zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Tổng hợp và chuyển cấu trúc microrna nhân tạo vào cây đậu nành (Glycine max L.)

Chia sẻ: Lý Mân Hạo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Báo xấu

20
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của nghiên cứu là tổng hợp microRNA nhân tạo có khả năng bất hoạt gene Minc14137. Cấu trúc microRNA này được chèn vào vector biểu hiện và chuyển vào cây đậu nành bằng vi khuẩn A. tumefaciens nhằm tìm hiểu chức năng của effector MINC14137 trong tiến trình ký sinh thực vật của tuyến trùng sưng rễ thông qua con đường làm câm lặng gene bởi cây chủ (HIGS). Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tổng hợp và chuyển cấu trúc microrna nhân tạo vào cây đậu nành (Glycine max L.)

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học TỔNG HỢP VÀ CHUYỂN CẤU TRÚC microRNA NHÂN TẠO VÀO CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) Hà Thị Trúc Mai, Đặng Lê Trâm, Nguyễn Thế Phương, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Nguyễn Vũ Phong* Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: nvphong@hcmuaf.edu.vn TÓM TẮT Effector là các protein cụ thể được tuyến trùng tiết vào trong tế bào thực vật, tạo thuận lợi cho quá trình ký sinh cây chủ. Bất hoạt các effector này làm giảm khả năng ký sinh của tuyến trùng và giúp hạn chế tác hại do tuyến trùng gây ra. Gene Minc14137 mã hóa cho một effector chưa rõ chức năng được tạo dòng từ tuyến trùng Meloidogyne incognita. Mục tiêu của nghiên cứu là tổng hợp microRNA nhân tạo có khả năng bất hoạt gene Minc14137. Cấu trúc microRNA này được chèn vào vector biểu hiện và chuyển vào cây đậu nành bằng vi k�� A. tumefaciens nhằm tìm hiểu chức năng của effector MINC14137 trong tiến trình ký sinh thực vật của tuyến trùng sưng rễ thông qua con đường làm câm lặng gene bởi cây chủ (HIGS). Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, htpII, nốt lá mầm, microRNA, PCR overlapping. CONSTRUCTION AND TRANSFORMATION AN ARTIFICIAL microRNA STRUCTURE TO SOYBEAN (Glycine max L.) Ha Thi Truc Mai, Dang Le Tram, Nguyen The Phuong, Nguyen Thi Ngoc Loan, Nguyen Vu Phong* Nong Lam University Ho Chi Minh City *Corresponding Author: nvphong@hcmuaf.edu.vn ABSTRACT Effectors are specific proteins secreted by nematodes into plant cells that facilitate their parasitism to host plants. Inactivation of these effectors reducing the parasitic ability of nematodes on plants to help reduce the damage caused by nematodes. Gene Minc14137 encodes an effector unknown function that is cloned from the Meloidogyne incognita. The objective of the study was to synthesize artificial microRNAs capable of inactivating gene Minc14137. This microRNA structure was inserted into an expression vector in soybean by A. tumefaciens to investigate the function of effector MINC14137 in the parasitic process of root- knot nematode via gene silencing by host plant (HIGS). Keywords: Agrobacterium tumefaciens, htpII, cotyledonary node, microRNA, PCR overlapping. TỔNG QUAN chế được nhiều tổn thất do tuyến trùng gây ra. Đậu nành (Glycine max (L.)) là một trong Trong nghiên cứu này, gene Minc14137 mã những cây trồng mang lại giá trị kinh tế cao. hóa cho một effector chưa rõ chức năng, tạo Những năm gần đây, sản lượng đậu nành ngày dòng từ tuyến trùng M. incognita, được sử càng giảm mạnh do tuyến trùng gây hại. Việc sử dụng làm dữ liệu để tổng hợp microRNA nhân dụng hóa chất kiểm soát tuyến trùng mặc dù có tạo có khả năng bất hoạt gene này. Cấu trúc hiệu quả nhưng lại ảnh hưởng lớn đến môi microRNA sau đó được chèn vào vector biểu trường và sức khỏe con người. Vì vậy, bên cạnh hiện và chuyển vào cây đậu nành DT22 bằng các phương pháp sinh học truyền thống, việc tìm vi khuẩn A. tumefaciens. kiếm một phương pháp mới, thân thiện với môi trường đang được quan tâm nghiên cứu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN (Nguyễn Vũ Phong, 2018). Tuyến trùng tiết ra CỨU các effector tạo thuận lợi cho quá trình ký sinh Thiết kế và tổng hợp miRNA nhân tạo cây chủ. Bất hoạt các effector này làm giảm Trình tự gene Minc14137 của dòng tuyến khả năng ký sinh của tuyến trùng, từ đó hạn trùng Mi-PN03, độ tương đồng đến 95% với 90
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học cDNA của tuyến trùng M. incognita trên (đồng nuôi cấy mẫu và vi khuẩn trong 4 hoặc GenBank (ID: AW441106.1), được sử dụng 6 ngày) ở 25oC, trong điều kiện ánh sáng mờ. để thiết kế các miRNA nhân tạo nhờ phần Để loại bỏ vi khuẩn trên mẫu đã lây nhiễm, mềm WMD3 (Cấu trúc amiRNA mục tiêu rửa mẫu bằng 50 ml môi trường tạo chồi có bổ được chọn dựa theo các tiêu chí đề xuất bởi sung kháng sinh cefotaxime 100 mg/l, Schwab và ctv 2006). Công cụ Oligo của phần vancomycin 50 mg/l, timentin 50 mg/l. Thời mềmWMD3 được sử dụng để thiết kế các gian rửa mẫu 2 - 3 phút. Mẫu sau rửa được cấy primer thay thế đoạn 21 nu của precursor ath- nghiêng một góc 45o trên môi trường thanh lọc mi319a bởi đoạn miRNA 21 nu mới nhờ kỹ có chứa cefotaxime 100 mg/l, timentin 50 thuật PCR overlapping. Cấu trúc amiRNA sau mg/l. đó được nhân dòng bởi vector pJET1.2/blunt Chọn lọc và kiểm tra chồi giả định chuyển (Thermo Scentific) và giải trình tự nhằm đảm gene bảo tính chính xác trước khi gắn vào vector Sau 14 ngày trên môi trường thanh lọc, mẫu biểu hiện. được chuyển sang môi trường tạo chồi có bổ Gắn cấu trúc amiRNA vào vector biểu hiện sung tác nhân chọn lọc hygromycin với nồng Đoạn miR319a trong vector pSM103 (Melito độ 5 mg/l. Sau 28 ngày, tiếp tục chuyển mẫu và ctv, 2010) được thay thế bằng đoạn trình tự sang môi trường chọn lọc có nồng độ 10 mg/l amiRNA tổng hợp được. Vector pSM103 và hygromycin để xác định chồi chuyển gene. đoạn amiRNA được xử lý bằng enzyme cắt Chồi giả định chuyển gene được tách chiết BamHI và PstI (Thermo Scientific) và nối với DNA bằng hóa chất theo phương pháp của nhau nhờ enzyme T4 DNA ligase (Thermo Doyle và Doyle (1990), đo OD để xác định Scientific) để tạo vector tái tổ hợp. Vector tái nồng độ và độ tinh sạch trước khi thực hiện tổ hợp pSM103-amiRNA được tạo dòng trong phản ứng PCR, sử dụng cặp primer HptII-F tế bào E. coli TOP10 khả biến bằng phương (5’-CAGCGAGAGCCTGACCTATTGC-3’) pháp sốc nhiệt, sau đó biến nạp vào vi khuẩn và primer HptII-R (5’- A. tumefaciens LBA4404 để chuyển cấu trúc GCCATCGGTCCAGACGGCCCGCGC-3’) amiRNA vào cây chủ. khuếch đại gene hptII kháng hygromycin có Chuẩn bị lá mầm đậu nành DT22 trên cấu trúc plasmid. Hạt được khử trùng theo quy trình khử mẫu của Trần Thị Cúc Hòa (2008). Chuẩn bị mẫu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN lá mầm đậu nành theo quy trình của Phan Lê Thiết kế và tổng hợp miRNA nhân tạo Tư và ctv (2018): đậu nành (5 - 7 ngày) được Từ danh sách các amiRNA gợi ý, amiRNA ứng giữ lại phần trụ hạ diệp cách nốt lá mầm viên được chọn theo các tiêu chí: 1) bất hoạt khoảng 3 - 5 mm, đồng thời dùng dao tạo 3 - gene mục tiêu ở tuyến trùng mà không bất hoạt 4 vết thương tại mặt trong vị trí trụ hạ diệp tiếp các gene khác của đậu nành; 2) vị trí gắn của giáp lá mầm. miRNA nhân tạo với mRNA mục tiêu nằm ở Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens vùng 3’; 3) năng lượng liên kết giữa amiRNA LBA4404 với mRNA mục tiêu từ -35 đến -40 kcal/mol, Chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 không quá -30 kcal/mol; 4) không bắt cặp sai mang vector pSM103-amiRNA được nuôi từ vị trí 2 - 12 của amiRNA đối với đoạn mục trên môi trường YEB rắn (An và ctv, 1988) bổ tiêu. Trong nghiên cứu này, microRNA nhân sung 50 mg/l kanamycin ở 28oC trong 48 giờ. tạo được chọn ký hiệu là amiR14137, có trình Khuẩn lạc đơn phát triển tốt được tăng sinh tự 5’-UAACUAUAAUCUAGGGCACGU-’3 trong môi trường YEP lỏng chứa 50 mg/l được tổng hợp theo quy trình miêu tả bởi kanamycin ở 28oC đến khi OD600 đạt 1,0 - 1,2. Schwab và ctv (2006), precursor mang cấu trúc Tiến hành thu sinh khối vi khuẩn và pha loãng amiRNA được tổng hợp có kích thước khoảng trong môi trường IM lỏng thành dạng huyền 428 bp. Cấu trúc precursor mang amiR14137 phù. được tạo dòng nhờ vector pJET1.2/blunt trong Đồng nuôi cấy và tái sinh chồi đậu nành tế bào E. coli TOP10 và sàng lọc bằng PCR Mẫu nốt lá mầm được ngâm với dịch huyền khuẩn lạc. Plasmid tái tổ hợp của 3 dòng vi phù vi khuẩn trong 30 phút. Mẫu sau nhiễm khuẩn ngẫu nhiên được tách chiết và giải trình được thấm khô và đặt úp lên môi trường CCM tự với primer pJET1.2-F. Kết quả sau hiệu đính 91
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học cho thấy cấu trúc amiR14137 có chiều dài và bp và một đoạn 2974 bp. Trên thực tế, kết quả trình tự đúng với dự tính. điện di sản phẩm cắt vector pSM103 cho một Tạo vector biểu hiện cấu trúc amiRNA băng có kích thước lớn hơn 10 kb và một băng Theo lí thuyết, pSM103 sau khi cắt tạo sản tương đương 400 bp, plasmid pJET1.2/blunt- phẩm gồm hai đoạn có kích thước lần lượt là amiR14137 cho một băng có kích thước gần 3 412 bp và khoảng 12 kb; trong khi kb và một băng hơn 400 bp (Hình 1). pJET1.2/blunt-amiR14137 cho một đoạn 428 Hình 1. Kết quả cắt vector (a) pSM103 và (b) pJET1.2-amiR14137. (M): DNA marker 1 kb; (1): plasmid; (2): cắt bằng BamHI và PstI Vector pSM103 mở vòng và đoạn amiR14137 sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc (Hình 2). Kết được thu hồi từ gel agarose bằng GeneJET Gel quả đã tạo dòng thành công amiRNA trong vi Extraction Kit (Thermo Scientific) và tái tổ khuẩn E. coli. Cấu trúc này được thu nhận, hợp bằng enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens nối sau đó được biến nạp vào tế bào khả nạp LBA4404 kanamycin và áp dụng tạo cây đậu E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. nành chuyển gene. Các dòng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp được Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR sàng lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp (M): DNA marker 100 bp; (1-10): các k�� Đồng nuôi cấy và tái sinh chồi bào thực vật. Mẫu trên môi trường đồng nuôi Trong quá trình chuyển gene thông qua vi cấy đã cảm ứng (phình to, mép lá cong lên khuẩn A. tumefaciens, đồng nuôi cấy là giai khỏi mặt tiếp xúc với môi trường). Trên môi đoạn vi khuẩn thực hiện cơ chế chuyển đoạn trường thanh lọc và tái sinh chồi từ vị trí vết T-DNA vào tế bào. Quá trình này ảnh hưởng thương đã tạo mẫu tái sinh từ 1 - 2 chồi mỗi rất lớn đến khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn chồi có chiều cao từ 1 - 2 cm, chồi có màu và kết quả của quá trình chuyển gene vào tế xanh nhạt. 92
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học Hình 3. Hình thái mẫu đậu nành và chồi tái sinh trên các môi trường a) đồng nuôi cấy ; b) tái sinh chồi; c) 5mg/L hygromyci; d) 10mg/L hygromycin Kết quả chọn lọc chồi chuyển gene mg/l hygromycin và tiếp tục theo dõi. Trên Trong nghiên cứu này, chồi giả định chuyển môi trường bổ sung 10 mg/l hygromycin gene được chọn lọc trên môi trường bổ sung nhận thấy hầu hết chồi nhanh bị ức chế sinh 10 mg/l hygromycin tương đồng với nghiên trưởng, vàng lá và chết. Bảng 1 cho thấy kết cứu của (Phan Lê Tư và ctv, 2018). Kết quả quả thu nhận được trong thời gian 4 ngày đồng Hình 3 cho thấy, các chồi giả định chuyển nuôi cấy: 3 mẫu chồi ở đợt 1 (2,5%), 2 mẫu gene khi chuyển lên môi trường chọn lọc chồi ở đợt 2 (1,67%); trong thời gian 6 ngày chứa 5 mg/l hygromycin vẫn phát triển với tỷ đồng nuôi cấy: 6 mẫu chồi ở đợt 1 (5,0%). lệ mẫu sống trên 90% tuy nhiên một phần lá Mẫu chồi đậu nành còn sống trên môi trường mầm có dấu hiệu vàng, xuất hiện các đốm 10 mg/l hygromycin sẽ được kiểm tra bằng đen trên lá mầm và chồi phát sinh, trụ mầm phương pháp PCR và chuyển sang môi trường bị hoá nâu. Sau 28 ngày, mẫu chồi được vươn chồi. chuyển lên môi trường chọn lọc chứa 10 Bảng 1. Kết quả chọn lọc chồi giả định chuyển gene đậu nành DT22 Tỷ lệ mẫu sống (%) Đồng nuôi Đợt +5 mg/l hygromycin, +10 mg/l hygromycin, cấy 28 ngày 28 ngày 1 96,0 (24/25) 12,0 (3/25) 4 ngày 2 92,3 (24/26) 7,69 (2/26) 6 ngày 1 93,6 (44/47) 12,8 (6/47) Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 4) cho hptII trên chồi đậu nành đã được chuyển gene thấy ở 1 dòng giả định chuyển gene có sự xuất thành công ở nghiên cứu trước. Trong khi đó hiện của một băng DNA có kích thước khoảng mẫu đối chứng âm (-) (cây không chuyển 500 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp gene) cho kết quả âm tính. Do đó, có thể với kích thước của gene hptII được khuếch đại khẳng định sự hiện diện của gene hptII trên là 507 bp), phù hợp với kích thước của gene mẫu thí nghiệm. hptII trên plasmid và kích thước của gene 93
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự hiện diện của gene hptII trên mẫu chồi giả định chuyển gene (L) Hyper Ladder 100bp, Bioline;(P) plasmid; (+) đối chứng dương; (-) đối chứng âm; (1 - 11) tương ứng với các dòng cây giả định chuyển gene của giống DT22 Hiệu quả chuyển nạp cao là tiền đề nhằm nghiên KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ cứu chức năng của gene và chọn giống theo Dựa vào trình tự gene Minc14137, cấu trúc phương pháp phân tử. Chuyển gene gián tiếp amiRNA có khả năng bất hoạt sự biểu hiện thông qua vi khuẩn A. tumefaciens là phương của gene này đã được tổng hợp và biến nạp pháp thường dùng để cải tiến giống cây trồng, thành công vào vi khuẩn A. tumefaciens trong đó bốn yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu LBA4404 để tạo cây đậu nành biến đổi gene. quả xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium Thời gian đồng nuôi cấy 6 ngày giúp tăng số bao gồm mật độ vi khuẩn, giống đậu nành, môi mẫu tạo chồi sau lây nhiễm và hiệu quả trường huyền phù và thời gian đồng nuôi cấy. chuyển nạp gene so với thời gian đồng nuôi Thời gian đồng nuôi cấy 6 ngày trên giống đậu cấy 4 ngày. Cần tiếp tục cải tiến quy trình nành DT22 đã giúp tăng tỷ lệ mẫu cảm ứng, từ chuyển gene và tạo cây đậu nành, sau đó thực đó tăng số chồi tái sinh và hiệu quả chuyển nạp hiện khảo sát thực tế với tuyến trùng M. gene. incognita. TÀI LIỆU THAM KHẢO MELITO S., HEUBERGER A.L., COOK D., DIERS B.W., MACGUIDWIN A.E., BENT A.F. 2010. A nematode demographics assay in transgenic roots reveals no significant impacts of the Rhg1 locus LRR-Kinase on soybean cyst nematode resistance. BMC Plant Biol. 10: 104. NGUYỄN VŨ PHONG. 2018. Tạo vector biểu hiện chứa cấu trúc microRNA nhân tạo nhằm bất hoạt gene tuyến trùng Meloidogyne incognita. Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp.2: 48-49. PHAN LÊ TƯ, TÔN BẢO LINH, NGUYỄN VŨ PHONG (2018). Đánh giá khả năng tái sinh và chuyển gene nhờ vi kh��= Agrobacterium tumefaciens ở một số giống đậu nành . Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp.1: 8-15. SCHWAB R, OSSOWSKI S, RIESTER M, WARTHMANN N, WEIGEL D, 2006. Highly specific gene silencing by artificial miRNAs in Arabidopsis. Plant Cell 18: 1121- 1133. TRẦN THỊ CÚC HÒA (2008). Tối ưu hóa quy trình chuyển nạp gene đậu tương bằng cải tiến phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 9: 8-11. 94

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.