VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br />
<br />
ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LẠC<br />
KHÁNG BỆNH ĐỐM LÁ MUỘN<br />
Đồng Thị Kim Cúc, Lưu Minh Cúc, Lê Thanh Nhuận,<br />
Hà Minh Thanh, Phan Thanh Phương và cs<br />
Viện Di truyền Nông nghiệp.<br />
TÓM TẮT<br />
Kỹ thuật sinh học phân tử có khả năng rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả chuyển các gen<br />
kháng bệnh từ loài hoang dại vào giống lạc trồng có năng suất cao, quy tụ những đặc tính quý vào<br />
một cá thể. Trong 64 dòng giống lạc có 1 giống có khả năng cho gen (A. hypoyca - TN6) và 2 giống<br />
có khả năng nhận gen (TB25 và CNC3). Tìm được 60 chỉ thị đa hình dùng để lập bản đồ trên quần<br />
thể BC2F1 (TB25xTN6). Bản đồ di truyền liên kết của cây lạc trên quần thể BC2F1 với tổng chiều dài<br />
của bản đồ liên kết là 531,8 cM; gồm 16 nhóm liên kết chứa 58 chỉ thị, mỗi nhóm từ 2 tới 7 chỉ thị,<br />
khoảng cách trung bình giữa 2 chỉ thị SSR bằng 9,17 cM và 5 QTL là IP1, IP2, LN1, LN2, DS quy định<br />
lần lượt 25,26%; 12,26%; 19,6%; 12,43% và 8,65% sự biến động kiểu hình tính kháng bệnh đốm lá<br />
muộn. Các chỉ thị liên kết với các QTL có thể dùng cho chọn giống là PM179; GM633; GM2301<br />
IPAHM103; Lec1; seq7G02; TC9F10 và GM1760. Hai QTL LN1 và IP2 cùng nằm trên nhóm liên kết 6,<br />
có vị trí rất gần nhau và có chỉ thị PM179 liên quan tới cả hai QTL này. Đã đưa vào hệ thống khảo<br />
nghiệm Quốc gia và khảo nghiệm sản xuất 04 giống lạc triển vọng, kháng bệnh đốm lá muộn điểm 13: ĐM1, ĐM2, ĐM3, ĐM4 vượt so với giồng đối chứng L14 từ 16,5% đến 23,0%.<br />
Từ khóa: Lạc đốm lá muộn, Chỉ thị phân tử, Bản đồ chỉ thị phân tử liên kết.<br />
<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Bệnh đốm lá muộn là một trong những<br />
bệnh lá gây hại nghiêm trọng đối với cây lạc<br />
trên toàn thế giới. Bệnh nặng có thể gây tổn thất<br />
50 – 70% sản lượng trong một vụ Tác nhân gây<br />
bệnh đốm lá muộn là nấm Phaeoisariopsis<br />
personata (Berk. & M.A. Curtis van Arx).<br />
Nguồn gen kháng bệnh đốm lá muộn có ở một<br />
số ít giống lạc trồng, trong khi một số loài lạc<br />
hoang dại Arachis có khả năng kháng cao với<br />
bệnh đốm lá muộn (Tiwari và Cs 1984). Nhưng<br />
có hạn chế lớn trong việc chuyển gen từ loài lạc<br />
hoang dại Arachis vào lạc trồng bởi vì khả năng<br />
kết hợp. Kỹ thuật sinh học phân tử có khả năng<br />
khắc phục các mặt hạn chế đó, rút ngắn thời<br />
gian và tăng hiệu quả chuyển các gen kháng<br />
bệnh tử loài hoang dại vào giống lạc trồng có<br />
năng suất cao.<br />
Công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử<br />
(MAS) giúp các nhà chọn giống loại trừ được<br />
các tính trạng không mong muốn liên kết trong<br />
các phép lai và chọn lọc. Do đó, việc nghiên cứu<br />
xác định các chỉ thị phân tử có liên quan đến<br />
tính kháng bệnh đốm lá muộn góp phần thiết<br />
thực trong việc chọn tạo giống kháng bệnh. Việc<br />
nghiên cứu di truyền tính trạng năng suất giúp<br />
các nhà chọn giống có thể quy tụ những đặc tính<br />
năng suất vào một cá thể.<br />
<br />
494<br />
<br />
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
2.1. Vật liệu<br />
- Tập đoàn giống: gồm 64 dòng/giống<br />
lạc, trong đó 21 dòng/giống được nhập nội và<br />
43 dòng giống trong nước.<br />
- Thiết bị và hóa chất: Các thiết bị máy<br />
móc, vật liệu hóa chất chuyên dụng trong<br />
nghiên cứu sinh học phân tử & các hóa chất<br />
thông dụng khác. Tổng số 425 chỉ thị vệ tinh<br />
SSR ở lạc.<br />
- Vật liệu dùng cho lấy mẫu, phân lập và<br />
lây nhiễm bệnh nhân tạo: Các chủng nấm đốm<br />
lá muộn lạc thu thập từ các vùng có dịch bệnh<br />
để đánh giá bệnh nhân tạo.<br />
2.2. Phương pháp<br />
- Phương pháp CTAB cải tiến để tách<br />
chiết ADN.<br />
- Phương pháp PCR và điện di trên gel<br />
polyacrylamide để phân tích các chỉ thị SSR.<br />
- Phương pháp MAP MAKER QTL để<br />
lập bản đồ di truyền liên kết.<br />
- Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng:<br />
Theo quy trình kỹ thuật sản xuất lạc của Bộ<br />
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ban<br />
hành, được thiết kế theo khối ngẫu nhiên<br />
RCBD với 3 lần nhắc lại.<br />
<br />
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai<br />
<br />
3.1. Thu thập, đánh giá, xây dựng nguồn vật<br />
liệu<br />
<br />
Đánh giá tính kháng bệnh đốm muộn của<br />
tập đoàn 64 giống lạc thu thập được cho thấy<br />
có 2 giống: số 9 (CNC3) và giống số 16(<br />
TB25) năng suất cao nhưng bị nhiễm nặng với<br />
bệnh đốm lá muộn, tỷ lệ bệnh từ 11,22 13,74%; chỉ số bệnh từ 1,55 - 1,77%. Giống A.<br />
hypoyca × A. cardenasii (TN6) kháng cao với<br />
bệnh đốm lá muộn (điểm 1), tỷ lệ bệnh 1,62%;<br />
chỉ số bệnh 0,15%.<br />
<br />
3.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm hạt của các<br />
mẫu giống<br />
<br />
3.2. Lập bản đồ QTLs liên kết tính trạng<br />
kháng bệnh đốm lá muộn<br />
<br />
Đã thu thập được một tập đoàn lạc gồm<br />
64 mẫu giống từ nguồn trong nước và nhập<br />
nội. Trong tập đoàn 67,2% là giống lạc địa<br />
phương, 32,8% là các giống lạc nhập nội.<br />
<br />
3.2.1. Sàng lọc chỉ thị đa hình giữa hai giống<br />
bố mẹ của quần thể lập bản đồ TB25/TN6<br />
<br />
- Phương pháp đánh giá, điều tra, lây<br />
bệnh bệnh đốm lá muộn: theo phương pháp<br />
của Viện Bảo vệ Thực vật và Viện Nghiên cứu<br />
Quốc tế Cây trồng cạn (ICRISAT).<br />
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO<br />
LUẬN<br />
<br />
3.1.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh đốm<br />
muộn của tập đoàn giống<br />
<br />
Đã sử dụng 425 chỉ thị trong sàng lọc,<br />
đánh giá đa hình giữa các giống bố mẹ của<br />
quần thể lập bản đồ để tìm các chỉ thị phân tử<br />
đa hình phục vụ cho mục đích lập bản đồ.<br />
<br />
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 <br />
<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 <br />
<br />
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 <br />
<br />
5556 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 <br />
<br />
Hình 1. Kết quả đánh giá đa hình hai giống lạc TB25 và TN6 để sàng lọc chỉ thị đa hình<br />
dùng cho lập bản đồ.<br />
Hình 1 cho thấy, hai giống TB25 và TN6<br />
sàng lọc với 54 chỉ thị cho kết quả 13 chỉ thị<br />
cho đa hình, đó là các chỉ thị số13, 14, 15, 24,<br />
26, 31, 32, 39, 41, 44, 47, 48, 52.<br />
<br />
Tiếp tục sàng lọc các chỉ thị khác, kết<br />
quả là, trong tổng số 425 chỉ thị sử dụng, chỉ có<br />
60 chỉ thị đa hình được dùng để lập bản đồ trên<br />
quần thể BC2F1. Danh sách các chỉ thị cho đa<br />
hình được tổng hợp trong bảng 1.<br />
<br />
Bảng 1. Chỉ thị đa hình giữa hai giống bố mẹ của quần thể lập bản đồ<br />
TT<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
10<br />
11<br />
12<br />
<br />
Tên chỉ thị<br />
Seq13A7<br />
Seq 1B09<br />
Seq13E06<br />
Seq14C11<br />
Seq7G02<br />
Seq17C09<br />
Seq19A5<br />
Seq3F05<br />
Seq3A08<br />
Seq2A05<br />
Seq3E10<br />
Seq8D09<br />
<br />
TT<br />
13<br />
14<br />
15<br />
16<br />
17<br />
18<br />
19<br />
20<br />
21<br />
22<br />
23<br />
24<br />
<br />
Tên chỉ thị<br />
Seq10B01<br />
Seq14B04<br />
GM1501<br />
GM633<br />
GM660<br />
GM1760<br />
GM1979<br />
GM2009<br />
GM2301<br />
GM1883<br />
GM2407<br />
GNB560<br />
<br />
TT<br />
25<br />
26<br />
27<br />
28<br />
29<br />
30<br />
31<br />
32<br />
33<br />
34<br />
35<br />
36<br />
<br />
Tên chỉ thị<br />
GNB686<br />
GNB1062<br />
GNB38<br />
TC5A06<br />
TC1A08<br />
TC4F12<br />
TC9F04<br />
TC9F10<br />
TC5A06<br />
TC1A02<br />
TC4D09<br />
TC4G02<br />
<br />
TT<br />
37<br />
38<br />
39<br />
40<br />
41<br />
42<br />
43<br />
44<br />
45<br />
46<br />
47<br />
48<br />
<br />
Tên chỉ thị<br />
TC3B04<br />
TC3E05<br />
TC7H11<br />
TC9B07<br />
TC1D12<br />
PM73<br />
PM3<br />
PM179<br />
PM188<br />
Seq2H8<br />
IPAHM395<br />
IPAHM606<br />
<br />
TT<br />
49<br />
50<br />
51<br />
52<br />
53<br />
54<br />
55<br />
56<br />
57<br />
58<br />
59<br />
60<br />
<br />
Tên chỉ thị<br />
IPAHM524<br />
IPAHM103<br />
IPAHM272<br />
IPAHM531<br />
IPAHM176<br />
IPAHM282<br />
IPAHM352<br />
IPAHM356<br />
GM1878<br />
S09<br />
Lec1<br />
GM2689<br />
<br />
495<br />
<br />
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br />
<br />
3.2.2. Phân tích di truyền tính kháng bệnh<br />
đốm lá muộn<br />
Sự di truyền tính kháng bệnh đốm lá<br />
muộn thể hiện qua các chỉ tiêu được theo dõi<br />
<br />
(IP, LN, DS) trên quần thể BC1F2. Số liệu phân<br />
tích các chỉ tiêu liên quan đến tính kháng bệnh<br />
đốm muộn trên quần thể được đưa vào phân<br />
tích thống kê.<br />
<br />
Bảng 2. Phân tích thống kê các chỉ tiêu nghiên cứu trên quần thể BC2F1<br />
Chỉ số<br />
<br />
Giá trị TB Độ lệch<br />
Độ xiên (Sk)<br />
(X)<br />
chuẩn (s)<br />
<br />
Độ nhọn<br />
(Kur)<br />
<br />
IP<br />
<br />
28,67<br />
<br />
3,05<br />
<br />
0,935<br />
<br />
-<br />
<br />
LN<br />
<br />
19,2<br />
<br />
11,56<br />
<br />
0,129<br />
<br />
1,355<br />
<br />
DS<br />
<br />
5,4<br />
<br />
0,9<br />
<br />
-0,681<br />
<br />
-1,786<br />
<br />
Giá trị<br />
χ2 TN<br />
<br />
Giá trị<br />
χ2 LT (p=0.01)<br />
<br />
Đồ thị biểu diễn các tính trạng liên quan đến bệnh đốm lá muộn (IP, LN, DS) được thể<br />
hiện ở các hình sau:<br />
<br />
7 ngày 14 ngày 21 ngày <br />
A ‐ Triệu chứng bệnh <br />
<br />
1‐10 11‐20 21‐40 41‐50 trên 50<br />
B - Vết bệnh/lá<br />
<br />
1 3 5 7 9 <br />
C‐ Cấp bệnh <br />
<br />
Hình 2. Đồ thị sự phân bố các giá trị của chỉ số IP(A); LN (B); DS (C) trên quần thể nghiên cứu<br />
BC2F1.<br />
Ba chỉ số IP, LN và DS sẽ được sử dụng<br />
để nghiên cứu tiếp nhằm xác định các locut<br />
tính trạng số lượng quy định tính kháng bệnh<br />
đốm lá muộn ở lạc.<br />
<br />
3.2.3. Lập bản đồ, phân tích và xác định các<br />
chỉ thị phân tử liên kết với QTL/gen kháng<br />
đốm muộn.<br />
Sử dụng 60 chỉ thị SSR cho đa hình giữa<br />
hai giống bố mẹ TB25 và TN6. Ghi nhận các<br />
alen của từng locut SSR đối với các cây bố mẹ<br />
và mỗi cá thể BC1F2.<br />
<br />
Hình 3. Sử dụng chỉ thị Seq13A7, chỉ thị Seq7G02 & chỉ thị Seq3A08 phân tích các cá thể của<br />
quần thể BC2F1 trên gel polyacrylamide 6% (A.TB25, B.TN6, H. Cá thể dị hợp tử)<br />
<br />
Hình 4. Sử dụng chỉ thị Seq3A10, chỉ thị GM1501 & chỉ thị GM660 phân tích các cá thể của quần<br />
thể BC2F2 trên gel polyacrylamide 6% (A.TB25, B.TN6, H. Cá thể dị hợp tử)<br />
<br />
496<br />
<br />
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai<br />
<br />
Hình 5. Sử dụng chỉ thị TC4F12, chỉ thị GNB38 & chỉ thị TC1D12 phân tích các cá thể của quần<br />
thể BC2F1 trên gel polyacrylamide 6% (A.TB25, B.TN6, H. Cá thể dị hợp tử)<br />
Số liệu được ghi nhận lại và fomat dưới dạng phù hợp để phân tích trên chương trình<br />
MapMaker 3.0 của Lander.<br />
<br />
Hình 6. Bản đồ nhóm liên kết LG1-LG16 đối với 58 cặp mồi sử dụng phân tích trên phần mềm<br />
Map Maker. LOD = 3.<br />
b. Xác định các chỉ thị phân tử liên kết với<br />
QTL/gen kháng đốm muộn<br />
Các số liệu quan sát của 3 chỉ số IP, LN<br />
và DS quần thể BC2F1 được nhập vào bản đồ<br />
nhóm liên kết để xử lý trong chương trình<br />
<br />
MAPMAKER/QTL 1.1 và QTL Cartoghrapher<br />
1.17. Kết quả cho thấy trên bản đồ liên kết có 5<br />
QTL chi phối các locut IP (gồm 2 QTL IP1,<br />
IP2), LN (gồm 2 QTL LN1, LN2) và DS (gồm<br />
1 QTL).<br />
<br />
Hình 7. Bản đồ nhóm liên kết với các QTL quy định tính kháng<br />
bệnh đốm lá muộn đối với các locut IP, LN và DS trên cây lạc<br />
3.3. Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng<br />
bệnh đốm muộn bằng chỉ thị phân tử<br />
<br />
3.3.2. Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết QTL<br />
kháng bệnh đốm muộn trong chọn giống<br />
<br />
3.3.1. Phát triển và đánh giá chọn lọc các cá<br />
thể quần thể lập bản đồ phục vụ cho công tác<br />
chọn giống<br />
<br />
Sử dụng giống nhận gen kháng CNC3 có<br />
các đặc tính tương tự như giống TB25 và vẫn<br />
giống kháng bệnh là TN6 làm giống cho gen.<br />
Tiến hành lai tạo để tạo ra các thế hệ con lai F1,<br />
BC1F1, BC2 F1,… Kết quả đã lai tạo được 18 cá<br />
thể F1(CNC3/TN6). Các cá thể ở thế hệ F1 được<br />
đưa vào đánh giá kiểm tra xác định đúng con lai<br />
để tiếp tục phát triển các thế hệ tiếp theo. Tổng<br />
số 18 con lai F1(CNC3/TN6) của các tổ hợp lai<br />
<br />
Từ kết quả sàng lọc 96 cá thể BC2F1, kết<br />
quả chọn được 60 cá thể mang gen kháng bệnh<br />
đốm lá muộn. Phát triển 60 cá thể ở thế hệ<br />
BC2F1 thành 60 dòng BC2F2 ở thế hệ tiếp theo,<br />
đã chọn được 17 dòng BC2F2 có tiềm năng năng<br />
suất >20g/cây, dạng hình đẹp, triển vọng.<br />
<br />
497<br />
<br />
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br />
<br />
đã thu được 48 cá thể BC2F1. Các cá thể này sẽ<br />
được kiểm tra để xác định gen đốm lá muộn<br />
<br />
bằng các chỉ thị liên kết:<br />
<br />
Hình 8: Sử dụng chỉ thị TC9F10, chỉ thị GM1760 & chỉ thị IPAHM356 để chọn cá thể mang gen<br />
kháng thế hệ BC2F1, CNC3; B. TN6; H. con lai được chọn<br />
Với chỉ thị TCF10; IPAHM356;<br />
GM1760 đã chọn được 4 cá thể; 3 cá thể và 5<br />
cá thể mang gen kháng bệnh đốm lá muộn. Các<br />
<br />
cá thể này sẽ được chọn để phát triển các thế hệ<br />
tiếp theo.<br />
<br />
Hình 9: Sử dụng chỉ thị IPAHM103 & chỉ thị IPAHM356 để chọn cá thể mang gen kháng thế hệ<br />
BC2F1 với A.CNC3; B. TN6; H.con lai được chọn.<br />
Với chỉ thị IPAHM103 đã chọn được 6<br />
cá thể, chỉ thị IPAHM356 đã chọn được 7 cá<br />
thể mang gen kháng bệnh đốm lá muộn. Các cá<br />
<br />
thể này sẽ được chọn để phát triển các thế hệ<br />
tiếp theo.<br />
<br />
Hình 10: Sử dụng chỉ thị G2301 & chỉ thị seq7G02 để chọn cá thể mang gen kháng thế hệ BC2F1<br />
với A.CNC3; B. TN6; H. con lai được chọn.<br />
Với chỉ thị seq7G02 đã chọn được 1 cá<br />
thể mang gen kháng bệnh đốm lá muộn. Các cá<br />
thể này sẽ được chọn để phát triển các thế hệ<br />
tiếp theo.<br />
Như vậy, bằng sử phương pháp dụng chỉ<br />
thị phân tử liên kết QTL/gen kháng bệnh đốm<br />
lá muộn chúng tôi đã xác định được 29 cá thể ở<br />
thế hệ BC2F1 mang QTL liên kết gene kháng.<br />
<br />
Các cá thể này được giữ lại để tiếp tục chọn lọc<br />
trong thế hế tiếp theo.<br />
Với 29 cá thể ở thế hệ BC2F1, chúng tôi<br />
đã phát triển được 24 dòng ở thế hệ BC2F2 (từ<br />
CL1 đến CL24). Các dòng này sẽ được sàng<br />
lọc bằng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với<br />
QTL kháng bệnh đốm lá muộn.<br />
<br />
Hình 11: Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng CL1& CL4<br />
Kết quả: dòng CL1 chọn được 9 cá thể, dòng CL4 chọn được 5 cá thể, dòng CL5 chọn được 10 cá thể<br />
mang gen kháng bệnh đốm lá muộn.<br />
<br />
498<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
