Tổng hợp các chất chuẩn tạp felodipin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> TỔNG HỢP CÁC CHẤT CHUẨN TẠP FELODIPIN<br /> Nghiêm Thoại Vân*, Trần Bội Châu**, Trần Thành Đạo*, Lê Minh Trí*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Một trong những khó khăn trong công tác kiểm nghiệm felodipin là vấn đề chất chuẩn tạp vì có<br /> giá rất cao và khó mua. Do vậy, mục tiêu của đề tài này là tổng hợp 3 chuẩn tạp A, B và C của felodipin nhằm<br /> cung cấp cho viện kiểm nghiệm thuốc và Hội Đồng Dược Điền Việt nam.<br /> Phương pháp: tổng hợp 3 tạp chất của felodipin A, B và C và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột và kiểm<br /> tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tạp chất A được tổng hợp từ felodipin<br /> bằng cách oxy hóa bằng acid nitric trên giá mang silicagel. Tạp B và C tổng hợp theo phản ứng Hantzsch qua 2<br /> giai đoạn: tạp chất B được tổng hợp từ 2,3-diclorobenzaldehyd và methyl acetoacetat và methyl crotonat. Tạp<br /> chất C được tổng hợp từ 2,3- diclorobenzaldehyd, ethyl acetoacetat và ethyl crotonat.<br /> Kết quả: 3 chất chuẩn tạp A, B và C của felodipin (Dược điển BP 2007) đã được tổng hợp với hiệu suất và<br /> độ tinh khiết cao.<br /> Kết luận: Các qui trình tổng hợp khá đơn giản có thể áp dụng tổng hợp các 3 tạp chất A, B và C của<br /> felodipin dùng làm chất chuẩn trong công tác kiểm nghiệm nguyên liệu felodipin.<br /> Từ khóa: Phản ứng Hantzch, tạp felodipine<br /> <br /> ABSTRACT<br /> SYNTHESIS OF STANDARD IMPURITIES OF FELODIPINE<br /> Nghiem Thoai Van, Tran Boi Chau, Tran Thanh Dao, Le Minh Tri<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 443 - 449<br /> Objectives: In the quality control of drug, one of the problems is the standard reference substrates because of<br /> their extremely high cost and unavailablity. In this research, 3 impurities of felodipine are synthesized in very<br /> simple conditions in order to provide to the institute of quality control.<br /> Method: Three impurities A, B and C were synthetized and purified with flash column chromatography.<br /> Impurity A was obtained from felodipine under oxidative process by acid nitric supported on silicagel. The<br /> Hantzsch reaction via 2 stepes in the presence of catalysis pyridine, piperidine and acetic acid was applied for<br /> generation of impurity B and impurity C, using 2,3-dichlorobenzaldehyde, methyl acetoacetate and methyl<br /> crotonate as starting materials. The synthetic impurities were purified by recrystallization then followed by<br /> column chromatography process on silica gel.<br /> Conclusion: Three imputities of felodipine A, B and C were synthetized with high yield and purity. These<br /> substances could be applied for qualitative analysis of felodipine under BP 2007 specifications.<br /> Key words: Hantzch reaction, felodipine impurities.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới, hiện nay, bệnh<br /> cao huyết áp là một trong 10 bệnh nguy hiểm<br /> ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người và là<br /> <br /> nguyên nhân gây ra cái chết của hơn 7,5 triệu<br /> người hằng năm. Phương pháp điều trị hiệu quả<br /> nhất là dùng thuốc liên tục và lâu dài. Do đó,<br /> việc kiểm tra, đánh giá chất lượng thuốc cần<br /> quan tâm đặc biệt.<br /> <br /> *<br /> <br /> Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược, ĐHYD TP.HCM **Trường Đại học Tôn Đức Thắng<br /> Tác giả liên hệ: PGS. TS. Lê Minh Trí<br /> ĐT: 0903718190<br /> Email: leminhtri1099@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 443<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Felodipin là một thuốc hạ huyết áp thuộc<br /> nhóm chẹn kênh calci, là một trong những thuốc<br /> được ưu tiên lựa chọn bởi những ưu điểm riêng<br /> như: thời gian bán thải dài, liều dùng thấp, chỉ<br /> sử dụng một liều duy nhất trong ngày (dễ tuân<br /> trị, tránh được hiện tượng quên thuốc ở người<br /> cao tuổi)… Tuy nhiên, tại Việt Nam, các chất<br /> chuẩn không sẵn có, phải nhập khẩu từ nước<br /> ngoài với giá đắt, do đó việc kiểm tra nguyên<br /> liệu đầu vào trước khi đưa vào sản suất cũng<br /> như kiểm nghiệm thành phẩm gặp rất nhiều<br /> khó khăn.<br /> Từng bước đảm bảo nguồn nguyên liệu hóa<br /> dược cần tiến hành song song với điều chế chất<br /> chuẩn và tạp chất chuẩn để phục vụ công tác<br /> kiểm nghiệm.<br /> <br /> Bước đầu các nhà sản xuất hóa dược trong<br /> nước đã tiến hành một số nghiên cứu sản xuất<br /> thuốc đặc trị như các thuốc tim mạch như<br /> nifedipin, felodipin và amlodipin.<br /> Hiện nay nhu cầu tạp chất chuẩn felodipin<br /> (xem Hình 1) tại Viện kiểm nghiệm thuốc Thành<br /> phố Hồ Chí Minh rất cấp thiết, do vậy nghiên<br /> cứu này nhằm mục tiêu thiết lập được phản ứng<br /> điều chế, tinh chế thích hợp để sản xuất trong<br /> nước thay cho nhập ngoại rất đắt và mất nhiều<br /> thời gian chờ nhập.<br /> Báo cáo này trình bày các phản ứng hóa học<br /> ứng dụng trong điều chế và toàn bộ các qui trình<br /> tổng hợp tinh chế cũng như kiểm nghiệm độ<br /> tinh khiết. Tuy vậy, kết quả này chỉ mới là bước<br /> thăm dò qui mô phòng thí nghiệm.<br /> <br /> Tạp A: ethyl methyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethylpyridin-3,5-dicarboxylat<br /> Tạp B: dimethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat<br /> Tạp C: diethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat<br /> <br /> Hình 1. Các chất chuẩn tạp A, B và C dùng trong kiểm nghiệm felodipin<br /> lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống sắc ký<br /> ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Water, phổ 1H-NMR được đo trên máy Bruker<br /> Các hoá chất dùng trong tổng hợp: 2,3Ultrashield 500 (500 MHz).<br /> diclorobenzaldehyd, methyl acetoacetat, ethyl-3Phương pháp tổng hợp<br /> aminocrotonat, ethyl acetoacetat, methyl-3Tổng hợp chất chuẩn tạp A<br /> aminocrotonat, acid nitric, silicagel, N-bromosuccinimid, piperidin, piridin, acetonitril, nKhảo sát khả năng oxi hoá vòng 1,4hexan, methanol, ethanol, isopropyl alcol,<br /> dihydropyridin thành pyridin với 4 tác nhân<br /> diisopropyl ether mua từ Merck được dùng tổng<br /> Oxone,<br /> hợp không qua tinh chế.<br /> Iod, N-bromosuccinamid, HNO3-SiO2(4,3,Error!<br /> Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy<br /> Gallenkamp với nhiệt kế không hiệu chỉnh; đo<br /> phổ tử ngoại (UV) trên máy U-2010<br /> spectrophometer (Hitachi), ghi phổ hồng ngoại<br /> (IR) trên máy FTIR-8201 PC (Shimadzu), định<br /> lượng sản phẩm tổng hợp bằng hệ thống sắc ký<br /> <br /> 444<br /> <br /> Reference source not found.,5)<br /> <br /> để chọn xúc tác phù hợp<br /> <br /> Tổng chất chuẩn tạp B và C<br /> Dựa vào phản ứng Hantzsch gồm 2 giai đoạn:<br /> Giai đoạn 1: Tổng hợp dẫn chất trung gian<br /> benzyliden.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> Giai đoạn 2: Phản ứng đóng vòng Hantzsch<br /> giữa các chất trung gian và benzyliden<br /> aminocrotonat.<br /> Các chất chuẩn tạp A, B và C được tinh khiết<br /> bằng kết tinh trong dung môi methanol và sau<br /> đó triển khai sắc ký cột nhanh với hệ dung môi<br /> thích hợp: các tạp A, B và C được tiến hành chạy<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> sắc kí cột với silica gel 0,2-0,5 μm, pha động gồm<br /> n-hexan:ethylacetat (9:2). Các tạp chất chuẩn<br /> tổng hợp được định tính (phương pháp UV-Vis,<br /> IR) xác định cấu trúc (MS, NMR) và xác định<br /> hàm lượng nước bằng phương pháp chuẩn độ<br /> Karl-Fisher, Định lượng bằng phương pháp sắc<br /> ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)(2).<br /> <br /> Sơ đồ 1. Phản ứng oxi hóa felodipin thành chất chuẩn tạp A<br /> <br /> Sơ đồ 2. Phản ứng Hantzsch dùng điều chế các chất chuẩn tạp B và C<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Tổng hợp chất chuẩn tạp A<br /> Trong bốn tác nhân oxi hoá khảo sát, HNO3SiO2 cho phản ứng nhanh chóng (6 phút), nhẹ<br /> nhàng, ít sản phẩm phụ và tinh khiết dễ dàng<br /> bằng sắc ký cột nhanh(Error! Reference source not found.,6)<br /> <br /> Phổ khối: MA = 382,0 (lý thuyết: công thức<br /> phân tử C19H19Cl2NO4, phân tử lượng 382,24)<br /> Phổ NMR-H1 (500 MHz, CDCl3, δ ppm): xem<br /> Bảng 1.<br /> Bảng 1. Phân tích phổ NMR-H1 của chuẩn tạp A<br /> δ (ppm)<br /> <br /> Dạng<br /> đỉnh<br /> s<br /> t<br /> s<br /> q<br /> dd<br /> t<br /> dd<br /> <br /> Số<br /> Hằng số<br /> Vị trí H<br /> H ghép (J, Hz)<br /> 6H<br /> 2 x pyr-CH3<br /> 3H<br /> COOCH2-CH3<br /> 3H<br /> COOCH3<br /> 2H<br /> COOCH2CH3<br /> 1H<br /> 7,5<br /> Aryl-H (C6’)<br /> 1H<br /> 8,0<br /> Aryl-H (C5’)<br /> 1H<br /> 8,0<br /> Aryl-H (C4’)<br /> <br /> Cho vào bình cầu 4,5 g dung dịch acid nitric<br /> 65% được khuấy với 2 g silicagel trong 10 phút,<br /> chất rắn màu trắng sẽ được tạo ra. Hòa tan<br /> (0,384 g, 1 mmol) felodipin trong 5 ml<br /> dicloromethan, thêm 0,15 g SiO2-HNO3. Hỗn<br /> hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng<br /> khoảng 6 phút, theo dõi phản ứng bằng sắc ký<br /> lớp mỏng (SKLM). Hiệu suất: 60%.<br /> <br /> Tổng hợp chất chuẩn tạp B<br /> <br /> Tạp A là chất dầu màu vàng nhạt, tan trong<br /> aceton, cloroform, diclorometan, ethanol,<br /> methanol, trong tan trong nước, ete, n-hexan.<br /> Phổ UV: 2 đỉnh tại bước sóng 273,5 nm và 234<br /> nm. Phổ IR (υ, cm-1, KBr): 1752 (δN-H); 1705,0 et<br /> 1380,9 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1652 (υC=C), 850,5<br /> (nhân thơm thế tại 1,2,3); 1139,9 (Cl-Ar).<br /> <br /> Cho vào bình cầu dung tích 25 ml hỗn hợp<br /> gồm: 2,3-diclorobenzaldehyd (2,3-DCB, 0,525g,<br /> 3 mmol) hoà tan trong 3 ml isopropanol, methyl<br /> acetoacetat (0,39 g, 4,2 mmol), xúc tác piperidin và<br /> acid acetic với tỉ lệ mol so với 2,3-DCB là 1:5 (tỉ lệ<br /> mol giữa piperidin và acid acetic là 1:5). Hỗn hợp<br /> được đun hồi lưu ở khoảng 50-60 oC trong vòng<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 0,943-0,971<br /> 2,635-2,649<br /> 3,544<br /> 4,000-4,043<br /> 7,063-7,078<br /> 7,179-7,211<br /> 7,457-7,473<br /> <br /> 445<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 4h. Kiểm soát phản ứng bằng phương pháp sắc<br /> ký lớp mỏng. Khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sau<br /> phản ứng gồm nguyên liệu đầu 2,3-DCB, hai<br /> đồng phân E & Z của sản phẩm MBI (methyl<br /> benzyliden intermediate). Vì sự khác nhau về tính<br /> chất vật lý của hai đồng phân: đồng phân E là<br /> tinh thể dạng rắn, trong khi Z ở dạng lỏng, vì thế,<br /> hỗn hợp sau phản ứng được để kết tinh ở 0-5 oC<br /> trong vòng 10-12h. Lọc dưới áp suất giảm, rửa với<br /> 5 ml isopropanol lạnh, và sấy khô để thu được<br /> đồng phân E. Dịch lọc tiếp tục đun nóng ở 60 oC<br /> trong vòng 1 giờ để có sự chuyển từ đồng phân Z<br /> sang đồng phân E, để kết tinh tiếp tục ở 0-5 oC,<br /> trong 10-12 giờ, lọc và gộp 2 phần sản phẩm MBI<br /> chung với nhau.<br /> Cho vào bình cầu dung tích 10 ml 0,273 g (1<br /> mmol) MBI phản ứng với 1,2 mmol 3-methyl<br /> aminocrotonat, xúc tác pyridin, hỗn hợp được<br /> đun hồi lưu trong 2 ml ethanol ở 80 oC trong<br /> vòng 4 giờ. Tỉ lệ pyridin so với MBI là 1:10. Theo<br /> dõi phản ứng bằng SKLM.<br /> Sau phản ứng, ethanol được cất bay hơi dưới<br /> áp suất giảm, sau đó thêm 3 ml CHCl3. Dịch<br /> cloroform được xử lý với dịch acid (6,3 g dd<br /> HClđđ trong 24 ml H2O). Làm khan dịch<br /> cloroform bằng 3 g natri sulfat khan. Bay hơi<br /> dung môi và thêm 3 ml diisopropyl ether. Kết<br /> tinh sản phẩm ở 0 oC trong vòng 10 giờ, lọc và<br /> rửa với diisopropyl ether.<br /> Nhiệt độ nóng chảy: 158-160 oC.<br /> Hấp thu trong vùng tử ngoại (2 đỉnh hấp thu<br /> tại bước sóng 361,5 nm và 241,5 nm với tỷ lệ hấp<br /> thu 0,55). Trên bản mỏng silicagel F254, phát<br /> quang dưới đèn 254 và 365 nm.<br /> Phổ hồng ngoại IR (υ, cm , KBr): 1752 (δN-H);<br /> 1705,0 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1652 (υC=C), 850,5<br /> (nhân thơm được thế ở vị trí 1, 2, 3), 1139,9 (aryl<br /> clorid).<br /> -1<br /> <br /> Phổ IR (υ, cm-1, KBr): 1616 (δN-H), 1367 (υC=O),<br /> 1020,3 (υ C-O), 1616 (υC=C), 866,5 (nhân thơm thế<br /> tại 1,2,3), 1137,9 (Cl-Ar).<br /> Phổ khối : MB = 370,0 (lý thuyết: CTPT:<br /> C17H17Cl2NO4, MB = 370,227).<br /> <br /> 446<br /> <br /> Bảng 2. Phân tích phổ NMR-H1 của chuẩn tạp B<br /> δ (ppm)<br /> 2,312<br /> 3,605<br /> 5,470<br /> 5,686<br /> 7,0467,078<br /> 7,2317,249<br /> 7,2797,297<br /> <br /> Dạng<br /> đỉnh<br /> s<br /> s<br /> s<br /> s<br /> t<br /> <br /> Số H<br /> 6H<br /> 6H<br /> 1H<br /> 1H<br /> 1H<br /> <br /> Hằng số<br /> ghép (J, Hz)<br /> 8<br /> <br /> Vị trí H<br /> 2x (pyr-CH3)<br /> 2x COOCH3<br /> Pyr-H (C4)<br /> Pyr-H (N1)<br /> Aryl-H (C5’)<br /> <br /> dd<br /> <br /> 1H<br /> <br /> 1 và 7,5<br /> <br /> Aryl-H (C6’)<br /> <br /> dd<br /> <br /> 1H<br /> <br /> 1 và 7,5<br /> <br /> Aryl-H (C4’)<br /> <br /> Tổng hợp chất chuẩn tạp C<br /> Do chất trung gian ethyl benziliden không<br /> kết tinh được theo qui trình trên nên phải dùng<br /> natri bisulfit để loại nguyên liệu 2,3-DCB dư.<br /> Sau phản ứng giai đoạn 1, cô quay loại<br /> isopropanol dưới áp suất giảm và hoà tan phần<br /> cắn dạng dầu màu cam trong ethyl acetat và<br /> trung hoà bằng dung dịch NaHCO3 10%. Để loại<br /> vết nguyên liệu đầu 2,3-DCB, dung dịch<br /> NaHSO3 với lượng mol gấp 7,5 lần 2,3-DCB<br /> (0,104 g trong 10 ml nước) được thêm vào dd<br /> ethyl acetat và khuấy trong vòng 2 giờ, sau đó,<br /> chiết bỏ lớp nước và rửa nhiều lần với nước đến<br /> khi không còn 2,3-DCB. Loại bỏ dung môi dưới<br /> áp suất giảm.<br /> Thêm tiếp vào bình cầu 0,75 mmol 3-methyl<br /> aminocrotonat và các xúc tác, dung môi như ở<br /> giai đoạn 2 tổng hợp tạp B ở trên.<br /> Chất rắn màu cam, tan trong aceton,<br /> cloroform, diclorometan, ethanol, methanol,<br /> thực tế không tan trong nước, ete, n-hexan.<br /> Nhiệt độ nóng chảy: 104-106 oC.<br /> Hấp thu trong vùng tử ngoại có 2 đỉnh hấp<br /> thu tại bước sóng 360 nm và 239 nm với tỷ lệ<br /> hấp thu 0,41. Trên bản mỏng silicagel F254, phát<br /> quang dưới đèn 254 và 365 nm.<br /> Độ ẩm : 3,7% (xác định bằng cân đo ẩm độ)<br /> Phổ hồng ngoại IR (υ, cm-1, KBr): 1616 (δNH), 1701,1 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1616 (υC=C), 866,5<br /> (nhân thơm được thế ở vị trí 1, 2, 3), 1137,9<br /> (aryl clorid).<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> Phổ khối: MC = 398,0 (lý thuyết: CTPT:<br /> C19H19Cl2NO4. M = 398,28).<br /> Bảng 3. Phân tích phổ NMR-H1 của chuẩn tạp C<br /> δ (ppm) Dạng Số H<br /> Hằng số<br /> Vị trí H<br /> đỉnh<br /> ghép (J, Hz)<br /> 1,095 t<br /> 6H<br /> 7,5<br /> 2 x pyr-CH3<br /> 1,124<br /> 2,223<br /> s<br /> 6H<br /> 2 xCOOCH2CH3<br /> 3,982 q<br /> 4H<br /> 2 xCOOCH2CH3<br /> 4,024<br /> 5,391<br /> s<br /> 1H<br /> Pyr-H (N1)<br /> 5,682<br /> s<br /> 1H<br /> Aryl-H (C4)<br /> 6,971t<br /> 1H<br /> 8<br /> Aryl-H (C5’)<br /> 7,002<br /> 7,160 dd<br /> 1H<br /> 1 và 8<br /> Aryl-H (C6’)<br /> 7,179<br /> 7,223 dd<br /> 1H<br /> 1 và 8<br /> Aryl-H (C4’)<br /> 7,242<br /> <br /> 20<br /> 30<br /> 40<br /> 50<br /> 60<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> 90<br /> 85<br /> 80<br /> 75<br /> 70<br /> <br /> 10<br /> 15<br /> 20<br /> 25<br /> 30<br /> <br /> Trên sắc ký đồ 3 chiều, ta thấy mẩu thử khá<br /> tinh khiết mặc dù quan sát ở bước sóng thấp 210<br /> nm nhưng chỉ phát hiện những đỉnh rất nhỏ và<br /> chiếm tỉ lệ không đáng kể.<br /> Chuẩn tạp A không phát hiện bất kỳ đỉnh<br /> phụ nào sơ bộ kết luận độ tinh khiết của chất<br /> chuẩn tạp A về mặt sắc ký đạt 100%.<br /> <br /> Xác định mức độ tinh khiết của các chất<br /> Các chất được kiểm tra độ tinh khiết bằng<br /> SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau và tất cả<br /> đều cho 1 vết sản phẩm<br /> Phương pháp HPLC với cột pha đảo<br /> <br /> Phenominex C18, detector PDA, bước sóng<br /> phát hiện từ 210 nm đến 400 nm(2)<br /> Chuẩn bị mẫu thử:<br /> Cân chính xác khoảng 10 mg tạp A sau<br /> khi đã tinh chế bằng SKC và hòa tan vào 25<br /> ml acetonitril. Tạp B, C (cân chính xác<br /> khoảng 2 mg hoà tan trong 10 ml acetonitril)<br /> Điều kiện tiến hành:<br /> Cột pha đảo: Phenomenex Luna C18 4,6 x<br /> 250 mm; Kích thước hạt pha tĩnh: 5μm; Thể tích<br /> bơm mẫu: 10 μl; Tốc độ dòng: 1 ml/1 phút.<br /> Chế độ chạy gradient trong 60 phút với hệ<br /> pha động thay đổi như sau:<br /> Bảng 4. Hệ pha động sử dụng để xác định độ tinh<br /> khiết của các chất chuẩn tạp A, B, C<br /> Thời gian (min.)<br /> 0<br /> 10<br /> <br /> Acetonitril (%)<br /> 100<br /> 95<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nước (%)<br /> 0<br /> 5<br /> <br /> Hình 2. Sắc ký đồ HPLC của chuẩn tạp A<br /> Chuẩn tạp B có một tỷ lệ nhỏ tạp chất<br /> (1,86%) => Độ tinh khiết về mặt sắc ký đạt<br /> 98,14%.<br /> <br /> 447<br /> <br />