Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn chịu muối mật, chịu axit và đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

93
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của nghiên cứu này là tiếp tục tuyển chọn khả năng chịu muối mật, chịu axit và hoạt tính đối kháng với tác nhân gây bệnh EMS của 27 chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn trước đó có phổ kháng khuẩn rộng với các vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Kết quả cho thấy trong số này có 17 chủng chịu được muối mật 0,1%; 2 chủng (Lactobacillus plantarum T8 và T13) chịu được pH 2 trong 1 h và pH 3 - 4 trong 2 h; và 2 chủng này cũng có hoạt tính đối kháng với Vibrio parahaemolyticus XN9 gây bệnh EMS phân lập tại Ninh Thuận. Các kết quả này mở ra triển vọng sử dụng các chủng T8 và T13 trong điều chế chế phẩm probiotic nhằm quản lý bệnh EMS trên tôm thẻ chân trắng ở Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn chịu muối mật, chịu axit và đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MUỐI MẬT, CHỊU AXIT VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH CHẾT SỚM Ở TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (LITOPENAEUS VANNAMEI) SELECTION OF SOME BACTERIAL STRAINS WITH BILE SALT AND ACID TOLERANCE AS WELL AS ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST EMS - CAUSING Vibrio parahaemolyticus IN WHITELEG SHRIMP (Litopenaeus vannamei) Nguyễn Thị Chính1, Phạm Thu Thủy1, Nguyễn Văn Duy1* Ngày nhận bài: 25/11/2015; Ngày phản biện thông qua: 29/6/2016; Ngày duyệt đăng: 15/12/2016 TÓM TẮT Bệnh chết sớm (EMS) hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) xảy ra trên tôm nuôi nước lợ đã gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở Việt Nam và một số nước châu Á khác như Trung Quốc, Thái Lan và Malaysia. Tác nhân chính gây bệnh được cho là do Vibrio parahaemolyticus. Hiện nay chưa có biện pháp trị bệnh EMS hiệu quả, vì vậy, việc tuyển chọn các chủng probiotic trong phòng trị bệnh EMS là hướng đi có nhiều triển vọng nhằm phát triển bền vững nghề nuôi tôm. Mục tiêu của nghiên cứu này là tiếp tục tuyển chọn khả năng chịu muối mật, chịu axit và hoạt tính đối kháng với tác nhân gây bệnh EMS của 27 chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn trước đó có phổ kháng khuẩn rộng với các vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Kết quả cho thấy trong số này có 17 chủng chịu được muối mật 0,1%; 2 chủng (Lactobacillus plantarum T8 và T13) chịu được pH 2 trong 1 h và pH 3 - 4 trong 2 h; và 2 chủng này cũng có hoạt tính đối kháng với Vibrio parahaemolyticus XN9 gây bệnh EMS phân lập tại Ninh Thuận. Các kết quả này mở ra triển vọng sử dụng các chủng T8 và T13 trong điều chế chế phẩm probiotic nhằm quản lý bệnh EMS trên tôm thẻ chân trắng ở Việt Nam. Từ khóa: EMS; Litopenaeus vannamei, probiotic, Vibrio parahaemolyticus ABSTRACT Early Mortality Syndrome (EMS), also named Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND), which recently occurs in penaeid shrimp, is now causing signiﬁcant losses to the shrimp farming industry in Vietnam, China, Thailand and Malaysia. Vibrio parahaemolyticus is considered as a major pathogen. No effective treatment has currently been reported; hence screening of probiotics against EMS is a promising approach for the sustainable development of shrimp culture. The aim of the study is to further screen probiotic activities including bile salt tolerance, acid tolerance and antimicrobial activity against EMS/AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus of 27 bacterial strains which have expressed antimicrobial activity against a wide range of Gram-positiv and -negative bacteria in previous studies. The results showed that there were 17 strains resistant to the bile salt at the concentration of 0,1%; 2 strains (Lactobacillus plantarum T8 and T13) resistant to pH 2 for 2 h and pH 3 - 4 for 2 h; and these two strains also indicated antibacterial activity against EMS/AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus XN9 isolated in Ninh Thuan province. These results open the prospect of using the T8 and T13 strains for the development of probiotic products in order to manage EMS in Litopenaeus vannamei in Vietnam. Keywords: EMS, Litopenaeus vannamei, probiotics, Vibrio parahaemolyticus 1 * Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang Email: duynv@ntu.edu.vn 34 • NHA TRANG UNIVERSITY Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tôm thẻ chân trắng được đưa vào Việt Nam năm 2001. Từ năm 2008, diện tích và sản lượng tôm thẻ chân trắng không ngừng được tăng lên. Cùng với tăng nhanh về diện tích và sản lượng thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm dẫn đến tình hình dịch bệnh xảy ra nhiều hơn. Đặc biệt vấn đề dịch bệnh do vi sinh vật gây ra ảnh hưởng rất lớn đến tính ổn định và năng suất nuôi tôm. Một trong những bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới nghề nuôi tôm hiện nay là bệnh chết sớm. Bệnh chết sớm (Early Mortality Syndrome, EMS) hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) xảy ra trên tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), đã được báo cáo lần đầu tiên tại Trung Quốc vào năm 2009 và sau đó lan rộng ra các nước Việt Nam, Thái Lan và Malaysia (FAO, 2013). Tác nhân chính của bệnh EMS được cho là Vibrio parahaemolyticus gây ra (Tran et al., 2013). Vi khuẩn này phát triển trong đường tiêu hóa của tôm, tạo ra độc tố làm mất chức năng và phá hủy mô của các cơ quan tiêu hóa của tôm như gan tụy. Bệnh lây truyền qua đường miệng nhưng không ảnh hưởng đến con người. Hơn nữa, hiện nay các nghiên cứu tập trung mô tả nguyên nhân của bệnh EMS. Các chiến lược để điều trị bệnh này rất cần thiết và cấp bách nhưng còn ít thấy được công bố. Hiện nay các phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh EMS đang được tập trung nghiên cứu trong khi đó chưa có biện pháp trị bệnh EMS hiệu quả được đưa ra (Sirikharin et al., 2015). Chiến lược chủ yếu tập trung vào việc kiểm soát sự có mặt hoặc hoạt động của vi khuẩn Vibrio nhằm giảm nguy cơ bùng phát của EMS. FAO (2013) khuyến cáo tẩy uế toàn bộ nền đáy ao nuôi và nguồn nước để tiêu diệt mầm bệnh EMS. Các chiến lược quản lí hệ vi sinh vật có thể là chìa khóa để giảm thiểu nguy cơ của sự bùng phát EMS. Chẳng hạn, FAO khuyến nghị nuôi tôm postlarvae trong các hệ thống với hệ vi sinh vật điều chỉnh (như các Số 4/2016 hệ thống nước sạch giàu vi tảo và các hệ thống nước được điều chỉnh vi sinh vật), đó là những môi trường sơ cấp làm giảm sự phát sinh của EMS. Sử dụng công nghệ greenwater (“nước xanh”) cũng liên quan đến việc giảm EMS trong thực tế. Các hệ thống greenwater (khác với các hệ thống nước sạch) được đặc trưng bởi một lượng vi tảo trưởng thành và quần xã vi khuẩn và có tác dụng làm giảm Vibrio và giảm tỷ lệ chết ở động vật (Lio et al., 2005; Tendencia et al., 2010). Ngoài các giải pháp trên, gần đây người ta quan tâm đến việc áp dụng các chế phẩm probiotic. Những cơ chế liên quan bao gồm: sản xuất các hợp chất ức chế, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh vị trí bám dính trong ruột, tăng cường đáp ứng miễn dịch và sản xuất các chất dinh dưỡng thiết yếu như vitamin và acid béo (Verschuere et al., 2000). Do đó, việc nghiên cứu tuyển chọn một số chủng probiotic tiềm năng có hoạt tính đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS ở tôm thẻ chân trắng là rất cấp thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Các vi sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng bốn tiêu chuẩn: (i) tiêu chuẩn sức sống và chiếm lĩnh ruột, (ii) tiêu chuẩn tác động có lợi đến sức khỏe vật chủ, (iii) tiêu chuẩn sản xuất và (iv) tiêu chuẩn an toàn (Nguyễn Văn Duy et al., 2015). Để sống và chiếm lĩnh ruột, các vi khuẩn probiotic phải vượt qua được những phần khác nhau của hệ tiêu hóa, trong đó quan trọng nhất là môi trường acid của dạ dày và sự có mặt của acid mật trong dịch tụy. Vì vậy, khi tuyển chọn các chủng probiotic tiềm năng, người ta thường tiến hành thử nghiệm khả năng chịu muối mật và chịu pH thấp của các chủng vi sinh vật quan tâm (Buntin et al., 2008; Talpur et al., 2012). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tuyển chọn 27 chủng probiotic tiềm năng từ các nghiên cứu trước đây đã thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rộng với nhiều chủng vi khuẩn đích (Nguyen và et al., 2014ab; Pham et al., 2014). Các chủng được tuyển chọn thông qua NHA TRANG UNIVERSITY • 35 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản các hoạt tính kháng muối mật, kháng pH thấp và kháng khuẩn nhằm tìm kiếm các ứng cử viên phù hợp để sử dụng trong quản lý dịch bệnh EMS trên tôm thẻ. Điều này giúp cung cấp dữ liệu khoa học về các hoạt tính sinh học của vi khuẩn probiotic dùng cho động vật thủy sản, mở ra tiềm năng sử dụng công nghệ probiotic trong quản lý bệnh EMS ở tôm, góp phần dần thay thế sử dụng kháng sinh và các hóa chất bị cấm hoặc hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Số 4/2016 II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu Tổng số 27 chủng vi khuẩn (Bảng 1) có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng lấy từ bộ sưu tập chủng của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang (Nguyen et al., 2014ab; Pham et al., 2014). Các chủng T8 và T13 được nuôi trong môi trường MRS (de Man – Rogosa – Sharpe, Difco, Mỹ) trong khi các chủng còn lại được nuôi cấy trên môi trường MB (Marine Broth, Difco, Mỹ). Bảng 1. Danh sách các chủng vi khuẩn nghiên cứu với khả năng chịu muối mật STT Chủng Nguồn phân lập Loài Tài liệu 1 T8 Nước dưa muối Lactobacillus plantarum Nguyen et 2 T13 Nước dưa muối Lactobacillus plantarum al., 2014b 3 B3.10.2B Ruột tôm sú Bacillus pumilus 4 D9 Ruột cá chim vây vàng Bacillus cereus 5 B1.1 Ruột tôm sú Enterococcus faecalis 6 B3.10B Ruột tôm sú Proteus mirabilis 7 D15 Ruột cá chim vây vàng Proteus sp. 8 D10 Ruột cá chim vây vàng Proteus sp. 9 T14 ruột tôm hùm bông Proteus sp. 10 CT1.1 Ruột cá giò Proteus sp. 11 G1 Ruột tôm hùm bông Proteus sp. 12 B3.7A Ruột tôm sú Proteus sp. Nguyen et 13 B3.10.2 Ruột tôm sú Proteus sp. al., 2014a 14 N1.4 Ruột tôm hùm bông Proteus sp. 15 T9 Ruột tôm hùm bông Proteus sp. 16 B3.10A Ruột tôm sú Proteus sp. 17 B3.7.1 Ruột tôm sú Proteus sp. 18 B3.7.4 Ruột tôm sú Providencia stuartii 19 M2 Ruột tôm hùm bông Klebsiella sp. 20 L5 Ruột tôm hùm bông Klebsiella sp. 21 V1.1 Ruột tôm sú Klebsiella pneumoniae 22 D16 Ruột cá chim vây vàng Alcaligenes faecalis 23 D18 Ruột cá chim vây vàng Alcaligenes faecalis 24 H77 Cơ thịt tu hài Enterobacter cloacae 25 H9 Cơ thịt tu hài Cronobacter sakazakii Pham et 26 H51 Cơ thịt tu hài Cronobacter sakazakii al., 2014 27 H61 Cơ thịt tu hài Cronobacter sakazakii (+: có khuẩn lạc, -: không có khuẩn lạc) 36 • NHA TRANG UNIVERSITY Nồng độ muối mật 0,1% 0,2% 0,3% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 2. Chủng vi khuẩn chỉ thị Tổng số 12 chủng vi khuẩn chỉ thị gây bệnh EMS được phân lập từ mẫu tôm bị bệnh EMS nuôi ở Ninh Thuận năm 2015, do Nhóm nghiên cứu Bệnh học thủy sản, Viện Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nha Trang cung cấp. Các chủng được ký hiệu như sau: NH0906C3, HH4/1, PT250964P, HH07044/6, XN9, H2509E1B, PT2509E1W, C2, XN8, PT2509E1V, NH0906C4 và TH1006C1. Tất cả các chủng này được nuôi trên môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose, Difco, Mỹ). Các chủng này đã được Nhóm nghiên cứu Bệnh học thủy sản thử nghiệm cảm nhiễm chứng minh là tác nhân gây bệnh EMS và sơ bộ định danh thuộc chi Vibrio (kết quả chưa công bố). Trong số này, chủng XN9 đã được xác định có độc lực mạnh nhất và đã sơ bộ định danh là V. parahaemolyticus nhờ sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu AP3, AP4 (kết quả chưa công bố). Kết quả định danh chủng XN9 bằng kit API 20E của chúng tôi cho thấy có 18/20 thử nghiệm sinh hóa giống với V. parahaemolyticus, ngoại trừ các thử nghiệm TDA và IND (Bảng 2). Kết quả này một lần nữa xác nhận kết quả do Nhóm nghiên cứu Bệnh học thủy sản cung cấp. Bảng 2. Kết quả định danh chủng XN9 theo kit API 20E Tên thử nghiệm XN9 V.parahaemolyticus (theo API) Tên thử nghiệm XN9 V. parahaemolyticus (theo API) ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP + + + + - + + + + - GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA + + + + + + + + 3. Xác định khả năng sinh trưởng Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm (OD600). 4. Xác định khả năng chịu muối mật Các chủng được nuôi cấy trong môi trường tương ứng và không có muối mật ở 30°C trong 24 h. Cấy trang 1 ml canh trường nuôi cấy (ở mật độ 108 CFU/ml) của chủng T8 hoặc T13 vào đĩa thạch MRS agar, những chủng còn lại được nuôi cấy trên môi trường MA (Marine Agar, Difco, Mỹ). Các đĩa MRS agar/MA có chứa nồng độ muối mật 0,1%, 0,2% và 0,3% (Buntin et al., 2008; Talpur et al., 2012). Khả năng chịu muối mật được xác định bằng khả năng mọc khuẩn lạc trong điều kiện trên ở 30°C trong 48 h. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. 5. Xác định khả năng chịu axit Sau khi hoạt hóa qua đêm ở 32°C trong môi trường MRS/MB mật độ vi khuẩn đạt 108 CFU/ml, chuyển 100 µl dịch vi khuẩn sang các bình tam giác chứa 10 ml môi trường MRS/MB có pH = 1, 2, 3, 4 và 6,5 (điều chỉnh bằng HCl 1M). Tất cả các bình tam giác trên được nuôi lắc 180 rpm ở 32°C trong 1 – 2 h. Khả năng chịu axit được xác định bằng mật độ vi khuẩn sống theo phương pháp đếm khuẩn lạc. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. 6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp nhằm thu dịch nổi. Dịch nổi sẽ được lọc vô trùng bằng màng lọc 0,45 µm nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn (Nguyen et al., 2014b). Các đĩa thạch MA 1,5% agar NHA TRANG UNIVERSITY • 37 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 14 chủng chịu muối mật đến nồng độ 0,3%; 15 chủng chịu được nồng độ muối mật ít nhất đến 0,2%; 17 chủng chịu được muối mật ít nhất đến 0,1%. Cho đến nay, nhiều chủng vi khuẩn phân lập từ các nguồn khác nhau đã được chứng minh có hoạt tính chịu muối mật này (Begley et al., 2006; Ilavenil et al., 2015). Ngoài ra, có 10 chủng vi khuẩn khác trong nghiên cứu này không chịu được muối mật 0,1%. Mặc dù đây chỉ là kết quả định tính nhưng có ý nghĩa để tuyển chọn được 17 chủng chịu muối mật 0,1% cho các thử nghiệm tiếp theo. sẽ được đổ thêm một lớp ở trên bằng thạch mềm MB 0,75% agar có chứa 105 CFU/ml vi khuẩn chỉ thị. Các lỗ thạch được tạo ra bằng đầu tip vô trùng và nhỏ vào 100 µl dịch nổi được xử lí ở trên. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn sau khi ủ ở 30°C sau 24 h theo phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 2. Khả năng chịu axit của các chủng vi Sống và chiếm lĩnh trong hệ đường ruột khuẩn nghiên cứu của động vật chủ là tiêu chuẩn đầu tiên trong Chúng tôi tiến hành phân tích định lượng tuyển chọn các chủng probiotic (Nguyễn Văn mật độ tế bào vi khuẩn sống trong môi trường Duy et al., 2015). Havenaar et al. (1992) đã chỉ có pH 1 – 4 của 17 chủng vi sinh vật chịu muối ra rằng probiotic chỉ phát huy tác dụng có lợi mật ít nhất 0,1%. Kết quả từ Bảng 3 cho thấy lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong không có chủng nào sống được trong môi ruột non (Zhou et al., 2007). Điều quan trọng trường có pH 1. Chỉ có 2 chủng (T8 và T13) nhất ở đây là các vi sinh vật probiotic phải trải chịu được khi nuôi ở pH 2 – 4 sau 1 h với mật qua điều kiện pH thấp từ 1,5 – 3 của dạ dày, độ tế bào đạt từ 1,17 – 1,61 × 107 CFU/ml. Tiếp cũng như sự có mặt của axit mật ở nồng độ tục thí nghiệm khả năng chịu axit của 2 chủng 0,1 - 0,3% trong ruột (Gilliland et al., 1984; này với thời gian nuôi 2 h, cho thấy cả 2 chủng Talpur et al., 2012; Ilavenil et al., 2015). Vì vậy, T13 và T8 đều có khả năng sống trong điều nồng độ muối mật 0,1 - 0,3% và pH 1 - 4 được kiện pH 3 và 4 nhưng không chịu được trong chúng tôi lựa chọn để kiểm tra khả năng chịu điều kiện pH 2. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng muối mật và pH thấp của các chủng vi khuẩn được thử nghiệm trong môi trường MRS ở pH 6,5 đã thể hiện khả năng sinh trưởng tốt, sau nghiên cứu. 2 h nuôi mật độ tăng lên đạt 5,19 – 5,63 × 107 Kết quả từ Bảng 1 cho thấy, trong tổng số CFU/ml. 27 chủng vi khuẩn ban đầu đã xác định được Bảng 3. Khả năng chịu axit của Lactobacillus plantarum T8 và T13 Mật độ tế bào sống (× 107 CFU/ml) Thời gian Đối chứng (pH 6,5) Lactobacillus plantarum T13 1h Lactobacillus plantarum T8 Chủng vi khuẩn pH 1 pH 2 pH 3 pH 4 1,32 ± 0,17 0 1,26 ± 0,30 1,65 ± 0,04 2,50 ± 0,28 2h 5,63 ± 1,65 0 0 1,95 ± 0,29 3,05 ± 0,01 1h 1,41 ±0,21 0 1,17 ± 0,23 1,70 ± 0,08 2,61 ± 0,17 2h 5,19 ± 0,13 0 0 1,98 ± 0,25 3,2 ± 0,31 Kết quả nghiên cứu này phù hợp với những kết quả nghiên cứu trước đây. Chẳng hạn, Tapur và cộng sự (2011) khi khảo sát khả năng chịu axit của 5 chủng vi khuẩn lactic gồm L. plantarum, L. salivarius, L. rhamnosus, 38 • NHA TRANG UNIVERSITY Weisella confusa, Weisella cibaria phân lập từ ruột của loài ghẹ xanh cũng cho thấy tất cả đều không sống được ở pH 1 sau thời gian 1 h, trong khi đó ở pH 2; 2,5 và 3 chúng đều sinh trưởng. Mật độ vi khuẩn tăng dần theo giá trị pH