Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Xác định một số yếu tố độc lực của enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo con ở Đồng bằng sông Cửu Long

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

86
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu luận án nhằm xác định sự phân bố của các yếu tố độc lực, đặc tính kháng kháng sinh của các chủng ETEC phân lập từ heo con ở một số tỉnh/thành thuộc ĐBSCL; phân tích một số đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC mang kháng nguyên F4 và F18.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Xác định một số yếu tố độc lực của enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo con ở Đồng bằng sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ HẠNH CHI XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI (ETEC) GÂY TIÊU CHẢY TRÊN HEO CON Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ HẠNH CHI XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI (ETEC) GÂY TIÊU CHẢY TRÊN HEO CON Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hà Thanh Toàn PGS.TS. Lý Thị Liên Khai 2015
Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hà Thanh Toàn PGS.TS. Lý Thị Liên Khai Phản biện 1:…………………………………………………… Phản biện 2:…………………………………………………… Phản biện 3:…………………………………………………… Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại……………………………………………………… Vào……giờ…….., ngày……tháng……..năm………. Có thể tìm luận án tại: 1. Thư viện Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ 2. Trung tâm học liệu trường Đại học Cần Thơ 3. Thư viện Quốc gia
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN 1.1 Giới thiệu Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) là một trong những nguyên nhân phổ biến gây bệnh tiêu chảy cho heo con theo mẹ và sau cai sữa, do 2 yếu tố độc lực chính là kháng nguyên bám dính và độc tố ruột (Nagy and Fekete, 1999, Gyles and Fairbrother, 2010). Phần lớn những nghiên cứu về E. coli ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chỉ dừng ở việc thực hiện phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên O và kháng nguyên F, hoặc một số loại độc tố. Trong khi các nghiên cứu trong và ngoài nước trong thời gian qua cho thấy sự phân bố và đặc điểm của E. coli gây bệnh nói chung và ETEC nói riêng luôn thay đổi theo từng vùng địa lý, thời gian lấy mẫu và trên những đàn khác nhau. Bên cạnh đó, người chăn nuôi sử dụng kháng sinh để phòng và điều trị bệnh cho vật nuôi đã tạo nên những chủng đa kháng với kháng sinh. Những chủng này không những gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng, mà còn ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh sau này. Vì vậy, nghiên cứu này giúp phát hiện các chủng ETEC gây bệnh trên heo con, sự đề kháng và khả năng mang gene kháng kháng sinh của chúng, nhằm bảo vệ vật nuôi, nâng cao năng suất và chất lượng thịt theo yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về súc sản phẩm như là thịt sạch, an toàn và chất lượng để bảo vệ sức khỏe cho con người. Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu “Xác định một số yếu tố độc lực của enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo con ở Đồng bằng sông Cửu Long” được tiến hành. 1.2 Mục tiêu Xác định sự phân bố của các yếu tố độc lực, đặc tính kháng kháng sinh của các chủng ETEC phân lập từ heo con ở một số tỉnh/thành thuộc ĐBSCL; phân tích một số đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC mang kháng nguyên F4 và F18. 1.3 Ý nghĩa của luận án Luận án là công trình nghiên cứu một cách có hệ thống về một số gene độc lực của các chủng ETEC từ heo khỏe, heo tiêu chảy, môi trường chăn nuôi, đánh giá sự phân bố của các gene mã hóa độc lực theo địa phương, theo nhóm tuổi của heo con. Kết quả đề kháng và nhạy cảm với kháng sinh của các chủng ETEC để giúp cán bộ thú y chọn những loại kháng sinh điều trị có hiệu lực cao cho từng địa phương. 1
Kết quả nghiên cứu này là cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo về các biến thể của kháng nguyên bám dính F4 và F18 để chọn những chủng ETEC mang kháng nguyên thích hợp cho việc sản xuất vaccine phòng bệnh do ETEC gây ra ở heo con tại khu vực ĐBSCL, đồng thời có giá trị góp phần bổ sung kiến thức thực tế, tư liệu khoa học dùng cho nghiên cứu và giảng dạy môn Vi sinh vật học Thú y, Bệnh truyền nhiễm, Miễn dịch học trong các trường Đại học Nông nghiệp. 1.4 Những điểm mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định chính xác sự hiện diện của các gene mã hóa kháng nguyên bám dính (F4, F5, F6, F18, Intimin, AIDA-I), độc tố ruột (LT, STa, STb, EAST1) và gene mã hóa khả năng kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy heo con theo mẹ và heo sau cai sữa ở khu vực ĐBSCL. Vì vậy, kết quả nghiên cứu này làm cơ sở để xác định vai trò của ETEC gây tiêu chảy ở heo con và hiệu quả phòng chống bệnh tại khu vực này. Kết quả của luận án cung cấp thông tin khoa học về sự phân bố những gene liên quan đến các độc lực và đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC phân lập từ các trại chăn nuôi heo ở khu vực ĐBSCL. Phân tích mức độ tương đồng gene faeG, fedA và quan hệ di truyền của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo ở ĐBSCL. Bố cục của luận án Luận án gồm 147 trang (không kể phần phụ lục), chia thành các phần như sau: Chương 1: Tổng quan về luận án (3 trang); Chương 2: Tổng quan tài liệu (32 trang); Chương 3: Nội dung và và phương pháp nghiên cứu (20 trang); Chương 4: Kết quả và thảo luận (76 trang); Chương 5: Kết luận và đề xuất (2 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang). Luận án có 40 bảng, 45 hình. Tổng tài liệu tham khảo là 182, gồm 25 tài liệu tiếng Việt, 153 tài liệu tiếng Anh và 4 tài liệu tham khảo từ trang Web. Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn Escherichia coli Vi khuẩn E. coli được Theodore Escherich - người Đức mô tả lần đầu tiên vào năm 1885 và sau đó được xem là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật (Levine, 1987). Đây là vi khuẩn thường trú trong đường tiêu hóa của động vật và người. Vi khuẩn E. coli có thể gây bệnh cho gia súc mọi lứa tuổi, đặc biệt là gia súc sơ sinh (Hirsh, 2004). 2.1.1 Đặc điểm hình thái 2
E. coli là trực khuẩn đường ruột, Gram âm, là những vi khuẩn hình que nhỏ, kích thước dài ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, đường kính khoảng 1 µm. Không hình thành bào tử, tạo giáp mô mỏng, có lông quanh cơ thể. Khuẩn lạc trên môi trường đặc phát triển hoàn toàn sau 1 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc có nhiều dạng khác nhau từ nhẵn, nhăn nheo có bìa tròn, hoặc nhăn nheo hoặc nhầy. Một vài chủng có khả năng gây dung huyết (Fairbrother and Gyles, 2006). 2.1.2 Đặc tính nuôi cấy E. coli thuộc loại trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 37oC, pH thích hợp là 7,2-7,4. Chúng mọc dễ dàng trong MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue (EMB), có khả năng sản sinh dung huyết α và β (Quinn et al., 2004). 2.1.3 Đặc tính sinh hóa Kết quả kiểm tra Indole và Methyl Red (MR) của E. coli là dương tính, nhưng Voges Proskauer (VP) và Citrate thì âm tính, hoàn nguyên nitrate thành nitrite, không sử dụng ure. Trên môi trường Kligler Iron Agar (KIA): E. coli lên men đường glucose và lactose, phần thạch nghiêng và thạch đứng đều chuyển sang màu vàng, làm nứt thạch; ngoài ra không sinh H2S, (Quinn et al., 2004). 2.2 Phân loại vi khuẩn E. coli gây bệnh Vi khuẩn E. coli thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Hirsh, 2004). E. coli gây bệnh được chia hai nhóm: E. coli gây bệnh đường ruột và E. coli gây bệnh ngoài đường ruột. Trước đây, E. coli gây bệnh đường ruột được chia thành 6 phân nhóm dựa trên khả năng gây bệnh của chúng: Enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC) và diffusely adherent E. coli (DAEC) (Kaper et al., 2004). Gần đây, đã xuất hiện thêm hai phân nhóm mới, đó là adherent invasive E. coli (AIEC) được cho là có liên quan với bệnh Crohn, nhưng không gây ra tiêu chảy và shiga toxin (Stx) producing enteroaggregative E. coli (STEC) gây ổ dịch E. coli ở Đức vào năm 2011 (Clements et al., 2012). 2.3 Giới thiệu về ETEC ở heo ETEC xâm nhập vào động vật bằng đường tiêu hóa, và khi hiện diện đủ số lượng, bám vào các thụ thể trên biểu mô ruột non hoặc trong lớp biểu mô phủ chất nhầy, sau đó phát triển nhanh chóng để đạt được số lượng lớn khoảng 109 vi khuẩn/ gram trong đoạn giữa không tràng đến hồi tràng. ETEC bám chặt với các biểu mô sản xuất độc tố ruột, kích thích sự bài xuất 3
quá mức nước và chất điện giải vào trong lòng ruột. Kết quả dẫn đến tiêu chảy nếu các chất lỏng dư thừa từ ruột non xuống không được hấp thụ lại trong ruột già. ETEC là nguyên nhân tiêu chảy nghiêm trọng, có thể dẫn đến mất nước, mệt mỏi, chuyển hóa nhiễm acid, và có thể gây chết (Gyles and Fairbrother, 2010). 2.4 Các yếu tố độc lực của ETEC Những nghiên cứu gần đây cho rằng các yếu tố bám dính do ETEC sinh ra ở heo là K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F41 và F18. Ngoài ra các nhà khoa học còn phát hiện thêm một loại bám dính khác (AIDA-I) trong các chủng ETEC hoặc VTEC có mang kháng nguyên bám dính F18 (Mainil et al., 2002, Ngeleka et al., 2003). Sau khi bám vào các thụ thể trên tế bào biểu mô ruột, các chủng ETEC sản xuất độc tố đường ruột, có thể là độc tố chịu nhiệt (STa, STb hoặc EAST1) hoặc độc tố kém chịu nhiệt (LT). (Gyles and Fairbrother, 2010). Những chủng ETEC dương tính với F4 là chủng phổ biến nhất ở heo con theo mẹ bị tiêu chảy, chúng sản xuất độc tố ruột LT và STb, những chủng dương tính với F5, F6 hoặc F41 sản xuất chủ yếu STa, và một vài chủng sản sinh STb, những chủng này gây bệnh tiêu chảy chủ yếu trên heo từ 0 - 6 ngày tuổi, ở heo lớn hơn chiếm tỷ lệ thấp (Fairbrother and Gyles, 2006). Ngoài ra các chủng ETEC phân lập từ heo sơ sinh hoặc cai sữa bị tiêu chảy có chứa độc tố STb hay STb: EAST1 cũng có thể dương tính với AIDA-I (Ngeleka et al., 2003). Kháng nguyên bám dính F4 và F18 chiếm tỷ lệ cao nhất và đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh ở heo con (Frydendahl, 2002; Zhang et al., 2007). 2.5 Tính kháng kháng sinh E. coli có khả năng kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh, đặc biệt đối với các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong thức ăn chăn nuôi và điều trị bệnh gia súc (Ahmed et al., 2009). Gần đây, những chủng E. coli có tính đa kháng với nhiều loại kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt với những kháng sinh thường sử dụng hiện nay thuộc họ β-lactam, cephalosporin và các quinolones thế hệ mới (Văn Bích và ctv., 2009). Sự kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu là do gene nằm trên plasmid qui định. Nhờ các gene kháng thuốc này mà vi khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh. Sự đề kháng rất bền vững và được truyền sang thế hệ sau qua quá trình di truyền (Kenneth, 2012). 2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước về ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo con 4
Các nghiên cứu trong nước như Cù Hữu Phú và ctv. (2003), Hồ Soái và Đinh Thị Bích Lân (2005), Trương Quang (2005), Trịnh Quang Tuyên (2006), Đỗ Ngọc Thúy và ctv. (2008) Võ Thành Thìn (2012) và ngoài nước như Frydendahl (2002), Vũ Khắc Hùng và Pilipcinec (2003), Wang et al. (2006), Zhang et al. (2007), Lee et al. (2008) và Chae et al. (2012) trong thời gian qua cho thấy sự phân bố và đặc điểm của E. coli gây bệnh đường ruột nói chung và ETEC nói riêng luôn thay đổi theo thời gian và vùng địa lý. Sự thay đổi này có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của các biện pháp phòng chống bệnh cho đàn heo ở các vùng địa lý-kinh tế khác nhau. Riêng ở khu vực ĐBSCL, E. coli được xác định là một trong số các nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy thường xảy ra trên heo con theo mẹ và sau cai sữa (Lý Thị Liên Khai, 2001). Chỉ có 3 nghiên cứu chuyên sâu về E. coli gây bệnh trên heo con ở ĐBSCL của Nguyễn Khả Ngự và Lê Văn Tạo (1996); Lý Thị Liên Khai (2001), Bùi Trung Trực và ctv. (2004) là rất ít ỏi so với các khu vực chăn nuôi heo khác ở trong nước. Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe, heo tiêu chảy và môi trường Phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli từ phân heo khỏe, heo tiêu chảy và môi trường. Định danh các chủng ETEC bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. 3.1.2 Xác định các yếu tố độc lực của ETEC Xác định sự hiện diện một số gene mã hóa kháng nguyên bám dính F4, F5, F6, F18, Intimin và AIDA-I. Xác định sự hiện diện một số gene mã hóa độc tố STa, STb, LT và EAST1. Thí nghiệm trên động vật thí nghiệm trên chuột và trên heo sau cai sữa. 3.1.3 Xác định đặc tính đề kháng kháng sinh của ETEC Xác định sự kháng kháng sinh của ETEC Xác định gene kháng kháng sinh 3.1.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của một số chủng ETEC Phân tích trình tự nucleotide gene faeG và fedA mã hóa tiểu phân tử FaeG, FedA của kháng nguyên bám dính F4 và F18 Xác định quan hệ di truyền của các chủng F4 và F18 của ETEC 5
3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm lấy mẫu: các nông hộ/ trang trại ở 6 tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL (An Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long và Thành phố Cần Thơ). Phòng thí nghiệm: (1) phòng thí nghiệm Vi khuẩn học, Bộ môn Thú y, Đại học Nông nghiệp và Kỹ thuật Tokyo, Nhật Bản; (2) Phòng thí nghiệm Vệ sinh Thực phẩm, Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ; (3) Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ; (4) Công ty Macrogen, Hàn Quốc. Thời gian nghiên cứu: 12/2011 – 7/2014 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe, heo con tiêu chảy và môi trường 3.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: Từ tháng 11/2011 đến 12/ 2013, mẫu phân được thu thập từ heo theo mẹ và sau cai sữa mắc bệnh tiêu chảy, mẫu phân heo khỏe và mẫu môi trường. 3.3.1.2 Phương pháp a) Điều tra về hiện trạng nuôi và tình hình bệnh trên heo con Các nội dung cần thu thập khi điều tra được ghi nhận theo phiếu điều tra. b) Lấy mẫu Tổng số mẫu phân thu thập là 2.011, trong đó có 1.272 mẫu từ heo tiêu chảy, 199 mẫu heo khỏe và 540 mẫu môi trường. Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng xoay nhẹ hướng về biểu mô niêm mạc trực tràng heo bị tiêu chảy nghi do E. coli, cho tăm bông có mẫu phân vào lọ vô trùng có chứa môi trường vận chuyển là cary-blair, bảo quản lạnh vận chuyển về phòng thí nghiệm. Số mẫu từ phân tiêu chảy được tiến hành lấy 2-3 mẫu/ đàn và mỗi trại lấy 3-5 đàn. Riêng mẫu phân heo khỏe chỉ lấy 1 mẫu đại diện/ trại. Mẫu môi trường Mẫu nước uống: ở mỗi trại/ hộ dân có heo con tiêu chảy, rửa sạch núm uống và bỏ những giọt nước đầu tiên đi, dùng bọc nilon vô trùng lấy 1.000 ml, bảo quản lạnh 4-8oC đem về phòng thí nghiệm phân lập trong ngày. Mẫu nền ổ úm/ sàn chuồng: dùng tăm bông vô trùng quét nhẹ lên nền chuồng, chổ khô ráo, không dính phân, cho tăm bông vào môi trường chuyên chở, bảo quản lạnh. 6
c) Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn E. coli Nuôi cấy và phân lập E. coli dựa theo quy trình của Barrow and Feltham (2003). Đặc tính sinh hóa của E. coli trên môi trường KIA và các xét nghiệm IMViC (Quin et al., 2004; Gyles and Fairbrother, 2010). d) Định danh các chủng ETEC bằng phản ứng huyết thanh học Chọn 1.141 chủng phân lập được từ 1.141 mẫu phân heo tiêu chảy; 197 chủng từ phân heo khỏe và 220 chủng từ môi trường. Phản ứng ngưng kết tìm chủng F4 (K88), F5 (K99) và F6 (987P) theo Moon et al. (1976) và Moon et al. (1977). 3.3.2 Xác định gene mã hóa các yếu tố độc lực của ETEC 3.3.2.1 Xác định các gene mã hóa một số kháng nguyên bám dính (F4, F5, F6, F18, Intimin, AIDA-I) và độc tố ruột (STa, STb, LT, EAST1) của vi khuẩn ETEC 390 chủng ETEC dương tính với phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính được chọn để tiến hành phản ứng PCR, gồm có 330 chủng từ phân heo con tiêu chảy, 14 chủng từ heo khỏe và 46 chủng từ môi trường được thu thập từ 6 tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL. Ly trích DNA mẫu bằng phương pháp đun sôi (Costa et al., 2010). Gene mã hóa cho các loại kháng nguyên bám dính và độc tố của vi khuẩn ETEC được xác định bằng phản ứng PCR. PCR phát hiện gene faeG, fanA, fasA, fedA, eaeA, aidA-I mã hóa kháng nguyên bám dính lần lượt là F4, F5, F6, F18, Intimin và AIDA-I; các độc tố LT, STa, STb và EAST1 được mã hóa bởi các gene elt, estA, estB và astA. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định các yếu tố bám dính và độc tố của ETEC dựa theo Boerlin et al. (2005), Ojeniyi et al. (1994), Frank et al. (1998); Fagan et al. (1999) và Vu-Khac et al. (2007). Tổng thể tích các thành phần trong phản ứng PCR là 25 µl, các hóa chất được sử dụng do công ty Promega (Mỹ) sản xuất. 3.3.2.2 Thử nghiệm trên động vật thí nghiệm a) Kiểm tra độc lực của các chủng ETEC trên chuột bạch theo phương pháp của Picard et al. (1999). b) Kiểm tra độc lực của các chủng ETEC qua tiêm truyền cho heo Sử dụng những chủng F4 và F18 gây bệnh trên chuột để kiểm tra độc lực trên heo sau cai sữa, những heo này được kiểm tra không mang kháng thể kháng F4 và F18 bằng phương pháp ELISA gián tiếp theo Verdonck et al. (2002). Tiêm truyền và theo dõi heo thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Verdonck et al. (2002) 3.3.3 Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng ETEC 7
3.3.3.1 Xác định khả năng kháng kháng sinh của ETEC Khả năng nhạy cảm và kháng kháng sinh của 215 chủng vi khuẩn ETEC được xác định bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch như mô tả của Bauer et al. (1966). Kết quả được đánh giá theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institude (CLSI, 2012). 3.3.3.2 Phát hiện sự hiện diện các gene kháng thuốc của các chủng ETEC bằng phương pháp PCR Quy trình ly trích DNA mẫu, bộ Kit sử dụng trong phản ứng PCR và phân tích sản phẩm PCR được thực hiện như mô tả ở mục 3.3.2.1. Đoạn mồi dựa theo Maynard et al., 2003; Boerlin et al., 2005; Robicsek et al., 2006; Amed et al., 2007b và Võ Thành Thìn, 2012. Những chủng ETEC đề kháng với các kháng sinh nhóm β. lactam được xác định qua phát hiện các gene blaTEM, blaSHV, blaCMY; nhóm aminoglycosid là gene aph(3′)-Ia (aphA1), aph(3′)-IIa (aphA2), aac(3)-IV và aadA; nhóm tetracycline là gene tetA, tetB và, tetC; nhóm phenicol là gene floR; nhóm sulfonamides là gene sulII; nhóm trimethoprim dhfrV; nhóm quinolones là gene qnrA, qnrB và qnrS. 3.3.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC Sử dụng phương pháp BLAST N để tìm sự tương đồng giữa các trình tự 16S rRNA của các chủng vi khuẩn phân lập được với trình tự 16S rRNA đã được đăng tải trên GenBank. Tất cả các trình tự 16S rRNA của các dòng vi khuẩn phân lập cũng như các trình tự 16S rRNA tham khảo từ GenBank sẽ được so sánh cặp với nhau (multi-aligned) bằng CLUSTALW 1.6. Cây phát sinh loài (No Bootstrap NJ tree) được xây dựng dựa trên khoảng cách tiến hóa bằng phần mềm phân tích MEGA5 (Molecular Evolutionary Gentics Analysis, Tamura et al., 2011). 3.4. Thống kê và xử lý số liệu Các số liệu thu thập sẽ được nhập và xử lý bằng phần mềm Excel. Xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0 và phần mềm Microsoft office Excel 2003. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli 4.1.1 Phân lập 4.1.1.1 Phân lập vi khuẩn E. coli 8
Ở mỗi mẫu khảo sát được nuôi cấy trên môi trường MC và EMB, tiến hành chọn 3-10 khuẩn lạc E. coli đặc trưng Bảng 4.1: Số khuẩn lạc E. coli phân lập được trong phân và môi trường Địa Phân heo tiêu chảy Phân heo khỏe Môi trường Tổng điểm SMKS SKLPL SMKS SKLPL SMKS SKLPL SMKS SKLPL AG 215 1.030 32 168 82 189 329 1.387 BT 216 1.048 34 171 80 141 330 1.360 CT 211 1.033 29 129 85 184 325 1.346 ĐT 215 1.045 49 243 126 234 390 1.522 ST 203 1.003 23 110 87 140 313 1.253 VL 212 1.036 32 160 80 83 324 1.279 Tổng 1.272 6.195 199 981 540 971 2.011 8.147 SMKS: số mẫu khảo sát; SKLPL: số khuẩn lạc E. coli phân lập được; AG: An Giang; BT: Bến Tre; CT: Cần Thơ; ĐT: Đồng Tháp; ST: Sóc Trăng; VL: Vĩnh Long 8.147 khuẩn lạc E. coli được phân lập từ 2.011 mẫu phân heo tiêu chảy, heo khỏe và môi trường chăn nuôi tại 6 tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL. Kết quả tương tự kết quả nghiên cứu trước đây như Zinnah et al. (2007), tất cả khuẩn lạc đều có màu hồng tươi trên môi trường MC và màu tím ánh kim trên môi trường EMB. Trong nghiên cứu này, phần lớn các khuẩn lạc E. coli hơi bóng, không có nhày, chỉ có tỷ lệ rất thấp khuẩn lạc E. coli có độ nhày (bóng), kết quả này phù hợp với nhận định của Quinn et al. (2004). Đường kính của các khuẩn lạc E. coli phân lập được đều dao động trong khoảng 1-2 mm. Hầu hết các khuẩn lạc E. coli có dạng bìa nguyên (89,74%), có rất ít khuẩn lạc có dạng bìa răng cưa. Trên môi trường MC, khuẩn lạc vi khuẩn hơi lồi chiếm tỷ lệ cao và khuẩn lạc hơi dẹt chiếm tỷ lệ rất thấp. Bên cạnh đó, tất cả những khuẩn lạc này mọc trên môi trường EMB đều hơi dẹt. Những đặc điểm này rất giống với mô tả của Quinn et al. (2004). Tất cả các chủng vi khuẩn kiểm tra đều có khả năng lên men đường lactose và đường glucose trên môi trường KIA, không sinh H2S; dương tính khi kiểm tra indole và methyl red; âm tính với voges proskauer và citrate. Như vậy, 8.147 chủng vi khuẩn kiểm tra này đều là vi khuẩn E. coli. Tương tự kết quả nghiên cứu của Zinnah et al. (2007), tất cả các vi khuẩn E. coli bắt màu hồng khi nhuộm với Safranin, vì vậy chúng đều là vi khuẩn Gram âm. 100% các chủng vi khuẩn ETEC có hình que ngắn đứng riêng lẻ, có rất ít vi khuẩn đứng từng cặp, có kích thước của E. coli là 1,1-1,5 µm x 2-6 µm. 100% các chủng vi khuẩn này đều có khả năng di động. 4.1.1.2 Tỷ lệ vi khuẩn E. coli từ phân và môi trường 9
Bảng 4.2: Tỷ lệ phân lập E. coli trong phân và môi trường Heo con tiêu chảy Heo khỏe Môi trường Địa điểm SMPL SMDT Tỷ lệ (%) SMPL SMDT Tỷ lệ (%) SMPL SMDT Tỷ lệ (%) An Giang 215 210 97,67 32 31 96,88 82 43 52,44 Bến Tre 216 216 100,00 34 34 100,00 80 34 42,50 Cần Thơ 211 211 100,00 29 29 100,00 85 46 54,12 Đồng Tháp 215 215 100,00 49 49 100,00 126 52 41,27 Sóc Trăng 203 201 99,01 23 22 95,65 87 28 32,18 Vĩnh Long 212 212 100,00 32 32 100,00 80 17 21,25 p
Bảng 4.3: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo và môi trường Heo con tiêu chảy Heo con khỏe Môi trường Kháng (n=1.141) (n=197) (n=220) nguyên bám Thống kê dính SMDT Tỷ lệ SMDT Tỷ lệ SMDT Tỷ lệ (mẫu) (%) (mẫu) (%) (mẫu) (%) F4 (K88) 233 20,42 8 4,06 20 9,09 p0,05 SMDT: Số mẫu dương tính Các chủng F4, F5 và F6 hiện diện trong phân heo khỏe và môi trường chiếm tỷ lệ thấp và khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, F4, F5 và F6 là các kháng nguyên bám dính phổ biến trong các chủng ETEC phân lập phân heo tiêu chảy, heo khỏe và môi trường chăn nuôi ở ĐBSCL. Các chủng ETEC phân lập được có thể là tác nhân gây bệnh tiêu chảy trên heo con, và cũng là nguồn vấy nhiễm ETEC lên nền chuồng, nước uống và ngược lại. 4.1.2.2 Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy theo tuổi Bảng 4.4: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy theo tuổi F4 (K88) F5 (K99) F6 (987P) Địa điểm SMĐD SMDT Tỷ lệ (%) SMDT Tỷ lệ (%) SMDT Tỷ lệ (%) Heo con theo mẹ 585 119 20,34a 55 9,40b 44 7,52c a b Heo sau cai sữa 556 114 20,50 41 7,37 22 3,96d SMĐD: Số mẫu định danh. SMDT: Số mẫu dương tính. Các giá trị trong cùng 1 cột với những chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (p0,05). Kháng nguyên F5 chiếm tỷ lệ thấp hơn và không khác biệt thông kê giữa 2 nhóm tuổi. Riêng F6 hiện diện ở heo con theo mẹ cao hơn heo sau cai sữa, với p0,05). Như vậy pH môi trường giữa 2 vùng sinh thái không ảnh hưởng đến sự sinh tồn của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo con ở ĐBSCL. 11
Bảng 4.5: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy theo vùng sinh thái Vùng Số lượng (%) mẫu dương tính với các chủng ETEC sinh Heo con theo mẹ Heo sau cai sữa thái SMĐD F4 (K88) F5 (K99) F6 (987P) SMĐD F4 (K88) F5 (K99) F6 (987P) NL 189 31 (16,40) 14 (7,41) 14 (7,41) 185 44 (23,78) 8 (4,32) 5 (2,70) NN 396 88 (22,22) 41 (10,35) 30 (7,58) 371 70 (18,87) 33 (8,89) 17 (4,58) p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 NL: nước lợ; NN: nước ngọt; SMĐD: Số mẫu định danh 4.1.2.4. Phân bố các chủng ETEC F4, F5 và F6 trong phân heo tiêu chảy theo quy mô đàn Bảng 4.6: Phân bố các chủng ETEC F4, F5 (K99), F6 (K99) trên heo con tiêu chảy theo quy mô đàn Quy mô SMĐD F4 (K88) F5 (K99) F6 (K99) đàn SMDT Tỷ lệ (%) SMDT Tỷ lệ (%) SMDT Tỷ lệ (%) Nhỏ * 542 98 18,08 42 7,75 31 5,72 Vừa** 310 71 22,90 29 9,35 23 7,42 Lớn*** 289 64 22,15 25 8,65 12 4,15 p>0,05 p>0,05 p>0,05 *: (100 nái), SMĐD: Số mẫu định danh. Sự phân bố của các chủng ETEC mang kháng nguyên F4, F5 và F6 ở heo con tiêu chảy được nuôi quy mô nhỏ và nông hộ hoặc quy mô vừa hay quy mô lớn khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy sự phân bố của các chủng ETEC liên quan tới quy trình chăn nuôi và điều kiện vệ sinh môi trường hơn là quy mô chuồng trại. 4.2 Xác định gene mã hóa các yếu tố độc lực của các chủng ETEC Bảng 4.7: Phân bố gene mã hóa độc lực của các chủng ETEC trong phân heo và môi trường Heo con tiêu chảy Heo khỏe Môi trường Gen độc (n=330 ) (n=14 ) (n=46 ) lực mã hóa SMDT SMDT SMDT Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) (mẫu) (mẫu) (mẫu) F4 90 27,27 2 14,29 11 23,91 Kháng nguyên bám F5 22 6,67 1 7,14 2 4,35 F6 33 10,00 1 7,14 7 15,22 dính F18 66 20,00 2 14,29 4 8,70 F41 9 2,73 0 0,00 2 4,35 Intimin 23 6,97 2 14,29 2 4,35 AIDA - I 12 3,64 1 7,14 1 2,17 p0,05 p
SMDT: Số mẫu dương tính Kết quả cho thấy, heo con tiêu chảy, khỏe và môi trường đều luôn tìm thấy các gene mã hóa các loại kháng nguyên bám dính. Trong đó, F4 luôn chiếm ưu thế trên tất cả loại mẫu phân tích, F18 phổ biến trong phân heo bệnh, heo khỏe. Và F6 phổ biến trên môi trường chăn nuôi. So sánh từng loại độc tố (STa, STb, LT và EAST1) ở cả 3 đối tượng là heo bệnh, heo khỏe và môi trường thì không khác nhau, trừ các chủng phân lập từ heo khỏe không tìm thấy độc tố LT. Tóm lại, những chủng ETEC được phân lập từ heo bệnh hay heo khoẻ và môi trường đều mang gene mã hóa độc lực. 4.2.1 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng ETEC 4.2.1.1 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng ETEC trong phân heo tiêu chảy theo địa phương Bảng 4.8: Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng ETEC trong phân heo tiêu chảy theo địa phương (n=55) Số mẫu (Tỷ lệ %) dương tính với các chủng ETEC Địa điểm F4 F5 F6 F18 F41 Intimin AIDA-I An Giang 14 (25,45) 4 (7,27) 2 (3,64) 11 (20,00) 1 (1,82) 3 (5,45) 0 (0,00) Bến Tre 15 (27,27) 3 (5,45) 3 (5,45) 11 (20,00) 2 (3,64) 2 (3,64) 2 (3,64) Cần Thơ 14 (25,45) 5 (9,09) 7 (12,73) 11 (20,00) 1 (1,82) 8 (14,55) 1 (1,82) Đồng Tháp 22 (40,00) 2 (3,64) 8 (14,55) 10 (18,18) 2 (3,64) 2 (3,64) 0 (0,00) Sóc Trăng 11 (20,00) 3 (5,45) 7 (12,73) 13 (23,64) 2 (3,64) 6 (10,91) 6 (10,91) Vĩnh Long 14 (25,45) 5 (9,09) 6 (10,91) 10 (18,18) 1 (1,82) 2 (3,64) 3 (5,45) p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 Sự phân bố các gene mã hóa những kháng nguyên bám dính ở các chủng ETEC phân lập từ 6 tỉnh/ thành có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Nhưng gene mã hóa kháng nguyên AIDA-I chiếm tỷ lệ thấp, đặc biệt không tìm thấy ở tỉnh An Giang và Đồng Tháp. Các số liệu cũng cho thấy các chủng ETEC mang kháng nguyên F4 và F18 xuất hiện nhiều nhất trong phân heo con tiêu chảy ở cả 6 tỉnh/thành thuộc ĐBSCL. Kết quả này giống với kết quả nghiên cứu của Võ Thành Thìn (2012) và Nguyen Thi Lan et al. (2009), họ cho thấy các chủng ETEC mang gene qui định F4 và F18 luôn chiếm tỷ lệ cao. 4.2.1.2 Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng ETEC trong phân heo tiêu chảy theo tuổi Kết quả cho thấy các chủng ETEC phân lập từ heo con theo mẹ tiêu chảy mang gene mã hóa F4 được tìm thấy với tỷ lệ cao nhất. Kết quả này tương tự với báo cáo của Lý Thị Liên Khai (2001), Vũ Khắc Hùng và ctv 13
(2005a) và Võ Thành Thìn (2012), các tác giả này cho rằng F4 đóng vai trò gây bệnh quan trọng nhất ở heo con theo mẹ. Bảng 4.9: Phân bố gene mã hóa kháng nguyên bám dính của các chủng ETEC trong phân heo tiêu chảy theo tuổi Các chủng mang các gene mã hóa yếu tố bám dính Heo con theo mẹ (n=162) Heo con sau cai sữa (n=168) Thống Gene mã hóa KNBD kê SMDT Tỷ lệ (%) SMDT Tỷ lệ (%) F4 56 34,57a 34 20,24a p0,05 AIDA-I 3 1,85c 9 5,36b,c p>0,05 Ít nhất 1 gene KNBD 116 71,60 105 62,50 KNBD: kháng nguyên bám dính; SMDT: số mẫu dương tính. Các giá trị trong cùng 1 cột với những chữ số mũ khác nhau thì khác nhau rất có ý nghĩa thống kê (p
Bảng 4.10: Phân bố gene mã hóa độc tố ruột của các chủng ETEC trong phân heo tiêu chảy theo địa phương (n= 55) Số lượng các chủng ETEC mang các gene mã hóa độc tố ruột (%) Địa điểm STa STb LT EAST1 An Giang 7 (12,73) 14 (25,45) 4 (7,27) 21 (38,18) Bến Tre 4 (7,27) 15 (27,27) 5 (9,09) 27 (49,09) Cần Thơ 7 (12,73) 21 (38,18) 6 (10,91) 37 (67,27) Đồng Tháp 6 (10,91) 8 (14,55) 3 (5,45) 35 (63,64) Sóc Trăng 15 (27,27) 25 (45,45) 9 (16,36) 31 (56,36) Vĩnh Long 14 (25,45) 23 (41,82) 4 (7,27) 33 (60,00) p0,05 LT 11 6,79d 20 11,90d p>0,05 EAST1 90 55,56a 94 55,95a p>0,05 Ít nhất 1 gene độc tố 110 67,90 106 63,10 Các giá trị trong cùng 1 cột với những chữ số mũ khác nhau thì khác nhau rất có ý nghĩa thống kê (p
Sau khi tiêm 17 chủng vi khuẩn ETEC được phân lập từ phân heo con tiêu chảy vào xoang bụng 68 chuột, kết quả phát hiện 60 chuột chết trong vòng 48 giờ sau khi công cường độc, chiếm 88,24%. Trong đó có 13 chủng gây chết 100% chuột và 4 chủng gây chết 50%. Các kết quả này chứng minh các chủng được kiểm tra có độc lực cao đối với chuột bạch ddY. Trong khi đó, sau tiêm truyền 3 chủng ETEC cũng mang tổ hợp gene độc lực tương tự được phân lập từ phân heo con khỏe trên 12 chuột, không có chuột nào chết. Mổ khám, kiểm tra bệnh tích chuột chết cho thấy chuột chết đều có bụng phình to với dạ dày và ruột chứa nhiều bọt khí, có mùi chua thối, phổi và gan viêm sưng to, xuất huyết hoặc tụ huyết, lách sưng xuất huyết và ruột xuất huyết nặng. Khi phân lập máu tim, gan, lách, thận của tất cả chuột chết trên môi trường MC đều có ETEC thuần và những chủng này đều có chứa gene mã hóa độc lực ban đầu tiêm vào cho chuột. Các kết quả này chứng tỏ các chủng ETEC được phân lập từ heo con tiêu chảy có mang độc lực mạnh hơn từ heo khỏe. 4.2.3.2 Độc lực của các chủng ETEC trên heo sau cai sữa Chọn 4 chủng ETEC có độc lực cao giết chết chuột, mang các gene mã hóa kháng nguyên bám dính F4 và F18 tổ hợp với các gene mã hóa độc tố thường gặp để gây nhiễm cho heo sau cai sữa (5 tuần tuổi), những heo này đã được kiểm tra bằng phương pháp ELISA gián tiếp không mang kháng thể kháng kháng nguyên F4 và F18. Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả 4 chủng ETEC đều có khả năng gây bệnh tiêu chảy cho heo thí nghiệm. Trong đó, chủng E.585j mang tổ hợp gene F4/LT/STb/EAST1 gây tiêu chảy cho heo thí nghiệm chiếm tỷ lệ nhiều nhất (80%, 4/5 con nhiễm bệnh) với các triệu chứng như tiêu chảy nhẹ đến bỏ ăn, tiêu chảy nặng với phân lỏng như nước, còi cọc. Riêng 3 chủng ETEC mang kháng nguyên bám dính F4 hay F18 kết hợp với các độc tố STa/STb hay STb/ EAST1đều làm heo bỏ ăn, tiêu chảy nặng phân lỏng như nước ở 2 heo thí nghiệm. Heo xuất hiện triệu chứng tiêu chảy trong khoảng 24 giờ sau công cường độc, riêng heo ở lô đối chứng vẫn không xuất hiện bất kỳ triệu chứng nào. Phân lập và kiểm tra mẫu phân heo ở 4 lô thí nghiệm, kết quả cho thấy các chủng ETEC thuần mang các độc lực trùng khớp với độc lực ban đầu gây nhiễm. Như vậy, 4 chủng dù mang kháng nguyên bám dính F4 hay F18 đều có khả năng gây tiêu chảy cho heo thí nghiệm. Kết quả này đã chứng tỏ F4, F18 là 2 chủng phổ biến gây bệnh ở heo sau cai sữa. 4.3 Đặc tính đề kháng với kháng sinh của ETEC 16
4.3.1 Khả năng kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo Bảng 4.12: Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo (n=215) Kháng Nhạy trung bình Nhạy Nhóm kháng sinh Tên kháng sinh SCDT Tỷ lệ (%) SCDT Tỷ lệ (%) SCDT Tỷ lệ (%) N1 β-lactam Ampicillin 185 86,05 14 6,51 16 7,44 Amoxicillin/clavunic acid 21 9,77 54 25,12 140 65,12 Ceftazidime 6 2,79 25 11,63 184 85,58 N2 Polypeptides Colistin 110 51,16 100 46,51 5 2,33 Polymyxin B 63 29,30 150 69,77 2 0,93 N3 Aminoglycosides Kanamycin 89 41,40 39 18,14 87 40,47 Neomycin 132 61,40 63 29,30 20 9,30 Gentamicin 92 42,79 13 6,05 110 51,16 Amikacin 8 3,72 9 4,19 198 92,09 Tetracyclines Tetracycline 153 71,16 40 18,60 22 10,23 Phenicol Florfenicol 186 86,51 11 5,12 18 8,37 N4 Trimethoprim/ Sulfonamides sulphamethoxazole 170 79,07 15 6,98 30 13,95 Quinolones Nalidixic acid 135 62,79 31 14,42 49 22,79 Norfloxacin 82 38,14 42 19,53 91 42,33 SCDT: số chủng dương tính; N1 (nhóm 1): ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn; N2 (Nhóm 2): ức chế chức năng màng tế bào vi khuẩn; N3 (Nhóm 3): ức chế tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn; N4 (Nhóm 4): ức chế tổng hợp acid nucleic; Kết quả cho thấy các chủng ETEC được phân lập từ heo con tiêu chảy có khả năng đề kháng với 6/14 loại kháng sinh ở hầu hết các nhóm như ampicillin (86,05%), florfenicol (86,51%), trimethoprim/ sulphamethoxazole (79,07%), tetracycline (71,16%), neomycin (61,4%), nalidixic acid (62,79%). Kết quả này góp phần giải thích hiệu quả điều trị bệnh tiêu chảy ở heo con.Trong khi đó, có 3/14 loại kháng sinh có hiệu lực đối với các chủng ETEC như là amikacin, ceftazidime và amoxicillin/clavulanic acid, các cán bộ thú y có thể sử dụng các loại kháng sinh này để điều trị bệnh tiêu chảy do ETEC ở heo con. 4.3.2 Các gene đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây tiêu chảy trên heo Các chủng ETEC có thể đề kháng lại các kháng sinh nhóm β-lactam là do chúng sản sinh ra enzyme β-lactamase. Enzyme này sẽ thủy phân vòng β-lactam và làm mất hoạt tính của kháng sinh. Kết quả Bảng 4.13 cho thấy ETEC đề kháng với ampicillin và amox/ clavulanic acid chiếm tỷ lệ 17