Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn chọn lọc

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ CAFEIN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH<br /> TRONG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN CHỌN LỌC<br /> Nguyễn Như Quỳnh*, Phan Văn Hồ Nam*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Polymer đóng dấu phân tử như một thụ thể nhân tạo, có tính chọn lọc cao, rất hiệu quả trong<br /> việc tách và phân tích các mẫu phức tạp, như dịch sinh học hoặc môi trường. Nhằm góp phần nhân rộng kỹ<br /> thuật đóng dấu phân tử tại Việt Nam, đề t|i “Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein để định hướng<br /> ứng dụng l|m pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn chọn lọc” được thực hiện, với đối tượng cafein, một<br /> alkaloid với nhiều tác dụng sinh học, được chọn là phân tử mẫu.<br /> Mục tiêu: Khảo sát phản ứng tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-MIP) có cỡ hạt nano<br /> có khả năng lưu giữ thuận nghịch cafein.<br /> Đối tượng Cafein-MIP có khả năng hấp phụ thuận nghịch cafein.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp cafein-MIP bằng phương ph{p kết tủa trong dung môi. Khảo sát<br /> khả năng rửa giải và tái hấp phụ cafein của polymer bằng phương ph{p quang phổ UV-Vis và HPLC.<br /> Kết quả: Cafein-MIP dạng hạt được tổng hợp có kích thước khoảng 500 nm, hình cầu, tương đối đồng<br /> đều. Khảo sát các tỷ lệ khác nhau giữa acid methacrylic và 4-vinyl pyridine cho thấy khả năng đóng dấu<br /> cafein tăng khi tăng h|m lượng 4-vinyl pyridine trong công thức, tuy nhiên nồng độ acid cao lại làm giảm<br /> hiệu quả đóng dấu. Với tỷ lệ 1:1, hiệu quả đóng dấu của cafein-MIP gấp 6,8 lần so với polymer không đóng<br /> dấu (NIP).<br /> Kết luận: Đề tài lần đầu tiên tổng hợp được cafein-MIP với cỡ hạt bằng nano có khả năng lưu giữ<br /> thuận nghịch cafein với hiệu quả đóng dấu phân tử cao.<br /> Từ khóa: Polymer đóng dấu phân tử cafein, chiết pha rắn chọn lọc<br /> <br /> ABSTRACT<br /> SYNTHESIS OF CAFFEINE-IMPRINTED POLYMER, DIRECTED<br /> AS THE SORBENT FOR SELECTIVE SOLID-PHASE EXTRACTION<br /> Nguyen Nhu Quynh, Phan Van Ho Nam<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 204 - 209<br /> Introduction: Molecularly imprinted polymer is considered as artificial receptors with high selectivity<br /> and affinity, that could be used for analyse of sophisticated samples such as biological fluid and<br /> environmental ones. To expand the application of this novel method in Vietnam, the study "Synthesis of<br /> caffeine-imprinted polymer, directed as the sorbent for selective solid phase extraction" was conducted in<br /> which caffeine, an alkaloid having many biological activities, was selected as a template for polymerization<br /> reaction.<br /> Objectives: Investigating the synthesis of caffeine-imprinted polymer (cafeine-MIP) particles in nano<br /> size that is able to retain caffeine reversibly.<br /> <br /> *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS. Phan Văn Hồ Nam<br /> ĐT: 0909615007<br /> <br /> 204<br /> <br /> Email: phanvanhonam@ump.edu.vn<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Subjects: cafeine-MIP with ability of reversible caffeine absorption.<br /> Study methods: Synthesis of polymer particles based on precipitation method. Study on convertible<br /> holding capacity of caffeine-MIP by using UV-Vis and HPLC methods.<br /> Results: The spherical caffeine-MIP particles with approximately 500 nm size and relatively uniform<br /> was successfully synthesized. Surveying the various ratios between methacrylic acid and 4-vinyl pyridine<br /> showed that the imprinted efficiency was increased by rising the concentration of 4-vinyl pyridine in the<br /> formula, and was reduced by high acid content. In case of 1:1 rate, caffeine-MIP can hold caffeine than 6.8<br /> times the NIP (non-imprinted polymer).<br /> Conclusions: The caffeine-MIP particles in nano size with reversibly and high imprinted efficiency<br /> was first time synthesized.<br /> Keywords: Caffeine-imprinted polymer, selective solid-phase extraction<br /> trong tƣơng lai. Chính vì vậy, đề t|i “Tổng<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> hợp polymer đóng dấu phân tử cafein định<br /> Năm 1930, những nghiên cứu đầu tiên về<br /> hƣớng ứng dụng l|m pha tĩnh trong kỹ thuật<br /> kĩ thuật đóng dấu phân tử đƣợc công bố(3). Từ<br /> chiết pha rắn tách cafein có tính chọn lọc cao”<br /> đó đến nay, kĩ thuật này ngày càng phát triển<br /> đƣợc thực hiện nhằm góp phần nhân rộng kỹ<br /> mạnh mẽ và chứng minh tính ứng dụng cao<br /> thuật này, giúp tiết kiệm thời gian, chi phí,<br /> của mình trong những ngành khoa học khác<br /> công sức, không chỉ trong công tác kiểm<br /> nhau. Polymer đóng dấu phân tử (MIP –<br /> nghiệm cafein m| còn trong c{c lĩnh vực khác.<br /> Molecular Imprinting Polymer) đƣợc hình<br /> ĐỐI TƢỢNG– PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> thành dựa trên kĩ thuật đóng dấu phân tử MIT<br /> (Molecular Imprinting Technology), trong đó<br /> Đối tƣợng nghiên cứu<br /> một phức hợp đƣợc hình thành giữa mẫu<br /> Cafein-MIP.<br /> (chất khảo sát – template) và monomer chức<br /> Chất đối chiếu<br /> năng trong dung môi của phản ứng polymer.<br /> Cafein khan (số lô 394541AX20, xuất xứ<br /> Cho mẫu, monomer, chất liên kết chéo (crossGermany, h|m lƣợng 99,92%).<br /> linker), tác nhân mồi phản ứng vào ống<br /> Hóa chất – dung môi<br /> nghiệm, sau phản ứng một mạng lƣới polymer<br /> không gian ba chiều đƣợc hình thành. Tiếp<br /> Dung môi, hóa chất thuốc thử đạt độ tinh<br /> theo, mẫu đƣợc rửa giải khỏi polymer để lại<br /> khiết tùy mục đích sử dụng: Dung môi tổng<br /> những “lỗ hổng” với hình dạng, kích thƣớc và<br /> hợp, rửa giải polymer, pha chế dung dịch:<br /> chức năng hóa học phù hợp với phân tử chất<br /> ethanol, methanol, acid acetic, cloroform, nkhảo sát. Kết quả, polymer nhận diện và gắn<br /> butanol, n-hexan, diethyl ether, xuất xứ Trung<br /> một cách có chọn lọc với mẫu(2,4,5). Chúng rất<br /> Quốc; Hóa chất tổng hợp polymer: acid<br /> hữu ích cho việc phân tích các mẫu phức tạp<br /> metacrylic (MAA), 4-vinylpyridin (4-VP),<br /> nhƣ dịch sinh học và mẫu môi trƣờng. Ở Việt<br /> ethylen glycol dimethylacrylate (EDMA),<br /> Nam, kỹ thuật này vẫn còn khá mới lạ. Bên<br /> azobisisobutyronitril (AIBN) (Aldrich-sigma);<br /> cạnh đó, cafein l| một alkaloid phổ biến trong<br /> Dung môi sắc ký lỏng: MeOH (J.T.Baker), acid<br /> cuộc sống, ngƣời ta hầu nhƣ dễ dàng bắt gặp<br /> acetic băng (Merck).<br /> các chế phẩm có cafein trên thị trƣờng. Cafein<br /> Trang thiết bị<br /> có tác dụng g}y hƣng phấn thần kinh, lợi tiểu,<br /> Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> giãn nở phế quản(1). Cafein đƣợc chọn làm<br /> Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang<br /> phân tử mẫu trong nghiên cứu n|y để từ đó<br /> 2996 (Waters, Mỹ). Cân phân tích Sartorius CP<br /> phát triển hơn kỹ thuật đóng dấu phân tử<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> 205<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 224D (Sartorius, Đức), m{y đo quang phổ tử<br /> ngoại khả kiến UV-Probe 2550 (Shimadzu –<br /> Nhật)<br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> <br /> Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein<br /> (cafein-imprinted polymer - cafein-MIP) và<br /> polymer trắng (non-imprinted polymer NIP)<br /> Pha các dung dịch Cafein mẹ nhƣ sau: DD<br /> C1: 5 mg /ml cafein trong aceton, DD C2: 5<br /> mg/ml cafein trong acetonitril, DD C3: 5<br /> Bảng 1: Công thức thành phần tổng hợp polymer<br /> Thành phần<br /> DD C1 (µl)<br /> DD C2 (µl)<br /> DD C3 (µl)<br /> EDMA (mg)<br /> MAA (mg)<br /> 4-VP(mg)<br /> AIBN (µl)<br /> Aceton (ml)<br /> ACN (ml)<br /> Cloroform (ml)<br /> Acid acetic (µl)<br /> NaOH 0,1N (µl)<br /> <br /> B1<br /> 200<br /> 160<br /> 14<br /> 35<br /> 1<br /> -<br /> <br /> B2<br /> 200<br /> 160<br /> 14<br /> 35<br /> 1<br /> -<br /> <br /> B3<br /> 200<br /> 160<br /> 14<br /> 35<br /> 1<br /> -<br /> <br /> B4<br /> 200<br /> 140<br /> 35<br /> 35<br /> 1<br /> -<br /> <br /> Tạo hạt<br /> Sau khi tổng hợp polymer đến trạng thái<br /> gel, lấy 500 µl polymer dạng gel này cho vào<br /> ống nghiệm có nắp đậy. Thêm vào ống<br /> nghiệm 5 ml ethanol. Khuấy trong 4 giờ trên<br /> bếp từ. Sau đó đem ly t}m với tốc độ 5000<br /> vòng/phút trong 5 phút, thu lấy cắn.<br /> Kiểm tra sự lưu giữ cafein của cafein-MIP<br /> dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ<br /> UV-Vis và HPLC (Sơ đồ 1)<br /> Hạt polymer (MIP hoặc NIP) sau khi tổng<br /> hợp theo công thức B7, B8, B9, B11 (Bảng 1)<br /> đƣợc rửa sạch cafein với dung môi thích hợp<br /> bằng cách cho vào ống nghiệm 5 ml dung môi<br /> rủa giải, đậy nắp ống nghiệm, lắc rung trong 2<br /> phút, để lắng trong 1 phút v| đem ly t}m với<br /> tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch thu<br /> đƣợc pha loãng thành 25 ml. Tiến h|nh đo<br /> quang để kiểm tra sự hiện diện của cafein.<br /> Quy trình đƣợc thực hiện với dung môi rửa<br /> <br /> 206<br /> <br /> mg/ml cafein trong cloroform. Thực hiện tổng<br /> hợp MIP theo các công thức kh{c nhau nhƣ<br /> Bảng 1. Cho các thành phần vào eppendorf,<br /> lắc rung hỗn hợp trên trong 10 gi}y. Sau đó<br /> cách thủy hỗn hợp ở 74 oC cho đến khi hỗn<br /> hợp hình thành trạng thái gel, ngay lập tức lắc<br /> rung hỗn hợp trong 30 giây. Với mỗi công<br /> thức MIP, thực hiện tổng hợp NIP song song<br /> để đối chiếu trong đó th|nh phần tổng hợp<br /> tƣơng ứng không có dung dịch cafein.<br /> <br /> B5<br /> 200<br /> 120<br /> 50<br /> 35<br /> 1<br /> -<br /> <br /> B6<br /> 200<br /> 140<br /> 35<br /> 40<br /> 1<br /> -<br /> <br /> B7<br /> 200<br /> 150<br /> 30<br /> 10<br /> 35<br /> 0,4<br /> -<br /> <br /> B8<br /> 200<br /> 150<br /> 20<br /> 20<br /> 35<br /> 0,4<br /> -<br /> <br /> B9<br /> 200<br /> 150<br /> 10<br /> 30<br /> 35<br /> 0,4<br /> 20<br /> -<br /> <br /> B10<br /> 200<br /> 160<br /> 40<br /> 35<br /> 0,4<br /> 20<br /> <br /> B11<br /> 200<br /> 160<br /> 40<br /> 35<br /> 0,4<br /> -<br /> <br /> giải methanol, thu đƣợc dung dịch A, dung<br /> môi rửa giải methanol – acid acetic (9:1) thu<br /> đƣợc dung dịch B.<br /> <br /> Sơ đồ 1: Quy trình kiểm tra sự lưu giữ cafein của<br /> cafein-MIP dạng hạt sử dụng phương ph{p quang<br /> phổ UV-Vis và HPLC<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> Tái hấp phụ cafein: cho 1ml dung dịch<br /> cafein pha trong ACN có nồng độ 1 mg/ml vào<br /> hạt polymer đã rửa sạch ở trên (MIP hoặc<br /> NIP). Lắc rung trong 2 phút, để ổn định 1 phút<br /> rồi đem ly t}m. Tiếp tục cho vào cắn trên 5 ml<br /> dung dịch methanol, lắc rung trong 2 phút, để<br /> ổn định 1 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong<br /> 10 phút. Thực hiện 3 lần, gộp các dịch thu<br /> đƣợc pha loãng bằng methanol thành 25 ml<br /> (dung dịch C). Cho 4 ml dung dịch methanolacid (9:1) cắn còn lại. Lắc rung trong 2 phút, để<br /> lắng 1 phút rồi đem ly t}m 5000 vòng/phút<br /> trong 10 phút. Lặp lại bƣớc trên 3 lần nữa. Sau<br /> đó, gộp các dịch thu đƣợc pha loãng với<br /> methanol-acid (9:1) thành 25 ml (dung dịch D).<br /> Lọc các dung dịch A, B, C, D thu đƣợc qua<br /> màng lọc 0,45 µm, tiến h|nh định lƣợng cafein<br /> bằng phƣơng ph{p sắc kí lỏng hiệu năng cao<br /> (HPLC).<br /> Quy trình ph}n tích HPLC để x{c định nồng<br /> độ cafein trong dịch rửa giải sử dụng c{c điều<br /> kiện sắc ký là: Cột sắc kí CC 125/4 Nucleosil 1005C18 (125 × 4 mm, 5 µm); Pha động l| Nƣớc methanol - acid acetic (69:28:3); Nhiệt độ cột là<br /> 45oC; Tốc độ dòng 1ml/phút; Thể tích tiêm mẫu<br /> 10 µl; Bƣớc sóng phát hiện 273 nm. Quy trình đã<br /> đƣợc kiểm tra tính tƣơng thích hệ thống và thẩm<br /> định đạt yêu cầu ph}n tích định lƣợng theo<br /> hƣớng dẫn của ICH.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein<br /> (cafein-imprinted polymer - cafein-MIP) và<br /> polymer trắng (non-imprinted polymer NIP)<br /> Quan sát cảm quan hạt MIP/NIP thu đƣợc<br /> từ các công thức B1, B2, B3, hạt polymer tạo<br /> thành trong dung môi cloroform trong suốt<br /> không màu, hầu nhƣ không thể quan s{t đƣợc<br /> điểm gel của phản ứng. Bên cạnh đó cafein tan<br /> trong acetonitril tốt hơn trong aceton, nên<br /> dung môi acetonitril đƣợc chọn làm dung môi<br /> phản ứng polymer (công thức B2). Nồng độ<br /> AIBN trong MIP càng cao, thời gian tổng hợp<br /> càng nhanh. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ<br /> AIBN lên quá cao, polymer sẽ đông khối trƣớc<br /> khi kịp cho vào dung môi tạo hạt. Do đó, công<br /> thức B4 phù hợp hơn so với B6. So sánh công<br /> thức B2, B4, B5 có tỷ lệ chất liên kết chéo monomer (EDMA - MAA) kh{c nhau. Lƣợng<br /> chất liên kết chéo càng lớn, hạt càng to, không<br /> đồng đều, tủa nhanh chóng và vón cục, tuy<br /> nhiên nếu hạt nhỏ quá sẽ không phù hợp nhồi<br /> cột SPE. Vậy nên tỷ lệ EDMA - monomer<br /> trong công thức đƣợc chọn là 80:20 (công thức<br /> B4). Sự hiện diện của NaOH làm phản ứng<br /> polymer hóa kéo dài trên 24 giờ. Vậy cuối<br /> cùng chỉ có các công thức B7, B8, B9, B11 đƣợc<br /> sử dụng để khảo sát khả năng lƣu giữ của<br /> cafein-MIP.<br /> <br /> Tạo hạt<br /> <br /> Hình 1: Hình dạng hạt dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100x, mỗi vạch nhỏ nhất trên thước trắc vi tương<br /> ứng 400 nm<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> 207<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Polymer ở dạng gel đƣợc kết tủa trong<br /> ethanol, thu đƣợc các hạt nhỏ có kính thƣớc<br /> h|ng micromet khi quan s{t dƣới kính hiển vi<br /> có độ phóng đại 100x (Hình 1)<br /> Kiểm tra sự lƣu giữ cafein của polymer sử<br /> dụng quang phổ UV-Vis<br /> Sau khi tổng hợp MIP và NIP rồi tạo hạt<br /> với ethanol, tiến hành rửa giải với lần lƣợt<br /> các dung môi theo thứ tự: n-butanol,<br /> isopropanol, ethanol, methanol, methanolacid acetic (9:1) rồi đo quang phổ UV-Vis ta<br /> thu đƣợc kết quả nhƣ Bảng 2. Kết quả cho<br /> thấy sau khi dùng n-butanol rửa giải<br /> cafein, các dung môi phân cực hơn không<br /> thể rửa giải nốt lƣợng cafein còn lƣu giữ<br /> trong cafein-MIP ngoại trừ hỗn hợp<br /> methanol-acid acetic (9:1). Hiện tƣợng sảy<br /> ra tƣơng tự khi tiến hành tái hấp thu<br /> cafein. Tuy nhiên khi tái hấp thu, NIP cho<br /> kết quả tƣơng tự MIP.<br /> Bảng2: Kiểm tra sự lưu giữ cafein của polymer<br /> dạng hạt sử dụng phương ph{p quang phổ UV-Vis<br /> (kết quả được trình bày theo MIP/NIP của từng<br /> công thức tương ứng)<br /> B7<br /> B8<br /> Dung môi tạo hạt<br /> +/+/n-butanol<br /> +/+/Isopropanol<br /> -/-/Ethanol<br /> -/-/Methanol<br /> -/-/Methanol-acid (9:1)<br /> +/+/Tái hấp phụ cafein<br /> n-butanol<br /> +/+<br /> +/+<br /> Iso propanol<br /> -/-/Ethanol<br /> -/-/Methanol<br /> -/-/Methanol-acid (9:1)<br /> +/+<br /> -/-<br /> <br /> B9<br /> +/+/-/-/-/+/-<br /> <br /> B11<br /> +/+/-/-/-/+/-<br /> <br /> +/+<br /> -/-/-/+/+<br /> <br /> +/+<br /> -/-/-/-/-<br /> <br /> Chú thích: (+) l| dương tính, có hiện diện cafein, (-) là<br /> âm tính, không có hiện diện cafein<br /> <br /> Kiểm tra sự lƣu giữ cafein của polymer sử<br /> dụng phƣơng pháp HPLC<br /> Lƣợng cafein trong các dịch rửa giải<br /> MIP/NIP ở c{c giai đoạn kh{c nhau đƣợc trình<br /> bày trong Bảng 4.<br /> <br /> 208<br /> <br /> Bảng 3: Lượng cafein (mg) thu hồi trong các dịch<br /> rửa giải MIP/NIP ở c{c giai đoạn khác nhau với<br /> lượng cafein thêm vào mỗi giai đoạn là 1 mg.<br /> B 11<br /> B7<br /> B8<br /> B9<br /> Dung<br /> dịch MIP NIP<br /> MIP NIP<br /> MIP NIP<br /> MIP NIP<br /> A 0,6144 0 0,3846 0 0,6351 0 0,5612 0<br /> B 0,0031 0<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> 0 0,0000 0<br /> C 0,9127 0,9199 0,9234 0,9222 0,7141 0,7359 0,7317 0,6294<br /> D 0,0015 0,0017 0<br /> 0 0,0040 0,0006 0<br /> 0<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Từ kết quả Bảng 3 cho thấy, khi dùng<br /> methanol để rửa giải, polymer B7 và B9 không<br /> có khả năng lƣu giữ cafein, trong khi polymer<br /> B8 và B11 chỉ bị rửa giải thêm bởi hỗn hợp<br /> methanol-acid acetic (9:1). B11 với monomer<br /> chỉ gồm acid methacrylic có thể đã tạo liên kết<br /> hydro với cafein nên cả MIP v| NIP đều có thể<br /> lƣu giữ cafein, lƣợng cafein còn lại chƣa đến<br /> 9%, tuy nhiên không có sự khác biệt, nhƣ vậy,<br /> liên kết này yếu hoặc quá ít nên việc đóng dấu<br /> không thành công.<br /> B8 là công thức giúp polymer có khả năng<br /> lƣu giữ thuận nghịch cafein. So sánh công<br /> thức của B8 với 3 công thức còn lại, sự khác<br /> biệt có thể đến từ h|m lƣợng tổng cộng của<br /> acid là thấp nhất. Nhƣ vậy có thể nhóm chức –<br /> COOH của acid methacrylic và acid acetic cản<br /> trở hình thành ái lực giữa polymer và cafein.<br /> B8 với monomer gồm acid methacrylic và<br /> 4-VP có 2 nhóm chức khác nhau là –COOH và<br /> nhóm pyridin có khả năng tƣơng hỗ tốt hơn<br /> để tạo ái lực tốt hơn với cafein, vốn là một<br /> base hữu cơ rất yếu, do vậy B8 lƣu giữ đƣợc<br /> nhiều cafein hơn, v| tạo là sự khác biệt giữa<br /> MIP và NIP, MIP có thể giữ cafein gấp 6,8 lần<br /> so với NIP (0,40% so với 0,06%). Hiệu quả<br /> đóng dấu phân tử này là rất cao so với các tài<br /> liệu tham khảo tìm thấy. Tuy nhiên ái lực này<br /> quá cao khiến cho cafein không thể rửa giải<br /> hoàn toàn với dung môi methanol-acid acetic<br /> (9:1). Tổng lƣợng cafein thu hồi đƣợc chỉ vào<br /> khoảng 70% so với 90% của B11.<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br />