Tổng hợp 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1- yl]benzensulfonamid (tạp A của celecoxib)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> TỔNG HỢP 4-[5-(3-METHYLPHENYL)-3-(TRIFLUOROMETHYL)-1HPYRAZOL-1-YL]BENZENSULFONAMID (TẠP A CỦA CELECOXIB)<br /> Nguyễn Minh Trí*, Lâm Nguyễn Đoan Trang**, Huỳnh Phương Nguyên**, Lê Thị Thu Cúc***,<br /> Trương Ngọc Tuyền**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Tạp A của celecoxib là 1 trong 2 tạp chất chính (tạp A và B) của celecoxib được quy định<br /> trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ, đóng vai trò quan trọng trong công tác kiểm nghiệm thành phẩm<br /> thuốc celecoxib trên thị trường Việt Nam hiện nay.<br /> Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1yl]benzensulfonamid (tạp A của celecoxib) và xác định độ tinh khiết tạp A.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tạp A của celecoxib được tổng hợp qua 4 giai đoạn đi từ các<br /> nguyên liệu đầu đơn giản. Tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh lại. Xác định cấu trúc bằng các phương pháp<br /> phổ như IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC. Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC.<br /> Kết quả: Tổng hợp được tạp A của celecoxib với hiệu suất tổng cộng 33,99% và độ tinh khiết đạt<br /> 99,15% đủ điều kiện để thiết lập chất đối chiếu.<br /> Kết luận: Đã được tổng hợp thành công tạp A và xác định cấu trúc. Sản phẩm có độ tinh khiết cao đạt<br /> tiêu chuẩn để thiết lập chất đối chiếu.<br /> Từ khóa: Tạp A celecoxib, tổng hợp, chất đối chiếu.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> SYNTHESIS OF 4-[5-(3-METHYLPHENYL)-3-(TRIFLUOROMETHYL)-1H-PYRAZOLE1-YL]BENZENESULFONAMIDE (CELECOXIB RELATED COMPOUND A)<br /> Nguyen Minh Tri, Lam Nguyen Doan Trang, Huynh Phuong Nguyen, Le Thi Thu Cuc,<br /> Truong Ngoc Tuyen<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 77-82<br /> Backgrounds: Celecoxib related compound A is one of the two major impurities (A and B) of celecoxib<br /> which is specified in the British Pharmacopoeia and the US Pharmacopoeia. Synthesis of celecoxib related<br /> compound A provides reference material for impurity testing of celecoxib in Vietnam.<br /> Objectives: Design the procedure for synthesis of 4-[5-(3-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1Hpyrazole-1-yl]benzenesulfonamide (celecoxib related compound A) and determination of its impurity for<br /> reference material.<br /> Methods: Celecoxib related compound A was synthesized via 4 steps from simple starting material.<br /> Final product was purified by column chromatography and recrystallization. Confirmation its structure by<br /> using IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC and HSQC.<br /> Results: Overall yields of synthesis of celecoxib related compound A is 33.99% and the purity of the<br /> product was 99,15% by HPLC and met the requirements for reference material.<br /> *<br /> <br /> Công ty Dược phẩm Korean United Pharma<br /> Khoa Dược, ĐH Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> ***Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh.<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trương Ngọc Tuyền<br /> ĐT: 0903330604<br /> **<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> Email: truongtuyen@ump.edu.vn<br /> <br /> 77<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Conclusions: Celecoxib related compound A were successfully synthesized with high purity (99.15%)<br /> and met requirement for establishment reference material.<br /> Key words: Celecoxib related compound A, synthesis, reference material.<br /> <br /> ĐẶT VẤNĐỀ<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> <br /> Tạp A của celecoxib là một trong 2 tạp chất<br /> chính (tạp A và B) được quy định trong Dược<br /> điển Anh(3) và Dược điển Mỹ(6), tạp này đóng<br /> vai trò quan trọng trong công tác phân tích tạp<br /> chất của thành phẩm thuốc celecoxib trên thị<br /> trường Việt Nam hiện nay.<br /> <br /> 4-[5-(3-Methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamid còn gọi là<br /> tạp A của celecoxib.<br /> <br /> Theo Dược điển Anh, tạp A xuất hiện<br /> trong quá trình tổng hợp celecoxib là sản<br /> phẩm của 4-hydrazinobenzensulfonamid với<br /> 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan-1,3dion, được xem là tạp chất chính với giới hạn<br /> cho phép trong nguyên liệu là không quá<br /> 0,4%. Bên cạnh đó, tạp A còn thuộc nhóm<br /> GHS06 có thể gây độc cho gan, thận khi hít<br /> hay nuốt phải. Do đó việc kiểm nghiệm tạp<br /> này trong nguyên liệu hay thành phẩm thuốc<br /> là hết sức cần thiết.<br /> <br /> Hóa chất<br /> Sulfanilamid, natri acetat, natri hydroxid,<br /> natri sulfit, acid hydrocloric, acid nitric, acid<br /> sulfuric, methanol, 1,4-dioxan, n-hexan,<br /> petroleum ether (Trung Quốc); ethanol, ethyl<br /> acetat (Việt Nam); acetonitril, methanol<br /> (HPLC grade); 3-methylacetophenon (Acros,<br /> Bỉ); anhydrid trifluoroacetic (Prolabo, Pháp).<br /> Thiết bị<br /> <br /> celecoxib từ nguyên liệu đơn giản ban đầu để<br /> <br /> Máy khuấy từ gia nhiệt IKA, máy lọc áp<br /> suất giảm Velp, máy cô quay chân không<br /> Buchi, cân phân tích Sartorius, cân điện tử<br /> Chaus, máy đo điểm nóng chảy SanyoGallenkamp, máy đo quang phổ hồng ngoại<br /> IRAFFINITY-1S Shimadzu, máy đo quang phổ<br /> MS Agilent LC-MS/MS; LC-MS Shimadzu,<br /> máy quang phổ NMR Bruker Avance III 500<br /> MHz, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLCPDA Shimadzu Prominence.<br /> <br /> phục vụ cho việc thiết lập chất đối chiếu nhằm<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> giúp giảm giá thành sản phẩm.<br /> <br /> Tạp A của celecoxib được tổng hợp qua 4<br /> giai đoạn được mô tả trong sơ đồ 1.<br /> <br /> Hiện nay để phục vụ cho kiểm nghiệm<br /> thuốc, các tạp chuẩn đều được nhập từ nước<br /> ngoài với giá cao. Do đó, nhóm nghiên cứu<br /> quyết định tiến hành việc tổng hợp tạp A của<br /> <br /> Tạp A<br /> <br /> Sơ đồ 1: Quy trình tổng hợp tạp A của celecoxib<br /> <br /> 78<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> Tổng hợp methyl trifluoroacetat (SP1)<br /> Cho thật chậm anhydrid trifluoroacetic<br /> (105 g; 0,5 mol) vào methanol (120 mL) trong<br /> bình cầu 500 mL ở 0 °C. Thêm 5 mL H2SO4<br /> đậm đặc vào và đun hồi lưu 3 giờ. Hỗn hợp<br /> sau phản ứng được trung tính hóa với Na2CO3<br /> hoặc NaOH 10%, sau đó chưng cất ở 41-45 °C.<br /> Sản phẩm chưng cất được làm khan với CaCl2<br /> rồi với Na2SO4. Sản phẩm được bảo quản lạnh<br /> trong chai kín(1).<br /> Tổng hợp 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl)<br /> butan-1,3-dion (SP2)<br /> Hòa tan natri methylat (4,1 g; 75 mmol)<br /> bằng toluen (100 mL) trong bình cầu. Ổn định<br /> nhiệt độ phản ứng 20-25 oC, cho từ từ 3methylacetophenon (6,7 g; 50 mmol) trong<br /> toluen vào bình cầu trong 30 phút. Tiếp tục<br /> khuấy hỗn hợp trong 30 phút. Dung dịch<br /> methyl trifluoroacetat (9,6 g; 75 mmol) trong<br /> toluen được cho từ từ vào hỗn hợp trên ở 20<br /> – 25 oC trong 1 giờ, sau đó nâng nhiệt độ lên<br /> 110 oC, khuấy trong 24 giờ. Hỗn hợp phản ứng<br /> được làm nguội ở 30 oC và cho vào cốc chứa<br /> dung dịch HCl, khuấy đều và để yên đến<br /> khi sản phẩm tách lớp. Chiết sản phẩm còn<br /> lại trong dung dịch nước bằng toluen. Rửa<br /> sản phẩm với nước cất, loại bỏ dung môi<br /> bằng cô quay(2).<br /> Tổng hợp 4-hydrazinobenzensulfonamid<br /> (SP3)<br /> Hòa tan sulfanilamid (12,9 g; 0,075 mol)<br /> trong một hỗn hợp đồng lượng gồm 21 mL<br /> HCl đậm đặc và 21 mL nước, làm lạnh nhanh<br /> đến 0 oC để thu được dạng muối hydroclorid ở<br /> dạng bột mịn. Muối diazoni được tạo ra bằng<br /> cách cho từ từ dung dịch chứa NaNO2 (5,2 g;<br /> 0,075 mol) trong 12 mL nước. Kiểm tra phản<br /> ứng bằng giấy tẩm KI - hồ tinh bột. Tiếp tục<br /> khuấy trong vài phút, sau đó cho vào dung<br /> dịch lạnh chứa Na2SO3 (19,66 g; 0,156 mol) và<br /> NaOH (4 g; 0,1 mol) trong l00 mL nước; tiếp<br /> tục khuấy hỗn hợp trong 5 phút. Để yên trong<br /> 5 phút, acid hóa với 70 mL dung dịch HCl<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> đậm đặc và đun cách thủy ở 30 oC trong 3<br /> phút, khi tinh thể màu vàng tươi tách ra. Để<br /> yên trong tủ lạnh 2 giờ, lọc ra các tinh thể,<br /> thêm 50 mL HCl đậm đặc, đun cách thủy<br /> trong 10 phút và để nguội. Lọc lấy tủa gồm<br /> 4-hydrazinobenzensulfonamid hydroclorid và<br /> các muối natri, hòa tan tủa vào trong nước và<br /> trung hòa bằng CH3COONa khan, xuất hiện<br /> tủa của 4-hydrazinobenzensulfonamid(2).<br /> <br /> Tổng hợp tạp A<br /> Cho 4-hydrazinobenzensulfonamid (4,675<br /> g; 25 mmol) vào bình cầu 250 mL chứa sẵn<br /> methanol (75 mL). Điều chỉnh pH tới 2-3 bằng<br /> HCl đậm đặc và khuấy đều. Cho từ từ dung<br /> dịch 4,4,4-trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan1,3-dion (5,75 g; 25 mmol) trong methanol (15<br /> mL) vào và đun hồi lưu trong 16 giờ(2). Dung<br /> môi được loại bỏ hoàn toàn bằng cô quay,<br /> phần còn lại được hòa tan trong 35 mL nước<br /> và chiết bằng ethyl acetat (3 x 50 mL). Rửa<br /> dịch chiết ethyl acetat bằng nước. Cô quay thu<br /> được chất rắn.<br /> Tinh chế<br /> Sản phẩm được tinh chế bằng phương<br /> pháp sắc ký cột trên pha tĩnh hấp phụ (silica<br /> gel-Si60), dung môi rửa giải là clorofrom –<br /> ethyl acetat – petroleum ether (10:3:2) kết hợp<br /> với phương pháp kết tinh thay đổi dung môi.<br /> Xác định cấu trúc<br /> Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các<br /> phương pháp quang phổ IR, MS, 1H-NMR,<br /> 13C-NMR, HMBC và HSQC đồng thời so sánh<br /> với các tài liệu tham khảo(4).<br /> Xác định độ tinh khiết<br /> Dựa trên các điều kiện sắc ký tham khảo(3,6),<br /> chúng tôi đã khảo sát được các thông số.<br /> Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C6 –<br /> phenyl (250 x 4,6 mm; 5 µm).<br /> Dung môi pha mẫu: nước – methanol (25 : 75).<br /> Pha động: Acetonitril – dung dịch đệm<br /> (50:50), trong đó dung dịch đệm là dung dịch<br /> <br /> 79<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> KH2PO4 2,7 g/L đã được điều chỉnh tới pH 3,0<br /> bằng H3PO4.<br /> Tốc độ dòng: 1 mL/ phút.<br /> Nhiệt độ cột: 50 oC.<br /> Thể tích tiêm mẫu: 5 µL.<br /> Đầu dò PDA: bước sóng phát hiện 215 nm.<br /> Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác khoảng<br /> 10,0 mg tạp A, cho vào bình định mức 10 mL,<br /> thêm vào 5 mL dung môi pha mẫu, siêu âm cho<br /> đến khi tạp A tan hết (khoảng 5 phút), thêm<br /> nước cất vừa đủ 10 mL, lắc đều, lọc qua màng<br /> lọc 0,45 µm. Mẫu trắng: dung môi pha mẫu.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Methyl trifluoroacetat (M = 128,0502) (SP1)<br /> là chất lỏng trong suốt không màu, nặng hơn<br /> nước, có mùi thơm của ester. Hiệu suất 67,2%.<br /> tos: 42 - 44 oC. Tỷ trọng và nhiệt độ sôi phù<br /> hợp với số liệu tham khảo của hãng SigmaAldrich (d = 1,273 g/cm3, tos = 43 - 43,5 °C)(5).<br /> 4,4,4-Trifluoro-1-(3-methylphenyl)butan1,3-dion (M = 230,1832) (SP2) là chất lỏng<br /> màu vàng cam. Không tan trong nước, tan<br /> trong ethanol, ethyl acetat. Hiệu suất: 80,5%.<br /> Rf = 0,75 (cloroform-ethyl acetat-petroleum<br /> ether (10:3:2)). MS m/z: [M-H]- tìm thấy:<br /> 229,0473 ([M-H]- dự kiến: 229,0477). 1H-NMR<br /> (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,96 (s, 1H, H2’);<br /> 7,92 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H6’); 7,54 (d, 1H, J = 7,5<br /> Hz, H4’); 7,47 (t, 1H, J = 7,5 Hz, H5’); 6,99 (s, 1H,<br /> H2); 4,41 (s, 1H, Henol); 2,40 (s, 3H, Hmethyl). 13CNMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 185,89 (C3);<br /> 174,07 (C1); 138,68 (C1’); 135,11(C2’); 132,49 (C6’);<br /> 128,99 (C4’); 128,31 (C5’); 125,17 (C3’); 114,28 121,05 (-CF3); 93,01 (C2); 20,69 (Cmethyl).<br /> <br /> 210,0300 ([M+Na]+ dự kiến 210,0313). Phổ 1HNMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,50 (d, 2H,<br /> J = 9 Hz, H2, H6); 7,40 (s, 2H, Hsulfonamid); 6,91 (d,<br /> 2H, J = 9 Hz, H3, H5); 6,88 (s, 2H, HNH2); 6,49 (s,<br /> 1H, HNH).<br /> 4-[5-(3-Methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamid<br /> (M<br /> =<br /> 381,3722) (Tạp A) là tinh thể trắng sáng. Tan<br /> trong methanol, ethyl acetat; không tan trong<br /> n-hexan. Hiệu suất: 83,2%. MP: 139,5 oC (phù<br /> hợp với thông số LGC Standard(6) 135-145 oC)<br /> khoảng nhiệt độ từ khi bắt đầu đến khi nóng<br /> chảy hoàn toàn dưới 1 oC. Rf = 0,5 (Cloroformethyl acetat-petroleum ether (10:3:2)). Phổ IR<br /> (cm-1) (so sánh LGC Standard(6)): 3336 (3335,<br /> NH), 3236 (3236), 1593 (1592, C=N), 1494 (1494,<br /> C=Cbenzen), nhóm CF3 1157 (1157) cm-1, 1128<br /> (1128) cm-1. MS m/z = [M+Na]+ tìm thấy<br /> 404,0613 ([M+Na]+ dự kiến 404,0657); [M-H]tìm thấy 380,0557 ([M-H]- dự kiến 380,0681).<br /> Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:<br /> 7,87 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H2, H6); 7,54 (d, 2H, J =<br /> 8,5 Hz, H3, H5); 7,50 (s, 2H, Hsulfonamid); 7,21 (s,<br /> 1H, H4’); 7,25 – 7,29 (m, 3H, H5”, H4”, H2”); 7,01<br /> (d, 1H, J = 7,0 Hz, H6”); 2,29 (s, 3H, Hmethyl). Phổ<br /> 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 145,28<br /> (C3’); 144,01 (C4’); 142,28 (CF3); 141,98 (CF3);<br /> 141,04 (C1); 138,21(C3”); 129,99; 129,45; 128,59;<br /> 128,13; 126,72 (C2, C6); 125,91 (C3, C5); 122,31<br /> (C5’); 120,17 (C1”); 106,29 (C4’); 20,82 (Cmethyl).<br /> Từ các kết quả trên có thể kết luận sản<br /> phẩm thu được chính là tạp A của celecoxib.<br /> <br /> 4-Hydrazinobenzensulfonamid<br /> (M<br /> =<br /> 187,2196) (SP3) là tinh thể trắng ngà, hoặc hơi<br /> vàng. Tan trong nước, ít tan trong ethanol.<br /> Hiệu suất: 73,3%. Rf = 0,55 (Cloroform-ethyl<br /> acetat-methanol (10:7:3)). Phổ IR (cm-1): 3251,<br /> 3194 (NH), 2846 (C-Hbenzen), 1506 cm-1<br /> (C=Cbenzen). MS m/z: [M-H]- tìm thấy 186,0330<br /> ([M-H]- dự kiến 186,0337); [M+Na]+ tìm thấy<br /> <br /> 80<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> Xác định độ tinh khiết bằng HPLC<br /> <br /> Tính phù hợp của hệ thống<br /> Tính phù hợp của hệ thống được xác định<br /> bằng cách tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung<br /> dịch tạp A 1000 µg/ml. Kết quả trình bày ở<br /> bảng 1.<br /> Bảng 1: Khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký<br /> (n=6)<br /> tR (phút)<br /> Trung bình 15,203<br /> RSD (%)<br /> 0,07<br /> <br /> S (µV x<br /> giây)<br /> 20450149<br /> 0,69<br /> <br /> As<br /> 0,95<br /> 0,09<br /> <br /> Rs<br /> <br /> N<br /> <br /> 8,624 18183<br /> 0,48 0,28<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> RSD của các thông số đều nhỏ hơn 2%,<br /> số đĩa lý thuyết (N > 2000), hệ số phân giải<br /> Rs > 1,5 cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa là<br /> tương thích cho việc phân tích tạp A.<br /> <br /> Độ tinh khiết của tạp<br /> Tiến hành sắc ký mẫu trắng và dung<br /> dịch thử (tạp A 1000 µg/ml) cho thấy trên<br /> sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic<br /> trùng với thời gian lưu của pic tạp A. Độ<br /> tinh khiết tạp A tính theo phương pháp<br /> phần trăm diện tích pic là 99,15% tính theo<br /> chế phẩm khan.<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của dung dịch tạp A 1000 µg/mL<br /> <br /> BÀNLUẬN<br /> Cho đến nay vẫn chưa ghi nhận công trình<br /> nào trên thế giới công bố về quy trình tổng<br /> <br /> kiện phản ứng tối ưu nhất và hiệu suất tổng<br /> cộng toàn bộ quy trình là 33,99%.<br /> Ở giai đoạn tổng hợp tạp A, việc thêm<br /> <br /> hợp tạp A. Qua 4 bước đã tổng hợp được tạp<br /> <br /> nhiều<br /> <br /> A của celecoxib, nguyên liệu trong quy trình<br /> <br /> benzensulfonamid sẽ giúp tăng hiệu suất phản<br /> <br /> tổng hợp là các chất thông dụng, dễ tìm. Phản<br /> <br /> ứng, giảm lượng tạp trong hỗn hợp sau phản<br /> <br /> ứng tổng hợp và quy trình tinh chế có hiệu<br /> <br /> ứng. Tinh chế riêng lẻ bằng phương pháp kết<br /> <br /> suất tương đối cao (từ 67,2%-83,2%) và có thể<br /> <br /> tinh lại hoặc sắc ký cột không loại hoàn toàn<br /> <br /> thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm. Quy<br /> <br /> được tạp. Khi kết hợp giữa hai phương pháp,<br /> <br /> trình tổng hợp đã được lựa chọn những điều<br /> <br /> dùng phân đoạn chứa sản phẩm từ cột sắc ký,<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> lần<br /> <br /> nguyên<br /> <br /> liệu<br /> <br /> 4-hydrazino<br /> <br /> 81<br /> <br />