Tổng hợp 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2-h-indol-2-on (tạp chất A) của diclofenac natri để làm chất đối chiếu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> TỔNG HỢP 1-(2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2HINDOL-2-ON (TẠP CHẤT A) CỦA DICLOFENAC NATRI<br /> ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU<br /> Nguyễn Thị Thanh Trà*, Hà Di u Ly**, Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Trần Thành Đạo*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Sự có mặt của tạp chất liên quan ở lượng rất nhỏ trong nguyên liệu hay các chế phẩm thuốc đều<br /> ảnh hưởng đến hiệu quả và mức độ an toàn của dược phẩm. Do vậy, x{c định giới hạn tạp chất liên quan là một<br /> yêu cầu không thể thiếu trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm của các thuốc.<br /> Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (Tạp<br /> chất A) của Diclofenac dùng trong kiểm nghiệm.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tạp A của diclofenac được tổng hợp từ natri diclofenac bằng phản<br /> ứng oxi hóa đóng vòng trong môi trường acid, xúc tác ánh sáng và sự hỗ trợ vi sóng. Sản phẩm được tinh chế<br /> bằng sắc ký cột (Si-60) v| x{c định cấu trúc sản phẩm bằng phương ph{p phổ nghiệm UV, IR, MS và 1H-NMR<br /> và 13C-NMR.<br /> Kết quả: Tổng hợp được tạp A diclofenac độ tinh khiết cao h|m lượng 98,21% so với tạp chuẩn A (USP).<br /> Kết luận: Quy trình điều chế tạp A diclorofenac đơn giản có thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm<br /> với hiệu suất khoảng 53%. Sản phẩm có độ tinh khiết cao đạt yêu cầu chất lượng đối với nguyên liệu đối chiếu.<br /> Từ khóa: Tạp A diclofenac, tổng hợp, tạp đối chiếu<br /> <br /> ABSTRACT<br /> SYNTHESIS OF 1- (2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2H-INDOL-2-ONE (IMPURITY A)<br /> OF DICLOFENAC SODIUM AS REFERENCE MATERIAL<br /> Nguyen Thi Thanh Tra, Ha Dieu Ly, Nguyen Huu Lac Thuy, Tran Thanh Dao<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 521 - 527<br /> Background: The presence of very small amounts of impurities in the active ingredients or in the dosage<br /> forms may affect the effectiveness and safety to the patients. Therefore, determining the level of related impurities<br /> is an indispensable requirement in the specifications of substances and products.<br /> Objectives: Setting up a prosedure for synthesis of 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one used<br /> as reference impurity for testing quality of diclofenac medicines.<br /> Methods: A impurity of diclofenac was synthesized from sodium diclofenac by oxidation in acide medium<br /> under accelerated by microwave and sunlight. The product was purified by column chromatography (Si-60) and<br /> the structure of final product was determined by UV, IR, MS and 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopy.<br /> Results:A impurity of diclofenac was obtained with a high purity of 98.21% compared to standard A<br /> impurity (USP).<br /> Conclusions: A simple procedure for synthesis of diclofenac A impurity was developted successfully in<br /> laboratory conditions with an overall yield of 53%. The product has a high purity of 98.21% which satisfies<br /> requirements for establishment of reference materials.<br /> * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> ** Viện Kiểm nghiệmThuốc, Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Th|nh Đạo<br /> ĐT: 0903716482<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Email: daott@ump.edu.vn<br /> <br /> 521<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Keywords: Diclofenac A impurity, synthesis, reference impurity<br /> báo này chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp 1ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> (2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on<br /> Hiện nay, c{c nh| m{y dược phẩm trong<br /> (Tạp chất A của diclofenac natri) hướng đến thiết<br /> nước đều sản xuất thuốc với nguồn nguyên liệu<br /> lập chất tạp đối chiếu.<br /> chủ yếu là nhập khẩu. Do đó, kiểm nghiệm chất<br /> ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> lượng nguyên liệu l| điều hết sức cấp thiết, đặc<br /> biệt là tạp chất liên quan. Yêu cầu nghiêm ngặt<br /> Dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydrovề tạp chất đã được các tổ chức quốc tế đưa ra v|<br /> 2H-indol-2-on còn gọi là tạp A của diclofenac.<br /> là một trong những chủ đề chính trong các hội<br /> Hóa chất<br /> nghị quốc tế để thống nhất các nguyên tắt như<br /> Nguyên liệu diclofenac natri, Số lô: DA006;<br /> Q3A (R), Q3B (R) và Q3C của ICH.<br /> hạn dùng: 2/2017; nơi sản xuất: Ấn Độ. Tạp A<br /> Sựcó mặt của tạp chất liên quan ở lượng rất<br /> diclofenac natri chuẩn USP, Số lô: USP/LOM 175,<br /> nhỏ cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu lực và mức<br /> h|m lượng 99%, nguyên trạng. Methanol<br /> độan toàn của dược phẩm. Các tạp chất chuẩn<br /> (HPLC), ethyl acetat (PA)của JT Baker, acid<br /> dùng trong kiểm nghiệm nguyên liệu hiện vẫn<br /> phosphoric 85%, acid hydrocloric 37%, acid<br /> chưa được tổng hợp và sản xuất nhiều tại Việt<br /> sulfuric 98%, natri dihydro phosphat PA, bản<br /> Nam, nếu phải mua thì rất đắt và phụ thuộc<br /> mỏng silica gel F254 (Merck), silica gel cỡ hạt 60nhiều từ bên ngoài và mất thời gian đặt mua, do<br /> 200mm dùng cho sắc ký cột.<br /> đó, đ}y l| vấn đề được nhiều xí nghiệp dược<br /> Thiết bị<br /> Việt Nam quan tâm.<br /> Lò vi sóng Hitoshi G-475AW, máy hồng<br /> Diclofenac, thuộc nhóm kháng viêm, giảm<br /> ngoại Thermo-Science, máy sắc ký lỏng<br /> đau không steroid l| một trong những nhóm<br /> Shimadzu LC-20A với detector PDA, máy DSCthuốc được sử dụng nhiều nhất. Theo BP 2014,<br /> Q20, m{y đo khối phổ tứ cực LC-MS/MS Agilent<br /> diclofenac có 5 tạp chất li n quan, trong đó tạp A<br /> 1200 nguồn ESI, cột Inersil C18 (250 mm x 4,6<br /> là vừa là sản phẩm trung gian vừa là sản phẩm<br /> mm, 5 m), m{y đo cộng hưởng từ hạt nhân<br /> phân hủy trong quá trình sản xuất(2). Vì vậy,<br /> Bruker 500 MHz (Viện Hóa học, viện Hàn lâm<br /> trong dược điển USP, BP và EP hiện hành, qui<br /> KH&CN Việt Nam).<br /> định phảikiểm soát tạp Atrong nguyên liệu và<br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> thành phẩm.<br /> Tạp diclofenac được tổng hợp theo sơ đồ<br /> Với mong muốn tạo ra chất chuẩn tạp phục<br /> 1.<br /> vụ cho công tác kiểm nghiệm để giảm chi phí<br /> sản xuất cũng như gi{ th|nh sản phẩm, trong bài<br /> <br /> Sơ đồ 1: Phản ứng tổng hợp tạp A của diclofenac<br /> <br /> 522<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> Giai đoạn 1<br /> Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành<br /> diclofenac để hạn chế tối đa tạp hình thành trong<br /> phẩn ứng tổng hợp tiếp theo(2,3).<br /> Cân khoảng 12 g diclofenac natri, thêm<br /> khoảng 500 ml dung dịch HCl 10% vào bình<br /> Bucher 1L, khuấy mạnh liên tục. Kết tủa dạng<br /> acid của diclofenac xuất hiện. Lọc lấy tủa. Kết<br /> tinh diclofenac trong 300 ml methanol, sấy sản<br /> phẩm ở 60oC trong 12 giờ. Sản phẩm thu được<br /> đem đo phổ IR v| DSC để định tính v| x{c định<br /> độ tinh khiết (điểm chảy diclofenac là 178,8oC)(5).<br /> <br /> Giai đoạn 2: Tổng hợp tạp A từ diclofenac<br /> Dựa theo các tài liệu đã nghi n cứu,<br /> diclofenac trong môi trường acid, dưới t{c động<br /> của vi sóng sẽ xảy ra phản ứng đóng vòng hình<br /> thành tạp A(2,3,4). Cố định tỷ lệ (g/ml) chất nền<br /> diclofenac và thể tích acid sulfuric là 1: 10. Tiến<br /> hành khảo sát các công suất lò từ 50W, 150W,<br /> 250W, với nồng độ acid sulfuric lần lượt là 20%,<br /> 30%, 40% và 50% và thời gian phản ứng ở các<br /> khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 10 phút để chọn ra<br /> điều kiện tổng hợp thích hợp nhất.<br /> Tinh chế: Sản phẩm tổng hợp được tinh chế<br /> qua sắc kí cột tr n pha tĩnh hấp phụ (silica gel Si60), dung môi rửa giải ethyl acetat 100%.<br /> X{c định cấu trúc: X{c định bằng c{c phương<br /> pháp phổ nghiệm 1H-NMR, 13C-NMR, IR cũng<br /> như so s{nh c{c số liệu phổ có được với tài liệu<br /> tham khảo(3).<br /> Xác định độ tinh khiết: Độ tinh khiết của sản<br /> phẩm tổng hợp được x{c định bằng HPLCvới<br /> điều kiện sắc ký tu}n theo điều kiện kiểm<br /> nghiệm tạp A trong nguyên liệu diclofenac natri<br /> của USP 35(6).<br /> Dung dịch đệm phosphat pH 2.5: Trộn đều 2<br /> thể tích tương đương acid phosphoric 0.01 M v|<br /> natri hydrophosphat 0.01 M.<br /> Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm<br /> phosphat pH 2.5 (700:300).<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Dung môi: Methanol:Nước (70:30)<br /> Cột: d|i 0.25 m, đường kính 4.6 mm<br /> Pha tĩnh: octylsilyl silica gel (5 µm).<br /> Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm<br /> phosphat pH 2.5 (700:300).<br /> Tốc độ dòng:1 ml/phút.<br /> ước sóng phát hiện: 254 nm.<br /> Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.<br /> Sử dụng chế độ Max plot giúp phát hiện các<br /> pic tạp chất trên toàn thang sóng 190 – 800 nm.<br /> Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic để<br /> x{c định độ tinh khiết pic.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Gi i đoạn 1: Chuyển hoàn toàn diclofenac natri<br /> thành diclofenac dạng acid<br /> Thu được 9,8 g kết tinh trắng, bông xốp. Phổ<br /> IR cho c{c dao động đặc trưng tương ứng với<br /> diclofenac, điểm chảy 178,8oC phù hợp với điểm<br /> chảy diclofenac. Tiến hành đo DSC để x{c định<br /> độ tinh khiết của sản phẩm là 99,5 %.<br /> Gi i đoạn 2: Tổng hợp tạp A của diclofenac<br /> <br /> Khảo sát yếu tố công suất lò vi sóng<br /> Cân khoảng 1,0 g diclofenac thu được vào 3<br /> bình nón 100 ml, thêm vào mỗi bình 10 ml H2SO4<br /> 20%, tiến hành phản ứng lần lượt với 3 công suất<br /> 50W, 150W, 250W trong 2 phút. Mỗi phản ứng<br /> thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến<br /> hành HPLC, sử dụng tạp chuẩn A của diclofenac<br /> làm chất đối chiếu. x{c định hiệu suất phản ứng<br /> dựa vào % diện tích pic của tạp A trên sắc ký đồ.<br /> Lấy khoảng 1 ml dung dịch phản ứng chiết bằng<br /> 5 ml x 2 lần cloroform, l|m bay hơi dịch<br /> cloroform cắn hòa tan trong pha động theo điều<br /> kiện HPLC (Hình 1).<br /> Tạp<br /> được hình thành nhiều nhất ở công<br /> suất 150W, trong khi ở công suất 250W sau 10<br /> giây nguyên liệu đã bị carbon hóa hoàn toàn.<br /> Chọn công suất 150W là công suất để thực hiện<br /> phản ứng.<br /> <br /> 523<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 50W<br /> <br /> 150W<br /> <br /> Hình 1: Kết quả khảo sát công suất phản ứng<br /> <br /> Khảo sát yếu tố nồng độ dung dịch H2SO4<br /> Cân khoảng 1,0 g diclofenac vào 4 bình nón<br /> 100 ml, thêm vào mỗi bình lần lượt 10 ml dung<br /> dịch H2SO4 ở các nồng độ khác nhau (20%, 30%,<br /> 40% và 50%). Tiến hành phản ứng ở công suất<br /> 150W trong 2 phút. Mỗi phản ứng thực hiện 3<br /> <br /> lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến hành HPLC<br /> để x{c định hiệu suất phản ứng.<br /> Tạp được hình thành nhiều nhất với dung<br /> dịch H2SO4 40%, trong khi dung dịch H2SO4 50%,<br /> sau 20 giây nguyên liệu đã bị carbon hóa hoàn<br /> toàn. Chọn dung dịch H2SO4 40% để thực hiện<br /> phản ứng tổng hợp.<br /> <br /> Hình 2: Kết quả khảo sát nồng độ acid sulfuric phản ứng<br /> <br /> 524<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Khảo sát yếu tố thời gian phản ứng<br /> <br /> Hình 3: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng<br /> Cân khoảng 1 g diclofenac vào 5 bình nón<br /> 100 ml, thêm vào mỗi bình 10 ml H2SO4 40%<br /> tiến hành phản ứng ở công suất 150W lần lượt<br /> trong các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 10 phút.<br /> Mỗi phản ứng thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu<br /> phản ứng tiến h|nh HPLC để x{c định hiệu<br /> suất phản ứng.<br /> Tạp diclofenac được tạo thành nhiều nhất<br /> với thời gian 8 phút. Ở thời gian sau 10 phút các<br /> tạp khác bắt đầu xuất hiện nhiều.<br /> Qui trình tổng hợp tạp A diclofenac<br /> Cân khoảng 6g diclofenac vào bình nón<br /> 200ml, thêm vào 60 ml dung dịch H2SO4 40%, đặt<br /> vào lò vi sóng ở công suất 150W trong 8 phút,<br /> hỗn hợp phản ứng tạo th|nh thu được khối dẻo<br /> màu vàng (5,4 g). Hiệu suất khoảng 90%.<br /> <br /> Tinh chế<br /> Sắc ký cột (50 x 10 cm), silica gel (60-200 µm),<br /> dung môi rửa giải ethyl acetat, kiểm tra các phân<br /> đoạn bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat -<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> methanol (8:2), phát hiện vết bằng đèn UV 254<br /> nm, đối chiếu với vết của chuẩn tạp A diclofenac<br /> của USP, thu được ph}n đoạn có chứa tạp A (3,2<br /> g) ký hiệu DFA. Hiệu suất của toàn bộ quá trình<br /> tổng hợp và tinh chế là 53,3%.<br /> Xác định cấu trúc<br /> <br /> Tính chất<br /> Tinh thể màu trắng, điểm chảy: 251 oC(6). .<br /> Phổ IR cho c{c dao động ở 1731cm-1 (nhóm<br /> C= O của vòng lactam), 1612 cm-1 (C-N), và 782,<br /> 749 cm-1 (C-Cl), ứng với phổ IR của tạp A của<br /> diclofenac USP. Phổ ESI-MS của sản phẩm tổng<br /> hợp có m/z = 299,9958 [M+Na]+; M phù hợp với<br /> công thức phân tử của tạp A: C14H9Cl2NO (M =<br /> 278,1338). Phổ 1H-NMR của DFA cho các tín hiệu<br /> cộng hưởng của vòng 2,6 diclorophenyl: [H =<br /> 7,51ppm (d; 2H; J = 8,0 Hz), H-3’; H-5’+, *H = 7,34<br /> ppm (t; 1H; J = 6,5 Hz và J = 7,0 Hz), H-4’+; Vòng<br /> 1,3 dihydro - 2H -indol - 2 on: [H = 7,38 ppm (d;<br /> 1H; J = 8,0 Hz), H-9], [H = 7,20 ppm (t; 1H; J = 7,5<br /> Hz và J = 7,5 Hz), H-8], [H = 7,09 ppm (t; 1H; J =<br /> <br /> 525<br /> <br />