Tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro phân lập từ phân gia súc tại Việt Nam

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 79-87<br /> <br /> TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN<br /> CÓ KHẢ NĂNG SINH HYDRO PHÂN LẬP TỪ PHÂN GIA SÚC TẠI VIỆT NAM<br /> Nguyễn Thị Thu Huyền1,2*, Nguyễn Thị Yên1, Vương Thị Nga1,<br /> Ðặng Thị Yến1, Nguyễn Thị Trang1, Lại Thúy Hiền1<br /> 1<br /> <br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam<br /> Trường Ðại học Tôn Ðức Thắng, tp. Hồ Chí Minh, *huyen308@gmail.com<br /> <br /> 2<br /> <br /> TÓM TẮT: Hydro sinh học được coi là nguồn năng lượng sạch, bền vững và đầy hứa hẹn cho tương lai<br /> nhờ tính hiệu quả và thân thiện với môi trường. Có nhiều phương pháp để sản xuất hydro sinh học, trong<br /> số đó hầu hết là dựa vào vi khuẩn. Trong các quá trình sản xuất hydro sinh học, quá trình lên men sản xuất<br /> hydro nhờ vi khuẩn hóa tự dưỡng kỵ khí hoặc vi hiếu khí là một phương pháp triển vọng để sản xuất<br /> hydro biền vững. Trong bài báo này, bốn chủng vi khuẩn bản địa có khả năng sinh hydro đã được nghiên<br /> cứu. Cả bốn chủng vi khuẩn sinh hydro đều được phân lập từ phân gia súc tại Việt Nam, tế bào của chúng<br /> đều có dạng hình que với độ dài khác nhau, chủng Bo 4.1 có tiên mao, các chủng đều là vi khuẩn Gram<br /> (+) ngoại trừ chủng Tr2. Trong số các chủng Gram (+), chỉ có chủng Be DA không có khả năng tạo bào<br /> tử, trong khi đó hai chủng còn lại Bo 4.1 và Trau DAt đều tạo bào tử. Kết hợp đặc điểm hình thái và phân<br /> tích trình tự gen 16S rRNA, chủng vi khuẩn kỵ khí ưa ấm Bo 4.1 thuộc loài Clostridium beijerinckii với<br /> độ tương đồng 99,9%; chủng vi khuẩn kị khí ưa nhiệt Trau DAt thuộc loài Thermoanaerobacterium<br /> aciditolerans độ tương đồng 99,3%. Hai chủng vi hiếu khí, ưa ấm còn lại Be DA và Tr2 được xác định<br /> thuộc chi Clostridium dựa trên đặc điểm hình thái, kít chuẩn API và phân tích trình tự gen 16S rRNA.<br /> Từ khóa: Clostridium, Thermoanaerobacterium, hydrogen sinh học, phân gia súc, vi khuẩn sinh hydro.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Trên thế giới, để giải quyết các vấn đề khó<br /> khăn về nguồn nhiên liệu cạn kiệt cũng như trái<br /> đất nóng lên mà một phần nguyên nhân là do<br /> quá trình đốt cháy nhiên liệu hóa thạch, các nhà<br /> khoa học đã và đang tập trung nghiên cứu tìm<br /> nguồn năng lượng mới, sạch và bền vững. Một<br /> trong những hướng khả thi nhất là hydro sinh<br /> học với các ưu điểm như không cần sử dụng đến<br /> nguồn nguyên liệu hóa thạch, ít đòi hỏi năng<br /> lượng, đảm bảo thân thiện với môi trường, tiến<br /> hành đơn giản, chi phí đầu tư thấp, hiệu quả sản<br /> xuất ổn định và hiệu quả kinh tế cao hơn [9].<br /> Đặc biệt, sản xuất hydro theo phương pháp lên<br /> men tối nhờ nhóm vi khuẩn dị dưỡng còn có thể<br /> tận dụng được nguồn phế thải hữu cơ làm<br /> nguyên liệu cho sản xuất và giảm được chi phí<br /> cho sản xuất [1, 12]. Quá trình lên men tối sinh<br /> hydro được thực hiện bởi rất nhiều loài vi khuẩn<br /> khác nhau cả về đặc điểm sinh lý cũng như phân<br /> loại học. Các vi khuẩn có khả năng lên men sinh<br /> hydro có thể là vi khuẩn ưa ấm, ưa nhiệt, thậm<br /> chí siêu ưa nhiệt [14, 20, 22]. Quá trình lên men<br /> sinh hydro chủ yếu diễn ra trong điều kiện kỵ<br /> khí, tuy nhiên chúng cũng vẫn có thể lên men<br /> <br /> sinh hydro trong điều kiệu vi hiếu khí. Có nhiều<br /> nhóm nghiên cứu phân lập thành công vi khuẩn<br /> sinh hydro từ các phế thải nông nghiệp và công<br /> nghiệp [5, 15, 17]. Trong nghiên cứu này, chúng<br /> tôi tiến hành phân lập và định danh bốn chủng<br /> vi khuẩn bản địa có khả năng sinh hydro từ<br /> nguồn phân gia súc tại Việt Nam nhằm định<br /> hướng ứng dụng chúng trong quá trình lên men<br /> tối sản xuất hydro sinh học.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu và môi trường nuôi cấy<br /> Các mẫu phân gia súc được lấy từ Đông<br /> Anh và Chương Mỹ, Hà Nội và Tân Yên, Bắc<br /> Giang.<br /> Môi trường nuôi cấy, phân lập các chủng vi<br /> khuẩn có khả năng sinh hydro là môi trường<br /> NMV [7]. Đối với môi trường thạch, môi<br /> trường NMV được bổ sung 15 g agar trong 1 lit<br /> môi trường.<br /> Phương pháp<br /> Làm giàu vi khuẩn sinh hydro bằng nuôi cấy<br /> tích lũy trên môi trường dịch NMV<br /> Các mẫu được nuôi cấy trong môi trường<br /> dịch chọn lọc NMV cho nhóm vi khuẩn lên men<br /> 79<br /> <br /> Nguyen Thi Thu Huyen et al.<br /> <br /> sinh hydro trong 4 điều kiện khác nhau: vi hiếu<br /> khí, ưa ấm (30oC); vi hiếu khí, ưa nhiệt (55oC);<br /> kỵ khí, ưa ấm (30oC); kỵ khí, ưa nhiệt (55oC).<br /> Sau 2-5 ngày nuôi cấy trong tủ ổn nhiệt, mẫu<br /> nào thấy có dấu hiệu có vi khuẩn sinh trưởng<br /> (làm đục môi trường) và tạo khí (xác định bằng<br /> phương pháp thế chỗ nước) thì được tiếp tục<br /> làm giàu bằng cách cấy hoạt hóa (10-20%<br /> giống). Cứ tiếp tục như vậy cho đến khi mẫu<br /> nào có vi khuẩn sinh trưởng tốt thì tiến hành<br /> phân lập vi khuẩn có khả năng sinh hydro.<br /> Phân lập vi khuẩn sinh hydro bằng cách nuôi<br /> cấy trên môi trường thạch NMV<br /> Các mẫu chứa vi khuẩn có khả năng sinh<br /> hydro được pha loãng theo cơ số 10 trong dung<br /> dịch muối sinh lý 0,9% NaCl đã khử trùng. Hút<br /> 0,1 ml mỗi ống nghiệm chứa dịch vi khuẩn có<br /> nồng độ pha loãng khác nhau vào các đĩa Petri<br /> khác nhau rồi đổ 20 ml môi trường thạch NMV<br /> lên mỗi đĩa để phân lập vi khuẩn vi hiếu khí<br /> hoặc các ống nghiệm (dung tích 10 ml) khác<br /> nhau rồi đổ đầy 10 ml môi trường thạch NMV<br /> vào mỗi ống để phân lập vi khuẩn kỵ khí. Các<br /> đĩa Petri và ống nghiệm chứa vi khuẩn được<br /> đưa vào tủ ổn nhiệt (30oC đối với vi khuẩn ưa<br /> ấm và 55oC đối với vi khuẩn ưa nhiệt). Sau 2-5<br /> ngày nuôi, quan sát khuẩn lạc trên đĩa Petri và<br /> ống nghiệm. Các khuẩn lạc có hình thái khác<br /> nhau sẽ được tách và cấy chuyển sang môi<br /> trường dịch NMV để hoạt hóa. Các đơn chủng<br /> này tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường<br /> thạch theo các bước như vừa nêu để kiểm tra độ<br /> tinh sạch.<br /> Phân loại vi khuẩn theo nhóm bằng phương<br /> pháp nhuộm Gram hoặc thử KOH 3%<br /> Sau khi cấy hoạt hóa, các đơn chủng vi<br /> khuẩn sinh hydro được nuôi cấy trên môi trường<br /> dịch NMV. Sau 24 giờ nuôi cấy, ly tâm (8000<br /> vòng/phút ở 4oC trong 10 phút) để thu sinh khối<br /> tế bào. Sinh khối tế bào được nhuộm Gram rồi<br /> quan sát trên kính hiển vi quang học, hoặc thử<br /> phản ứng với KOH 3%.<br /> Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi quét<br /> (SEM)<br /> Đơn chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro<br /> được cấy hoạt hóa qua đêm trong môi trường<br /> dịch NMV. Dịch vi khuẩn được ly tâm (5000<br /> vòng/phút) trong 10 phút ở 20oC để thu sinh khối<br /> 80<br /> <br /> tế bào. Sau khi rửa trong dung dịch PBS (pH<br /> 7,2), ly tâm (5000 vòng/phút) trong 10 phút để<br /> thu tế bào. Quy trình chuẩn bị mẫu và soi trên<br /> kính hiển vi điện tử quét HITACHI S4800 theo<br /> Phạm Thị Hằng & Lại Thúy Hiền (2010) [6].<br /> Xác định khả năng tạo bào tử bằng phương<br /> pháp sốc nhiệt<br /> Đối với vi khuẩn ưa ấm: vi khuẩn có khả<br /> năng sinh hydro được nuôi trên môi trường<br /> NMV từ 5-7 ngày. Sau đó đem dịch nuôi cấy ủ<br /> trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 85oC trong 15 phút.<br /> Dịch nuôi cấy sau khi sốc nhiệt được nuôi cấy<br /> trong môi trường thạch đĩa NMV. Nếu thấy vi<br /> khuẩn sinh trưởng trở lại và có khả năng tạo khí<br /> thì vi khuẩn có khả năng sinh hydro đó có khả<br /> năng tạo bào tử.<br /> Đối với vi khuẩn ưa nhiệt: vi khuẩn có khả<br /> năng sinh hydro được nuôi trên môi trường<br /> NMV có bổ sung MnCl2.4H2O 0,001% (w/v) từ<br /> 5-7 ngày. Sau đó đem dịch nuôi cấy đun sôi<br /> nhiệt độ 100oC trong 30 phút. Dịch nuôi cấy sau<br /> khi sốc nhiệt được nuôi cấy trở lại trong môi<br /> trường dịch NMV với tỷ lệ tiếp giống là 20%.<br /> Nếu thấy vi khuẩn sinh trưởng trở lại và có khả<br /> năng tạo khí thì vi khuẩn có khả năng sinh<br /> hydro đó có khả năng tạo bào tử.<br /> Định danh vi khuẩn Gram âm bằng kit chuẩn<br /> sinh hóa API 20NE<br /> Chủng vi khuẩn Gram âm có khả năng sinh<br /> hydro sau khi nuôi cấy qua đêm trong môi<br /> trường NMV được ly tâm 8000 vòng/phút trong<br /> 10 phút ở 4oC để thu sinh khối. Sinh khối tế bào<br /> được pha loãng trong dung dịch muối sinh lý<br /> NaCl 0,9% đã khử trùng sao cho OD600nm<br /> khoảng 0,5. Tiến hành thử nghiệm dịch huyền<br /> phù tế bào với các phản ứng sinh hóa của kit<br /> chuẩn API 20NE theo hướng dẫn của hãng<br /> BioMerieux (Pháp). Đọc kết quả dựa vào bảng<br /> hướng dẫn và tra phần mềm Apiweb hoặc bảng<br /> đối chiếu (API 20NE profile index) để xác định<br /> tên chi/loài của vi khuẩn thử nghiệm.<br /> Định danh đến loài bằng phân tích trình tự gen<br /> 16S rRNA<br /> Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro<br /> được nuôi cấy trên môi trường dịch NMV qua<br /> đêm, sau đó ly tâm 8000 vòng/phút ở 4oC trong<br /> 10 phút để thu tế bào. DNA tổng sổ của các<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 79-87<br /> <br /> chủng này được tách theo kit tách DNA vi khuẩn<br /> (Qiagen, Mĩ). Chất lượng DNA tổng số được<br /> kiểm tra trên gel agarose. Các bước tiếp theo<br /> được tiến hành theo Sakiyama et al. (2009) [19].<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng<br /> sinh khí hydro<br /> Quá trình lên men sinh hydro có thể được<br /> thực hiện bởi các đơn chủng hoặc các tập đoàn<br /> vi khuẩn. Sản xuất hydro nhờ các tập đoàn vi<br /> khuẩn có ưu điểm là nguồn vật liệu dùng cho<br /> lên men rất đa dạng và không cần phải khử<br /> trùng nguồn vật liệu đầu vào. Tuy nhiên, nhược<br /> điểm của quá trình này là sản phẩm khí tạo<br /> thành không chỉ chứa hydro mà còn chứa cả các<br /> khí khác, vì vậy, việc thu hồi và làm sạch khí<br /> hydro gặp nhiều khó khăn hơn. Ngoài ra, hydro<br /> tạo thành có thể bị các vi khuẩn có khả năng sử<br /> dụng hydro tiêu thụ [21]. Hơn nữa, việc tối ưu<br /> hóa quá trình sản xuất hydro cũng khó khăn hơn<br /> bởi tập đoàn vi khuẩn chứa nhiều loại vi khuẩn<br /> có đặc tính sinh lý khác nhau. Vì vậy, sản xuất<br /> hydro bằng đơn chủng thường được ứng dụng<br /> nhiều hơn ở qui mô công nghiệp. Cũng chính vì<br /> thế, chúng tôi tiến hành phân lập các đơn chủng<br /> vi khuẩn có khả năng sinh hydro để từ đó lựa<br /> chọn những chủng có khả năng sinh hydro cao<br /> nhằm hướng tới ứng dụng chúng trong sản xuất<br /> <br /> hydro công nghiệp.<br /> Từ các mẫu có sinh khí sau khi làm giàu,<br /> chúng tôi tiến hành phân lập đơn chủng vi<br /> khuẩn có khả năng sinh hydro trên môi trường<br /> thạch NMV và thử khả năng tạo khí của chúng.<br /> Trong số các chủng phân lập được, có chủng có<br /> khả năng sinh khí và có chủng không có khả<br /> năng sinh khí (kết quả không trình bày ở đây).<br /> Vì vậy, chúng tôi chỉ lựa chọn 14 chủng vi<br /> khuẩn có khả năng sinh khí. Các chủng này bao<br /> gồm 2 chủng kỵ khí, ưa ấm; 7 chủng kỵ khí, ưa<br /> nhiệt và 5 chủng vi hiếu khí ưa ấm, sau đó, các<br /> chủng này được nuôi cấy trong môi trường dịch<br /> NMV để đánh giá khả năng sinh khí. Kết quả<br /> được trình bày ở bảng 1 cho thấy, các chủng kỵ<br /> khí ưa ấm có khả năng sinh khí tốt nhất trong<br /> khi đó các chủng kỵ khí, ưa nhiệt sinh khí kém<br /> nhất ngoại trừ chủng Trau DAt. Trong số các<br /> chủng vi hiếu khí, ưa ấm thì chủng Tr2 và<br /> chủng Be DA2 có khả sinh khí tốt. Thành phần<br /> khí thu được từ các chủng này được phân tích<br /> để xác định lương khí hydro có trong hỗn hợp<br /> khí. Kết quả thu được (không trình bày ở đây)<br /> cho thấy, cả 2 chủng này đều sinh khí hydro.<br /> Dựa trên kết quả thu được, chúng tôi lựa chọn 2<br /> chủng kỵ khí (ưa ấm Bo 4.1 và ưa nhiệt Trau<br /> DAt) và 2 chủng vi hiếu khí (Tr2 và Be DA2-ký<br /> hiệu là Be DA) cho các thí nghiệm nghiên cứu<br /> tiếp theo.<br /> <br /> Bảng 1. Khả năng sinh khí của các chủng vi khuẩn sinh hydro<br /> S<br /> TT<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Chủng<br /> <br /> Khả năng<br /> sinh khí<br /> <br /> Kị khí, ưa ấm<br /> Bo 4.1<br /> +++<br /> Bo 4.2<br /> ++<br /> <br /> S<br /> TT<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> <br /> Khả<br /> năng<br /> sinh khí<br /> Kị khí, ưa nhiệt<br /> Be DAt1<br /> +<br /> Be DAt3<br /> +<br /> Trau DAt<br /> ++<br /> Bo BGt1.4<br /> +<br /> Bo BGt1.5<br /> +<br /> Bo BGt1.7<br /> +<br /> Bo BGt2<br /> +<br /> Chủng<br /> <br /> S<br /> TT<br /> 10<br /> 11<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> <br /> Chủng<br /> <br /> Khả năng<br /> sinh khí<br /> <br /> Vi hiếu khí, ưa ấm<br /> Tr1<br /> +<br /> Tr2<br /> ++<br /> Tr3<br /> +<br /> Be DA1<br /> +<br /> Be DA2<br /> ++<br /> <br /> (+). sinh khí thấp; (++). sinh khí trung bình; (+++). sinh khí cao.<br /> <br /> Đặc điểm tế bào của một số chủng vi khuẩn<br /> có khả năng sinh khí hydro<br /> Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi<br /> <br /> điện tử cho thấy 4 chủng Bo 4.1, Trau DAt, Tr2<br /> và Be DA đều là vi khuẩn hình que có độ dài<br /> khác nhau. Tế bào của ba chủng Bo 4.1, Trau<br /> <br /> 81<br /> <br /> Nguyen Thi Thu Huyen et al.<br /> <br /> DAt và Tr 2 có hình que dài trong khi chủng Be<br /> DA có hình que ngắn (hình 1). Riêng chủng Bo<br /> 4.1 còn có tiên mao. Theo các báo cáo đã công<br /> bố [13, 18], các vi khuẩn tạo khí hydro hầu hết<br /> <br /> là các vi khuẩn hình que. Vì vậy, kết quả quan<br /> sát được của chúng tôi cho thấy chủng vi khuẩn<br /> tạo khí mà chúng tôi phân lập được cũng có đặc<br /> tính chung đó.<br /> <br /> a<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> d<br /> <br /> Hình 1. Hình thái tế bào của chủng Bo 4.1 (a), Trau DAt (b), Tr 2 (c) và Be DA (d).<br /> Kết quả nhuộm Gram và thử KOH cho thấy,<br /> 3 chủng vi khuẩn Bo 4.1, Trau DAt và Be DA<br /> là vi khuẩn Gram dương, trong khi đó<br /> chủng Tr2 là vi khuẩn Gram âm. Các công trình<br /> đã công bố cho thấy, vi khuẩn có khả năng<br /> sinh khí hydro bao gồm cả vi khuẩn Gram<br /> âm và Gram dương trong đó vi khuẩn Gram<br /> dương là chủ yếu [13, 18], kết quả thu được<br /> của chúng tôi cũng khẳng định lại phát hiện<br /> trên.<br /> <br /> Các chủng Gram dương được thử nghiệm<br /> khả năng sinh bào tử bằng phương pháp sốc<br /> nhiệt. Kết quả cho thấy, 2 chủng kị khí Bo 4.1<br /> và Trau DAt đều có khả năng sinh bào tử trong<br /> khi chủng Be DA không có khả năng này (hình<br /> 2). Các nghiên cứu trước đây về vi khuẩn có<br /> khả năng sinh hydro cho thấy nhiều vi khuẩn<br /> Gram dương tạo khí hydro không sinh bào tử<br /> [13, 18, 21]. Trong khi đó, 2/3 số chủng Gram<br /> dương của chúng tôi có khả năng sinh bào tử.<br /> <br /> Hình 2. Khả năng sinh trưởng trở lại của các chủng Bo 4.1 (a) và Trau DAt (b) sau khi sốc nhiệt<br /> 82<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 79-87<br /> <br /> Như vậy, cả 4 chủng vi khuẩn Bo 4.1, Trau<br /> DAt, Tr 2 và Be DA điều là vi khuẩn hình que.<br /> Chủng Tr 2 là vi khuẩn Gram âm. Ba chủng Bo<br /> 4.1, Trau DAt và Be DA là vi khuẩn Gram<br /> dương, trong đó 2 chủng đầu có khả năng sinh<br /> bào tử. Các kết quả này góp phần khẳng định<br /> các nghiên cứu trước đây (vi khuẩn sinh hydro<br /> chủ yếu là vi khuẩn Gram dương, hình que)<br /> đồng thời bổ sung thêm rằng đặc tính tạo bào tử<br /> của vi khuẩn Gram dương, sinh hydro không<br /> phải là hiếm gặp.<br /> Định danh vi khuẩn có khả năng sinh hydro<br /> Định danh vi khuẩn bằng kít chuẩn sinh hóa<br /> API 20NE<br /> Các phản ứng đặc trưng trong chuỗi<br /> chuyển hóa trong quá trình trao đổi chất đối<br /> với từng loại vi sinh vật là khác nhau, kết quả<br /> nhuộm Gram cho thấy chủng Tr 2 thuộc nhóm<br /> Gram âm. Vì vậy, chúng tôi sử dụng kit chuẩn<br /> API 20NE để nghiên cứu các đặc điểm sinh<br /> hóa của chủng Tr 2 từ đó định danh vi khuẩn<br /> này. Kết quả thử kít Api 20NE cho thấy, chủng<br /> Tr.2 có khả năng sử dụng các nguồn cơ chất:<br /> Esculin, gelatine, -galactosidase, glucose,<br /> mannose, N-acetyl-glucosamine, malate và<br /> không có khả năng tham gia phản ứng: khử<br /> nitrate, chuyển hóa indole, axit hóa glucose,<br /> arginine dihydrolase, urease, arabinose, citrate,<br /> phenyl acetate, cytochrome oxidase, maltose,<br /> gluconate, caprate, adipate, manitol. Với kết quả<br /> đạt được, tiến hành tra phần mềm APIweb kết<br /> hợp khóa phân loại chuẩn của Bergey, chủng<br /> Tr2 có độ tương đồng 99,6% với loài<br /> Chryseobacterium menigosepticum. Cho đến<br /> nay chưa có công trình nào công bố khả năng<br /> sinh khí hydro của loài này.<br /> Định danh vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen<br /> 16 S rRNA<br /> Chủng Be DA cũng được thử nghiệm với kit<br /> chuẩn API 50 CHL, tuy nhiên, dựa trên kết quả<br /> thu được không xác định được vị trí phân loại<br /> của chủng này (kết quả không trình bày ở đây).<br /> Do đó, để định danh các chủng vi khuẩn này,<br /> chúng tôi tiến hành phân tích trình tự gen 16S<br /> rRNA của chủng Be DA cũng như 2 chủng kị<br /> khí Bo 4.1, Trau DAt. Đồng thời chủng Tr 2<br /> cũng được phân tích trình tự gen 16S rRNA để<br /> kiểm chứng kết quả phân loại bằng kit chuẩn<br /> <br /> sinh hóa API.<br /> So sánh với trình tự gen 16S rRNA của các<br /> loài trên ngân hàng gen cho thấy, trình tự gen<br /> 16S rRNA của chủng Bo 4.1 tương đồng 99,9%<br /> (1395/1396 bp) với đoạn 16S của Clostridium<br /> roseum_Y18171,<br /> tương<br /> đồng<br /> 99,9%<br /> (1394/1396 bp) với đoạn 16S rRNA của<br /> Clostridium<br /> beijerinckii_X68179<br /> và<br /> Clostridium diolis_AJ458418; trình tự gen 16S<br /> rRNA của chủng Trau DAt tương đồng 99,3%<br /> (1393/1403 bp) với đoạn 16S rRNA của<br /> Thermoanaerobacterium<br /> aciditolerans<br /> _AY350594; tương đồng 98,9% (1388/1403 bp)<br /> với<br /> đoạn<br /> 16S<br /> rRNA<br /> của<br /> Thermoanaerobacterium islandicum_EF088330;<br /> tương đồng 98,8% (1386/1403 bp) với đoạn<br /> 16S của Clostridium thermoamylolyticum<br /> _X76743; trình tự gen 16S rRNA của chủng Tr<br /> 2 tương đồng 99,9% (1394/1396 bp) với đoạn<br /> 16S rRNA của Clostridium roseum_Y18171,<br /> tương đồng 99,8% (1393/1396 bp) với đoạn<br /> 16S của Clostridium beijerinckii _X68179 và<br /> Clostridium diolis_AJ458418; trình tự gen 16S<br /> rRNA của chủng Be DA tương đồng 99,9%<br /> (1395/1396 bp) với đoạn 16S rRNA của<br /> Clostridium roseum_Y18171, tương đồng<br /> 99,9% (1394/1396 bp) với đoạn 16S rRNA của<br /> Clostridium<br /> beijerinckii_X68179<br /> và<br /> Clostridium diolis_AJ458418.<br /> Như vậy, mặc dù đặc điểm hình thái khuẩn<br /> lạc, hình thái tế bào, đặc tính Gram khác nhau,<br /> khả năng tạo bào tử khác nhau nhưng kết quả<br /> phân tích trình tự gen 16S rRNA của 3 chủng Bo<br /> 4.1, Tr 2 và Be DA lại cho kết quả tương tự<br /> nhau. Dựa trên kết quả thu được chúng tôi tiến<br /> hành xây dựng cây phát sinh chủng loại của 4<br /> chủng này, kết quả được trình bày ở hình 3 và 4.<br /> Định danh vi khuẩn<br /> Đặc điểm hình thái, kết quả thử kit API và<br /> phân tích trình tự gen 16S rRNA của chúng tôi<br /> cho thấy, các đặc điểm này ở chủng Bo 4.1 và<br /> Trau DAt có sự tương đồng, bổ trợ cho nhau,<br /> trong khi đó, ở chủng Be DA và Tr 2 lại có sự<br /> không tương thích. Chủng Bo 4.1: các đặc điểm<br /> sinh lý và hình thái của chủng Bo 4.1 cho thấy,<br /> chủng này là vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt, Gram<br /> dương, hình que, có khả năng tạo bào tử là các<br /> minh chứng giúp khẳng định thêm kết luận<br /> 83<br /> <br />