Ứng dụng kỹ thuật inverse‐shifting PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 22 gây bệnh hemophilia A thể nặng

Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014<br /> <br /> ỨNG DỤNG KỸ THUẬT INVERSE‐SHIFTING PCR XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN <br /> ĐẢO ĐOẠN INTRON 22 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A THỂ NẶNG  <br /> Nguyễn Hữu Huy*, Nguyễn Thị Băng Sương**, Đỗ Thị Thanh Thủy**, Ngô Thị Hồng Phước** <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Mở  đầu:  Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X do sự thiếu hụt hoặc <br /> khiếm khuyết yếu tố VIII, một loại protein đông máu. Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/5000 trẻ trai. Bệnh <br /> Hemophilia A thể nặng (nồng độ yếu tố VIII thấp hơn 1%) chiếm khoảng 40% các trường hợp mắc bệnh. Bệnh <br /> nhân mắc bệnh dễ xuất huyết do chấn thương hay tự phát, tụ máu trong cơ, chảy máu ở khớp. Đột biến đảo đoạn <br /> intron 22 gây ra 40‐50% các trường hợp Hemophilia A thể nặng. <br /> Mục tiêu: Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 ở bệnh nhân Hemophilia A thể nặng và người nữ dị hợp tử <br /> trong gia đình bệnh nhân. <br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Thực hiện phân tích 2 gia đình với 2 bệnh nhân nam được chẩn <br /> đoán Hemophilia A thể nặng và 5 thành viên nữ. Phản ứng Inverse PCR gồm 3 bước: (a) cắt bằng enzyme BclI; <br /> (b) nối lại sản phẩm cắt tạo DNA vòng; (c) thực hiện phản ứng multiplex PCR và đọc kết quả. <br /> Kết quả: Phát hiện 2 bệnh nhân nam mang đột biến đảo đoạn intron 22, 4 người nữ dị hợp tử là người lành <br /> mang gen bệnh và 1 người nữ đang có thai là người bình thường. <br /> Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật Inverse PCR để phát hiện đột biến đảo đoạn intron <br /> 22 gây bệnh Hemophilia A thể nặng ở bệnh nhân và người lành mang gen bệnh. <br /> Từ khoá: Inverse PCR, đảo đoạn intron 22, Hemophilia A <br /> <br /> ABSTRACT <br /> APPLICATION INVERSE‐SHIFTING PCR TO IDENTIFY INVERSION INTRON 22 CAUSE  <br /> OF SEVERE HEMOPHILIA A <br /> Nguyen Huu Huy, Nguyen Thi Bang Suong, Do Thi Thanh Thuy, Ngo Thi Hong Phuoc <br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 202 ‐ 207 <br /> Introduction:  Hemophilia A is a recessive X‐linked genetic disorder caused by missing or defective factor <br /> VIII, a clotting protein. Hemophilia A occurs in approximately 1 in 5,000 live births. Severe hemophilia A (factor <br /> levels less than 1%) represents approximately 40% of cases. People with severe hemophilia A experience bleeding <br /> following an injury and may have frequent spontaneous bleeding episodes, often into their joints and muscles. <br /> Factor VIII intron 22 inversions (Inv22) cause 40%–50% of severe cases of hemophilia A. <br /> Objective: Identify inversion intron 22 in severe Hemophilia A patients and heterozygous female carriers. <br /> Patients  and  Method:  To  conduct  the  genetic  analysis  in  2  families  of  2  patients  diagnosed  of  severe <br /> hemophilia  A  and  5  female  members.  Inverse  PCR  involved  3  steps:  (a)  BclI  restriction;  (b)  self‐ligation  of <br /> restriction fragments, providing BclI rings; and (c) standard multiplex‐PCR analysis.  <br /> Results: 2 male patients had intron 22 inversion, 4 female members were carrier and 1 female member, who <br /> was pregnant, was fortunately non carrier. <br /> Conclusion:  We  have  successfully  applied  inverse  PCR  to  identify  inversion  intron  22  cause  of  severe <br /> Hemophilia A. This helped for the detection of patients and identification of female carriers. <br /> Keywords: Inverse PCR, inversion intron 22, Hemophilia A <br /> * Khoa sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên,TPHCM.  ** Đại học Y Dược TPHCM. <br /> Tác giả liên lạc: TS.BS Nguyễn Thị băng Sương  , ĐT: 0914007038  , Email: suongnguyenmd@gmail.com <br /> <br /> 202<br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> Hemophilia  A  là  căn  bệnh  rối  loạn  đông <br /> máu di truyền nghiêm trọng do sự thiếu hụt hay <br /> khiếm khuyết yếu tố VIII đồng thời đây cũng là <br /> căn bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể <br /> giới tính X phổ biến nhất với tần suất mắc bệnh <br /> là 1/5000 trẻ trai(1). Nguyên nhân gây bệnh là do <br /> đột  biến  trên  gen  F8  nằm  trên  cánh  dài  nhiễm <br /> sắc thể giới tính X tại vị trí Xq28, gen có chiều dài <br /> 186 kb, gồm 26 exon và mã hóa cho RNA dài 9 <br /> kb(3).  Sản  phẩm  của  gen  F8  là  yếu  tố  VIII  nằm <br /> trong phức hợp hoạt hóa yếu tố X đóng vai trò <br /> rất  quan  trọng  trong  con  đường  đông  máu,  sự <br /> thiếu  hụt  yếu  tố  VIII  sẽ  dẫn  đến  rối  loạn  đông <br /> máu và các biểu hiện lâm sàng là xuất huyết tự <br /> phát hay do chấn thương nhẹ, tụ máu trong cơ, <br /> chảy  máu  ở  khớp,  đôi  khi  có  tiểu  máu.  Bệnh <br /> Hemophila  A  được  chia  thành  3  loại  dựa  vào <br /> nồng độ yếu tố VIII trong huyết thanh: thể nặng <br /> khi yếu tố VIII có nồng độ rất thấp (