Ứng dụng kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến mất đoạn gen APC

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> <br /> ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA<br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN APC<br /> Nguyễn Hữu Huy*, Đoàn Nam Khánh*, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Thị Băng Sương**<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Mở đầu: Bệnh đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis – FAP) là bệnh di truyền trội với<br /> biểu hiện lâm sàng là sự xuất hiện của hàng trăm đến hàng ngàn polyp trong đại trực tràng. Nếu không được<br /> điều trị thì 100% bệnh nhân sẽ bị ung thư đại trực tràng vào năm 35-40 tuổi. Nguyên nhân gây ra bệnh FAP là<br /> đột biến trên gen APC. Hiện nay, kĩ thuật MLPA là kĩ thuật có nhiều ưu điểm trong chẩn đoán các dạng đột biến<br /> mất đoạn gen.<br /> Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến mất đoạn gen APC gây bệnh FAP<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Chúng tôi nghiên cứu trên 35 bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng của<br /> bệnh FAP. Thực hiện tách chiết ADN từ mẫu máu, kiểm tra độ tinh sạch của ADN, chạy phản ứng MLPA, điện<br /> di mao quản và phân tích kết quả bằng phần mềm GeneMaker v1.92<br /> Kết quả: Phát hiện 1 bệnh nhân có đột biến mất đoạn. 3 thân nhân của bệnh nhân cũng có đột biến tương tự.<br /> Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy trình MLPA phát hiện đột biến mất đoạn gen APC. Cần<br /> tiếp tục nghiên cứu trên nhiều bệnh nhân nữa nhằm khẳng định giá trị của MLPA trong phát hiện và xác định<br /> các đột biến gây bệnh FAP.<br /> Từ khoá: Hội chứng Gardner, APC, Giải trình tự.<br /> ABSTRACT<br /> APPLICATION OF MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION TECHNIQUE<br /> FOR DETECTING MICRODELETION OF APC GENE<br /> Nguyen Huu Huy, Đoan Nam Khanh, Le Minh Khoi, Nguyen Thi Bang Suong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 80 - 85<br /> <br /> Introduction: Familial adenomatous polyposis (FAP) is an autosomal dominant inherited disorder<br /> characterized by the early onset of hundreds to thousands of adenomatous polyps throughout the colon. If left<br /> untreated, all patients with this syndrome will develop colon cancer by age 35-40 years. In addition, an increased<br /> risk exists for the development of other malignancies. Familial adenomatous polyposis results from mutations in<br /> the APC gene. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) techique has many advantages in<br /> detecting genomic microdeletions or duplications.<br /> Objective: We studied the application of MLPA technique to diagnose mutations in APC gene cause<br /> Familial adenomatous polyposis.<br /> Patients and Methods: 35 patients with clinical manifestations of FAP. DNA extracted from whole blood<br /> samples was tested for purity then MLPA and capilary electrophoresis were performed. The results were analysed<br /> by GeneMaker software version 1.92<br /> Results: One patient showed deletion. Three relatives’s patient had deletion.<br /> Conclusions: We have sucessfully applied the MLPA technique in detecting microdeletion of APC gene.<br /> <br /> <br /> * Đại học Khoa học tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc : PGS TS. Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0914007038 Email: suongnguyenmd@gmail.com<br /> <br /> 80 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> More investigations of larger scale need to be done to verify the value of MLPA in detecting and characterizing the<br /> mutations causing FAP.<br /> Keywords: Familial adenomatous polyposis, APC gene, MLPA.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> <br /> Bệnh đa polyp tuyến gia đình (Familial Đối tượng nghiên cứu<br /> adenomatous polyposis – FAP) là bệnh di truyền Nhóm nghiên cứu: 35 bệnh nhân đa polyp<br /> trội với biểu hiện lâm sàng là sự xuất hiện của đại trực tràng không phát hiện đột biến điểm<br /> hàng trăm đến hàng ngàn polyp trong đại trực gen APC và gia đình của một bệnh nhân phát<br /> tràng. Các polyp này ban đầu là lành tính nhưng hiện đột biến mất đoạn gen APC.<br /> dần trở thành ác tính, nếu không được điều trị Nhóm chứng: gồm 10 người bình thường,<br /> thì 100% bệnh nhân sẽ bị ung thư đại trực tràng tiền sử gia đình không có ai mắc bệnh di truyền.<br /> vào năm 35-40 tuổi (8). Bệnh đa polyp tuyến gia Phương pháp nghiên cứu<br /> đình khởi phát sớm, trung bình vào khoảng 16 Kỹ thuật tách chiết ADN từ 200 μl máu ngoại<br /> tuổi. Bên cạnh nguy cơ ung thư đại trực tràng, vi<br /> bệnh còn làm gia tăng nguy cơ mắc nhiều loại Máu tươi được chống đông bằng EDTA,<br /> ung thư khác như ung thư dạ dày, tá tràng, ung được tách trong vòng 24 giờ. Quy trình tách chiết<br /> thư nguyên bào gan, ung thư tụy, ung thư tuyến ADN từ 200μl máu ngoại vi được tiến hành theo<br /> giáp,...(5). Nguyên nhân gây bệnh FAP là do đột QiAgen Kit. Đo nồng độ và độ tinh sạch của<br /> biến trên gen APC. Gen APC nằm ở vị trí 5q22.2, ADN. Những mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ<br /> mã hóa cho protein APC tham gia vào phức hợp quang đo ở bước sóng 260/280 đạt 1,8-2,0 mới<br /> phân hủy β-catenin. Khi đột biến xảy ra trên gen được sử dụng để tiến hành phản ứng MLPA.<br /> APC sẽ làm β-catenin tích tụ và đi vào nhân, kích Phản ứng MLPA<br /> hoạt yếu tố phiên mã TCF/LEF hoạt động, kích Sử dụng SALSA MLPA Kit P043-APC<br /> thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào dẫn probemix (MRC- Holland) chứa 29 probe lai đặc<br /> đến ung thư(4). hiệu với 15 exon của gen Dystrophin, ngoài ra<br /> Về mặt di truyền học, có nhiều kiểu đột còn có 11 probe nội chuẩn giúp kiểm tra sai sót<br /> biến trên gen APC, ngoài các dạng đột biến trong quá trình tiến hành phản ứng MLPA. Phản<br /> điểm thì còn có các dạng đột biến mất đoạn ứng lai: 100 ng genomic ADN (hòa trong 5 μl)<br /> khó phát hiện bằng phương pháp giải trình tự. được biến tính và lai với 1,5 μl hỗn hợp probe<br /> Để phát hiện dạng đột biến mất đoạn có thể sử cùng với 1,5 μl buffer MLPA. Sau đó lai ở 600C<br /> dụng nhiều phương pháp khác nhau như trong vòng 16 giờ (qua đêm). Phản ứng nối: Cho<br /> FISH (fluorescence in situ hybridization), PCR enzyme ligase vào và ủ ở 540C (15’). Sau đó tăng<br /> định lượng, long-range PCR. Kỹ thuật MLPA nhiệt độ lên 980C (5’) để phá hủy ligase và tiến<br /> ra đời năm 2002 và được MRC-Holland phát hành thực hiện quy trình nhiệt của phản ứng<br /> triển, là một bước tiến mới trong chẩn đoán PCR để khuếch đại các probe. Khi phản ứng<br /> các bệnh di truyền. Nhiều nghiên cứu chỉ ra PCR kết thúc, giảm nhiệt độ xuống 40C. Phản<br /> rằng MLPA là phương pháp dễ dàng, nhanh ứng PCR: Thành phần phản ứng PCR gồm<br /> chóng, hiệu quả, kinh tế và phù hợp trong việc primer, polymerase, buffer, dNTP, nước. Chu kỳ<br /> phát hiện các đột biến mất đoạn. Xuất phát từ nhiệt: 900C (20“), 650C (80“), lặp lại 35 chu kỳ.<br /> thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài với Sau đó kéo dài kết thúc ở 720C (20’). Cuối cùng,<br /> mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA phát hiện nhiệt độ được hạ xuống còn 40C. Điện di và phân<br /> đột biến mất đoạn gen APC gây bệnh FAP. tích kết quả: Điện di mao quản trên máy<br /> Beckman Coulter. Sử dụng phần mềm<br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 81<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> GeneMarker v1.92 (Softgenetics, State College, số bản sao từng exon của gen APC (theo protocol<br /> PA) để phân tích kết quả. của MRC-Holland). Nhóm chứng được thực<br /> Cách phân tích dữ liệu MLPA hiện phản ứng MLPA đồng thời với mẫu bệnh<br /> nhân và cho kết quả tỷ lệ các đỉnh sóng là 1. Đối<br /> Kết quả MLPA của các mẫu sẽ được hiển thị<br /> với người bình thường, tỷ lệ đỉnh sóng so với<br /> dưới dạng bảng và biểu đồ sóng. Mỗi đỉnh tín<br /> nhóm chứng sẽ là 1±0.3. Nếu tỷ lệ đỉnh sóng <<br /> hiệu (peak) là sản phẩm của một probe. Kích<br /> 0.7 chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến mất đoạn.<br /> thước của mỗi peak được xác định nhờ so sánh<br /> Tỷ lệ đỉnh sóng >1.37 chứng tỏ bệnh nhân mang<br /> với thang kích thước và mẫu đối chứng để tính<br /> đột biến lặp đoạn.<br /> ra tỉ lệ DQ (Dosage quotients). Từ đó tính được<br /> KẾT QUẢ<br /> Kết quả MLPA của mẫu bệnh nhân FAP04<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả MLPA của mẫu FAP04. Màu đỏ đậm (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu xanh nhạt (bên phải):<br /> mẫu nghiên cứu<br /> Nhận xét: Đỉnh tín hiệu của các probe của bệnh nhân và mẫu đối chứng tương đương nhau về kích<br /> thước, chứng tỏ bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn gen APC trong vùng khảo sát.<br /> Kết quả MLPA của mẫu bệnh nhân FAP05<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả MLPA của mẫu FAP05. Màu đỏ đậm (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu xanh nhạt (bên phải):<br /> mẫu nghiên cứu<br /> <br /> <br /> <br /> 82 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Kết quả MLPA của mẫu FAP08. Màu đỏ đậm (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu xanh nhạt (bên phải):<br /> mẫu nghiên cứu<br /> Nhận xét: Đỉnh tín hiệu của các probe của bệnh nhân và mẫu đối chứng tương đương nhau về kích<br /> thước, chứng tỏ bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn gen APC trong vùng khảo sát.<br /> Kết quả MLPA của mẫu bệnh nhân FAP08<br /> Nhận xét: Đỉnh tín hiệu của các probe của bệnh nhân và mẫu đối chứng tương đương nhau về kích<br /> thước, chứng tỏ bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn gen APC trong vùng khảo sát.<br /> Kết quả MLPA của mẫu bệnh nhân FAP 40<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Kết quả MLPA của bệnh nhân FAP 40. Màu đỏ đậm (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu xanh nhạt (bên<br /> phải): mẫu nghiên cứu<br /> Nhận xét: Đỉnh tín hiệu của probe 03324- mẫu đối chứng, chứng tỏ bệnh nhân bị đột biến<br /> L02527 nằm trên exon 15 của gen APC ở bệnh mất đoạn gen APC tại vùng exon 15.<br /> nhân FAP40 có kích thước xấp xỉ bằng ½ so với<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 83<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> <br /> Kết quả phân tích gen APC của gia đình FAP 40<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Kết quả của bố bệnh nhân FAP 40<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Kết quả của em bệnh nhân FAP 40<br /> Kết quả của con bệnh nhân FAP 40 Kết quả của mẹ bệnh nhân FAP 40<br /> Hình 5. Kết quả phân tích gen APC của gia đình bệnh nhân FAP 40 Màu đỏ đậm (cột phía bên trái): mẫu đối chứng.<br /> Màu xanh nhạt (bên phải): mẫu nghiên cứu<br /> Nhận xét: Phân tích gen APC của 04 thành thống kê cụ thể về tỷ lệ mắc bệnh FAP. Trên lâm<br /> viên trong gia đình bệnh nhân FAP 40, là bệnh sàng, bệnh đặc trưng bởi sự hiện diện rất nhiều<br /> nhân bị đột biến mất đoạn trên exon 15, tại vị polyp tuyến ở đại tràng, thường trên 100 polyp<br /> trí probe 03324-L02527, chúng tôi nhận thấy ở (khoảng 100-2000 polyp). Chúng có thể gây chảy<br /> bố bệnh nhân, tại đỉnh tương ứng với probe máu và xuất hiện máu ở trong phân. Nếu bệnh<br /> 03324-L02527 có chiều cao đỉnh chỉ bằng ½ so tiến triển ác tính sẽ gây sụt cân, di căn vào gan<br /> với mẫu đối chứng. Điều này chứng tỏ người hoặc nơi khác. FAP có thể xuất hiện với các triệu<br /> bố bị đột biến mất đoạn trên exon 15 giống chứng khác như phì đại lớp biểu mô sắc tố võng<br /> con của ông. Trong khi đó kết quả của người mạc, u mang quai hàm, u nang mỡ hoặc khối u<br /> mẹ hoàn toàn bình thường, điều này chứng tỏ xương lành tính. Cần phát hiện sớm các polyp<br /> bệnh nhân đã nhận gen bệnh được di truyền tiền ung thư và cắt bỏ chúng trước khi trở thành<br /> từ người bố. Phân tích tương tự với kết quả ác tính. Bệnh nhân đã bị polyp tuyến thường có<br /> MLPA của người con và em bệnh nhân chúng nguy cơ tái phát cao, khả năng tái phát là 25-30%<br /> tôi thấy cả 02 người này đều là người có mang trong 3 năm đầu sau khi cắt polyp. Những người<br /> gen APC bị đột biến mất đoạn. có liên hệ huyết thống bậc 1 (cha, mẹ, anh chị<br /> em, con ruột) với bệnh nhân đã được chẩn đoán<br /> BÀN LUẬN mắc bệnh FAP sẽ có nguy cơ bị polyp tuyến và<br /> Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial ung thư đại trực tràng cao hơn dân số chung. Do<br /> adenomatous polyposis-FAP) là bệnh di truyền đó, họ cần phải được tầm soát nguy cơ mắc bệnh<br /> trội trên nhiễm sắc thể thường được mô tả lần như những người có nguy cơ cao(1).<br /> đầu tiên vào năm 1925(7). Ở Mỹ, bệnh FAP có tần<br /> Trước đây, FISH được sử dụng rất rộng rãi<br /> suất 1/10.000 – 1/6.000, ở Việt Nam hiện chưa có<br /> <br /> <br /> 84 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> trong các xét nghiệm liên quan đến đột biến trên phương pháp MLPA. Hiện tại, chúng tôi mới<br /> nhiễm sắc thể và hiện nay một số phòng thí chỉ phát hiện được 01 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ<br /> nghiệm vẫn coi đó là tiêu chuẩn vàng cho một số 1,9% bị đột biến mất đoạn. Có sự khác biệt so<br /> loại bệnh. Tuy nhiên FISH lại là một phương với các nghiên cứu khác, có thể do số lượng<br /> pháp tốn nhiều công lao động, đòi hỏi thời gian mẫu nghiên cứu còn hạn chế, cũng có thể do<br /> và sự tỉ mỉ, không thể tự động hóa được. Thêm yếu tố chủng tộc. Cần nghiên cứu thêm trên cỡ<br /> vào đó, các hóa chất sử dụng cho FISH cũng rất mẫu lớn hơn ở bệnh nhân FAP Việt Nam để có<br /> độc hại. Về mặt hiệu quả của xét nghiệm, FISH số liệu chính xác hơn.<br /> có độ nhạy thấp hơn so với MLPA, kỹ thuật KẾT LUẬN<br /> FISH cũng không xác định được các đột biến vi<br /> mất đoạn. Những lợi thế quan trọng của MLPA Chúng tôi đã thành công trong việc hoàn<br /> làm cho kỹ thuật này được phát triển ứng dụng thiện quy trình và ứng dụng MLPA vào chẩn<br /> rộng rãi hơn. MLPA tương đối đơn giản vì đã đoán bệnh FAP. kỹ thuật MLPA là lựa chọn phù<br /> được nghiên cứu và cho ra thành phẩm thương hợp trong chẩn đoán bệnh FAP nói riêng và các<br /> mại, chi phí thấp và quay vòng nhanh (chỉ mất 2 bệnh di truyền mất đoạn gen nói chung. Cần<br /> ngày), có các probe kiểm tra độ chính xác ngay tiếp tục nghiên cứu trên nhiều bệnh nhân nữa<br /> trong phản ứng cũng như so sánh dễ dàng mẫu nhằm khẳng định giá trị của MLPA trong phát<br /> đối chứng (thường là người bình thường). hiện và xác định đặc trưng những trường hợp<br /> đột biến mất đoạn gen APC hiếm gặp.<br /> Phân tích gen APC bằng kỹ thuật MLPA<br /> của 35 mẫu bệnh nhân không tìm được đột TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> biến điểm APC bằng phương pháp giải trình 1. Burt RW, et al. (2010), “NCCN clinical practice guidelines in<br /> oncology. Colorectal cancer screening”, J Natl Compr Canc<br /> tự, chúng tôi phát hiện 01 bệnh nhân (FAP40) Netw, 8(1):8-61<br /> bị đột biến mất đoạn tại probe 03324-L02527 2. Cao X, et al. (2006), “Singapore familial adenomatous<br /> thuộc exon 15. Các bệnh nhân còn lại không polyposis (FAP) patients with classical adenomatous<br /> polyposis but undetectable APC mutations have accelerated<br /> phát hiện được đột biến mất đoạn trên các cancer progression”, Am J Gastroenterol, 101(12):2810-7.<br /> vùng gen APC. Các mẫu đều cho kết quả các 3. Chiang JM, et al. (2010), “Mutation analysis of the APC gene<br /> in Taiwanese FAP families: low incidence of APC germline<br /> đoạn kiểm soát chất lượng đạt yêu cầu, điều mutation in a distinct subgroup of FAP families”, Fam Cancer,<br /> này chứng tỏ chúng tôi đã ứng dụng thành 9(2): 117-24.<br /> công quy trình kỹ thuật phương pháp MLPA 4. Fearnhead NS, Britton MP and Bodmer WF (2001), “The ABC<br /> of APC”, Human Molecular Genetics; 10(7): 721-733.<br /> để phát hiện những mất thường lớn trên exon. 5. Half, Elizabeth, Dani Bercovich, and Paul Rozen<br /> Một nghiên cứu thực hiện kỹ thuật MLPA để (2009),“Familial Adenomatous Polyposis.”, Orphanet Journal<br /> of Rare Diseases, 4: 22.<br /> tìm đột biến mất đoạn và lặp đoạn gen APC<br /> 6. Kerr SE, et al (2013), “APC germline mutations in individuals<br /> trên các bệnh nhân tại bang Minnesota, Mỹ, cho being evaluated for familial adenomatous polyposis: a review<br /> thấy trong số 431 đột biến ghi nhận được có 6% là of the Mayo Clinic experience with 1591 consecutive tests”, J<br /> các đột biến mất đoạn và lặp đoạn lớn(6). Nghiên Mol Diagn, 15(1):31-43.<br /> 7. Lockhart-Mummery P (1925), “CANCER AND HEREDITY”,<br /> cứu của Cao X năm 2006 phát hiện được 05/50 gia<br /> The Lancet, 205(5296): 427-429.<br /> đình có đột biến mất đoạn (chiếm 10%)(2). Phân 8. Sheng JQ, et al (2010), “APC gene mutations in Chinese<br /> tích của Chiang JM năm 2010 cho thấy có 03/28 familial adenomatous polyposis patients”, World J<br /> Gastroenterol, 16(12):1522-6.<br /> gia đình (chiếm 10%) mang đột biến mất<br /> đoạn(3). Như vậy có thể thấy tỷ lệ bệnh nhân Ngày nhận bài báo: 20/11/2015<br /> mang đột biến mất đoạn và lặp đoạn gen APC Ngày phản biện nhận xét bài báo: 27/11/2015<br /> có thể dao động từ 5-10%. Do đó, để phát hiện Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016<br /> được 1 đột biến mất đoạn hay lặp đoạn, chúng<br /> tôi phải phân tích tối thiểu 10 mẫu bằng<br /> <br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 85<br />