm AM và nghiên cứu đặc tính sinh học Phân lập bào tử nấm AM từ mẫu đất vùng rễ nghệ: Phân lập theo phương pháp lọc ướt được mô tả lần đầu bởi Gerdeman & Nicolson (1963) [147]. Xác định tên phân loại dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA Xác định tên phân loại của các bào tử nấm AM bằng cách khuếch đại vùng gene 18S rRNA bằng cặp mồi NS31 và hỗn hợp mồi AM1, AM2 và AM3 trong phản ứng PCR [148] [149] [150]. Phương pháp biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc tế bào tái tổ hợp mang gene đích được thực hiện dựa trên phương pháp sinh học thường quy. Tách plasmid, kiểm tra các đoạn gene chèn và được sau đó được giải trình tự trên máy ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, Mỹ). 2.2.6. Nghiên cứu tạo và thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật vùng rễ cho cây nghệ Tạo chế phẩm VSV vùng rễ cho cây nghệ  Xác định khả năng gây độc của chủng VSV: Theo phương pháp của Carter và cs. với một chút thay đổi theo điều kiện thí nghiệm [151].  Nhân nuôi nấm AM Nhân nuôi bào tử AM giống trên cây mã đề Ribwort (Plantago lanceolata) (được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học - Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam).  Nhân sinh khối, tạo hỗn hợp vi khuẩn  Thu hồi bào tử, tạo hỗn hợp bào tử nấm rễ  Phối trộn, tạo chế phẩm: Phối trộn hỗn hợp vi khuẩn và hỗn hợp bào tử nấm rễ theo tỉ lệ 1:1 (w/w). Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm VSV vùng rễ cho cây nghệ 8
 Bố trí thí nghiệm Thử nghiệm được tiến hành tại Vườn thuốc Bộ Y tế tại Thanh Trì, Hà Nội từ tháng 5 đến tháng 11 năm 2018. Thí nghiệm thực hiện trên 2 nhóm: (i) Nhóm bổ sung chế phẩm VSV (Kí hiệu: CP) và (ii) Nhóm đối chứng (Kí hiệu: ĐC). Nghệ được trồng ở mỗi nhóm CP và ĐC trên diện tích 12 m2, tổng diện tích khu vực thí nghiệm 30 m2 (bao gồm cả phần diện tích của luống bảo vệ).  Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất Các chỉ tiêu sinh trưởng được theo dõi định kỳ. Năng suất được xác định dựa theo sinh khối tươi tại thời điểm kết thúc thử nghiệm. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện thổ nhƣỡng và ảnh hƣởng của chế độ bón phân đạm hóa học đến năng suất cây nghệ Khảo sát các chỉ số môi trường của đất trồng nghệ Các chỉ số thu được giai đoạn trước khi trồng nghệ được xác định bằng các phương pháp tiêu chuẩn theo TCVN 7373:2004, 7374:2004, 7375:2004. Có thể nhận thấy, đất trồng nghệ có các chỉ số về hàm lượng N, P, K tương ứng với chỉ số của đất phù sa, chất lượng đất tương đối tốt, phù hợp canh tác nhiều loại cây trồng. Xác định năng suất nghệ theo chế độ bón phân N Năng suất củ nghệ sau thu hoạch tại mỗi chế độ dinh dưỡng được xác định sau khi thu hoạch như sau: Chế độ N0: 21038 ± 5013 kg/ha/năm; Chế độ N150: 27003 ± 4703 kg/ha/năm; Chế độ N350: 30902 ± 1642 kg/ha/năm; Chế độ N500: 20578 ± 2306 kg/ha/năm. 9
Từ kết quả đạt được có thể nhận thấy, khối lượng củ nghệ thu được (kg/ha) ở lô thí nghiệm với chế độ N0 và chế độ N500 là thấp nhất. Điều này cho thấy rằng, chế độ bón phân N ở mức quá thấp hoặc quá cao đều ảnh hưởng không tốt đến năng suất của củ nghệ sau thu hoạch. Chế độ canh tác với mức độ bón phân đạm từ 150 đến 350 kg/ha cho năng suất củ nghệ tươi sau thu hoạch cao hơn đáng kể. Hình 3. 1. Năng suất và hàm lượng curcuminoid tổng trong củ nghệ của các chế độ canh tác nghệ. Xác định năng suất curcumin theo chế độ bón phân N Từ dữ liệu hàm lượng các chất curcuminoid trong nguyên liệu mẫu khô theo khối, năng suất curcumin của mỗi chế độ canh tác đã được xác định. Kết quả cho thấy, năng suất curcumin cao nhất thu được tại lô thí nghiệm có áp dụng chế độ canh tác N150. Hình 3.1 tổng hợp các kết quả liên quan đến năng suất củ nghệ tươi và hàm lượng curcumin đạt được của mỗi chế độ bón phân. Với lượng phân đạm từ 150 đến 350 kg/ha/năm thì năng suất củ nghệ và hàm lượng curcuminoid đều ở mức cao hơn so với khi không bón (N0) và bón quá nhiều phân đạm (N500). Trong các thập kỷ gần đây, những nghiên cứu liên quan đến ảnh hưởng của N, P và K tới năng suất nghệ và hàm lượng curcumin 10
đã được khá nhiều tác giả thực hiện, tuy nhiên các kết quả nghiên cứu vẫn chưa đồng nhất và còn tồn tại những quan điểm trái ngược. Kết quả đạt được trong khảo sát này có ý nghĩa bổ sung và khẳng định cho luận điểm về tác dụng của phân bón N đến năng suất và hàm lượng curcumin trong củ nghệ vàng C. longa mà các nghiên cứu trên thế giới đã đề cập tới. Mặt khác, kết quả nghiên cứu đã đưa ra những số liệu đánh giá đầu tiên về tác dụng của phân bón hóa học đến năng suất của nghệ vàng ở Việt Nam. 3.2. Khảo sát một số nhóm vi sinh vật hữu hiệu trong vùng rễ cây nghệ Dựa trên các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến khu hệ VSVVR cộng sinh với cây nghệ vàng C. longa, chúng tôi đã thực hiện khảo sát sự có mặt của các VSV thuộc hai nhóm chủ yếu là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) và nấm rễ cộng sinh (AM) trong vùng rễ cây nghệ vàng tại vùng chuyên canh nghệ, qua đó định hướng tuyển chọn một số đối tượng tiềm năng để đề xuất chế phẩm sinh học làm tăng năng suất cây trồng. 3.2.1. Khảo sát vi khuẩn rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) trong vùng rễ cây nghệ 3.2.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn PGPR Dựa trên các đặc tính cơ bản của PGPR bao gồm: Khả năng tạo các chất kích thích sinh trưởng thực vật (phytohormones); Khả năng cố định đạm; Khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh; Khả năng hòa tan phosphate và các chất dinh dưỡng khó tan [156] [157] [76], nghiên cứu đã được tiến hành nhằm phân lập các chủng vi khuẩn từ vùng rễ cây nghệ theo trình tự các tiêu chí: (i) Hòa tan phosphate vô cơ; (ii) Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA; (iii) Khả năng cố định đạm và (iv) Khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh. Kết quả sàng lọc những đặc tính trên cho các 11
chủng VSV từ các mẫu đất vùng rễ cây nghệ được thể hiện tại Bảng 3.6. Bảng 3. 6. Khả năng hòa tan phosphate, phát triển trên môi trường không chứa đạm và sinh tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn. Hòa tan Khả năng phát Khả năng sinh T Ký hiệu phosphate vô cơ triển trên môi tổng hợp IAA T chủng (D-d, mm)* trƣờng không đạm (ppm) 1 PGP-V2 3 + 24,80±2,21 2 PGP-V4 5 - 9,66±1,72 3 PGP-V5 3 + 67,51±2,11 4 PGP-V15 5 + 35,47±3,05 5 PGP-V18 3 + 26,82±1,46 6 PGP-V20 4 + 77,87±2,78 7 PGP-V21 6 + 63,11±2,09 8 PGP-V22 4 + 11,61±1,85 9 PGP-V24 4 - 45,81±2,89 *Ghi chú: D: đường kính vòng phân giải cơ chất xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn; d: đường kính khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch. Để tìm hiểu thêm về tác động kích thích gián tiếp của các chủng vi khuẩn PGPR lựa chọn, chúng tôi thực hiện xác định khả năng kháng nấm bệnh thực vật in vitro dựa trên sự ức chế sự hình thành sợi nấm A. niger và F. oxysporum trên đĩa thạch. Kết quả thử nghiệm cho thấy, trong số các chủng thử nghiệm, Bacillus sp. PGP- V21 là chủng vi khuẩn duy nhất biểu hiện hoạt tính kháng cả hai chủng nấm kiểm định (thuộc A. niger và F. oxysporum) với đường kính vòng phân giải lần lượt là 9 và 3 mm. Từ các kết quả nghiên cứu có thể thấy, PGP-V5, PGP-V20 và PGP-V21 là các chủng biểu hiện đặc điểm kích thích sinh trưởng thực vật tiêu biểu, bao gồm khả năng hòa tan P vô cơ, cố định đạm, sinh IAA với lượng lớn nhất, vì vậy được lựa chọn để tiếp tục khảo sát một số đặc điểm phân loại học, bao gồm đặc điểm hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phân tích trình tự đoạn gene đặc trưng (gene 16S rRNA). 12
3.2.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại học của các chủng vi khuẩn lựa chọn Hình 3.2. Cây phân loại của các chủng PGP-V5, PGP-V20, PGP- V21 và một số chủng vi sinh vật đã biết dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA đã công bố (Phương pháp maximum likelihood, 100 bootstrap replicates, consensus tree). Nhóm ngoài là chủng Methylobacterium populi AP014809. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch chứa môi trường LB của các chủng vi khuẩn được xác định dựa trên quan sát bằng mắt thường. Đặc điểm hình thái hiển vi và kích thước tế bào vi khuẩn được xác định được bằng quan sát dưới kính hiển vi Olympus (Japan) với độ phóng đại x1000. Đối chiếu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa với khóa phân loại Bergey’s [141] [142], đã xác định được PGP-V5 là chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus spp. 3, PGP-V20 thuộc nhóm Enterobacteriaceae 2, PGP-V21 là vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus spp. 1. Dựa trên các kết quả tìm kiếm được trên 13
ngân hàng gen, kết hợp với phân tích trình tự đã xây dựng được cây phân loại của các chủng PGP-V5, PGP-V20 và PGP-V21 (Hình 3.3). Kết hợp với các đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh đã có và khóa phân loại của Bergey đã xác định được các chủng lựa chọn là Bacillus sp. PGP-V5, Enterobacter sp. V20 và Bacillus sp. V21. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sàng lọc được một số chủng PGPR có tiềm năng ứng dụng cao từ cây nghệ vàng tại vùng chuyên canh. Đây là những kết quả nghiên cứu mới và lần đầu tiên công bố trên đối tượng cây nghệ vàng C. longa tại Việt Nam. 3.2.2. Khảo sát nấm AM trong vùng rễ cây nghệ 3.2.2.1. Phân lập và khảo sát số lượng bào tử nấm AM từ mẫu đất vùng rễ cây nghệ Bên cạnh nhóm vi khuẩn PGPR, sự cộng sinh giữa nấm AM với cây nghệ vàng C. longa đã được một số tác giả trên thế giới đề cập tới, đặc biệt là nghiên cứu thực hiện với các giống nghệ vàng của Ấn Độ [160] [161], tuy nhiên đến nay chưa có bất kỳ một nghiên cứu tương tự nào thực hiện trên đối tượng nghệ bản địa của Việt Nam. Bằng phương pháp gạn và lọc ướt [147], sự hiện diện của bào tử nấm AM trong tất cả các mẫu đất vùng rễ cây nghệ vàng tại vùng nghiên cứu ở 3 thời điểm (cây 2, 5 và 8 tháng tuổi) đã được xác định. Kết quả cho thấy, số lượng các bào tử thu được tại 2 điểm phân lập thuộc khu vực nghiên cứu thay đổi trong khoảng từ 23,6±5,5 đến 45,1±6,2 bào tử/100 g đất ở thời điểm cây 2 tháng tuổi, và từ 40,3±8,2 đến 66,5±7,5 bào tử/100 g ở thời điểm cây 8 tháng tuổi. 3.2.2.2. Đặc điểm hình thái và phân loại học của một số chủng nấm AM trong đất vùng rễ cây nghệ Dựa trên tần xuất xuất hiện của các bào tử nấm AM, chúng tôi đã lựa chọn được 3 nhóm bào tử nấm điển hình từ các rây lọc 14
kích thước khác nhau, để tiến hành tách bào tử, lưu giữ và nhân nuôi. Qua phân loại sơ bộ xác định được AM-N1, AM-N2 và AM-N3 là các bào tử nấm thuộc chi Glomus. Hình 3. 5. Cây phân loại của các chủng AM-N1, AM-N2 và AM- N3 và một số chủng vi sinh vật đã biết dựa trên trình tự đoạn gene 18S rRNA đã công bố (Phương pháp maximum likelihood, 100 bootstrap replicates). Nhóm ngoài là chủng Gigaspora margarita BEG152. Để xác định vị trí phân loại của 3 chủng nấm AM trên, chúng tôi tiến hành tách DNA và thực hiện phương pháp Nested- PCR. Kết quả định danh trên cho thấy các mẫu AM đều có mức độ tương đồng so với các loài trên ngân hàng gene từ 86% trở lên, trong đó phần lớn đều thuộc chi Glomus. Dựa trên các kết quả tìm kiếm được, kết hợp với phân tích Maximum likelihood đã xây dựng được cây phân loại của các chủng AM-N1, AM-N2 và AM-N3 (Hình 3.5). 15
Kết hợp với các đặc điểm hình thái, đã xác định được các chủng nấm AM là Glomus sp. AM-N1, Glomus intraradices AM-N2 và Glomus mosseae AM-N3. 3.3. Nghiên cứu tác đọng của chế độ bón phân N đến đa dạng khu hệ vi sinh vật vùng rễ 3.3.1. Đánh giá đa dạng khu hệ vi khuẩn đất vùng rễ cây nghệ liên quan đến chế độ bón phân N 3.3.1.1. Phân tích các chỉ số đa dạng của khu hệ vi khuẩn vùng rễ cây nghệ OTU trong vùng đất rễ cây nghệ tại 4 chế độ bón phân đạm (N0, N150, N350 và N500) được phân tích bằng phần mềm Uparse, cơ sở dữ liệu Unite và thuật toán Blast, kết hợp phần mềm Qiime. Số lượng loài nấm trung bình trong các mẫu DNA tổng số của chế độ N0, N150, N350 và N500 lần lượt là 3105, 2286, 2760 và 2843 loài (Bảng 3.16). Bảng 3. 1. Kết quả phân tích phân loại học dữ liệu giải trình tự metagenome 16S và các chỉ số đa dạng. Tên mẫu N0 (n=3) N150 (n=3) N350 (n=3) N500 (n=3) Số lượng loài 3105 2286 2760 2843 trung bình 0,665 ± Chỉ số Simpson 0,703 ± 0,11 0,712 ± 0,10 0,733 ± 0,12 0,08 Chỉ số ACE 2012 ± 354 1893 ± 196 2068 ± 244 1992 ± 259 Chỉ số Chao1 1765 ± 103 1994 ± 262 1549 ± 306 1266 ± 220 Chỉ số Shannon- 3,77 ± 0,50 2,95 ± 0,25 4,04 ± 0,71 3,73 ± 0,56 Weaver Phân tích tọa độ chính (PCoA) dựa trên các chỉ số đa dạng sinh học (Hình 3.10) cho phép phân tách hai nhóm L (màu xanh) và H (màu đỏ). Nói cách khác, có sự khác biệt giữa các quần xã vi khuẩn từ nhóm năng suất cao H (N150 và N350) và nhóm năng suất thấp L (N0, N500). 16
3.3.1.2. Thành phần phân loài của các quần xã vi khuẩn vùng rễ cây nghệ Kết quả phân tích cho thấy thành phần phân loài vi khuẩn ở mức độ ngành và lớp của các mẫu đất vùng rễ cây nghệ thuộc các nhóm L và H tương đối đồng đều. Trong đó, đáng kể có lớp Alphaproteobacteria thuộc ngành Proteobacteria ở cả hai nhóm đều chiếm trên 40% tổng số OTU xác định được (p
65% số OTU vi nấm thuộc Basidiomycota, và khoảng 1-12% số OTU còn lại thuộc các ngành Mortierellomycota, Glomeromycota và Chytridiomycota. Các kết quả đạt được từ đây đã giúp đưa ra một số dự đoán về xu hướng biến động của các nhóm vi sinh vật trong đất dưới ảnh hưởng của điều kiện canh tác (lượng phân bón N) biến đổi và những gợi ý về mối liên quan giữa cấu trúc, thành phần của khu hệ vi sinh vật đất vùng rễ với năng suất và chất lượng cây trồng nói chung và cây nghệ vàng nói riêng. 3.3.2. Đánh giá đa dạng khu hệ nấm đất vùng rễ cây nghệ liên quan đến chế độ bón phân N 3.3.2.1. Phân tích các chỉ số đa dạng của khu hệ nấm vùng rễ Thành phần khu hệ nấm trong vùng đất rễ cây nghệ tại 4 chế độ bón phân đạm (N0, N150, N350 và N500) được xác định bằng cách phân tích trình tự của các đoạn ITS khuếch đại từ mẫu DNA tổng số tương ứng. Sau khi phân tích trình tự bằng phần mềm Uparse, so sánh với cơ sở dữ liệu Unite dựa trên thuật toán BLAST và phần mềm Qiime, các OTU trong mẫu nghiên cứu được xác định. Bảng 3. 2. Kết quả phân tích phân loại học dữ liệu giải trình tự metagenome ITS và các chỉ số đa dạng. Tên mẫu N0 (n=3) N150 (n=3) N350 (n=3) N500 (n=3) Số lượng loài 736 588 718 688 trung bình Chỉ số Simpson 0,927 ± 0,21 0,749 ± 0,09 0,823 ± 0,11 0,833 ± 0,16 Chỉ số ACE 770 ± 113 623 ± 91 755 ± 106 783 ± 75 Chỉ số Chao1 761 ± 83 645 ± 136 754 ± 98 788 ± 177 Chỉ số Shannon- 5,76 ± 0,3 4,05 ± 0,70 4,43 ± 0,52 4,85 ± 0,48 Weaver Phân tích thành phần chính (PCA) phân nhóm các mẫu đất vùng rễ theo năng suất cho thấy sự khác biệt giữa các mẫu từ nhóm năng suất cao H (N150 và N350) và nhóm năng suất thấp L (N0, N500). Kết quả này cho thấy, hàm lượng phân bón N cung cấp cho 18