Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR chẩn đoán Escherichia coli gây tiêu chảy ở người

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

72
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết được nghiên cứu với mục tiêu nhằm phát hiện gen độc lực eae, sxt và ipaH ở các chủng E. coli phân lập từ bệnh nhân (BN) tiêu chảy bằng phản ứng multiplex-PCR. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR chẩn đoán Escherichia coli gây tiêu chảy ở người

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR CHẨN ĐOÁN ESCHERICHIA COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI Nguyễn Đắc Trung*; Nguyễn Thị Thu Thái*; Trần Quang Cảnh** TÓM TẮT Mục tiêu: phát hiện gen độc lực eae, sxt và ipaH ở các chủng E. coli phân lập từ bệnh nhân (BN) tiêu chảy bằng phản ứng multiplex-PCR. Đối tượng và phương pháp: 4 chủng chuẩn E. coli (EPEC, EIEC, EHEC và EC) và 23 chủng E. coli phân lập từ BN tiêu chảy đã được tách ADN tổng số trực tiếp từ khuẩn lạc vi khuẩn. Khuếch đại gen eae, sxt và ipaH ở các chủng chuẩn E. coli bằng phản ứng PCR và multiplex-PCR. Sử dụng phản ứng multiplex-PCR với các cặp mồi tương tự để phát hiện đồng thời gen eae, sxt và ipaH từ ADN genome các chủng E. coli phân lập từ BN tiêu chảy. Kết quả và kết luận: khuếch đại thành công gen độc lực eae, sxt và ipaH ở các chủng chuẩn EPEC, EIEC và EHEC bằng phản ứng PCR và multiplex-PCR. Với phản ứng multiplex-PCR, đã xác định được 9/23 chủng E. coli phân lập từ BN tiêu chảy có mang gen độc lực. Trong đó 2 chủng vi khuẩn thuộc nhóm EPEC (mang gen eae), 4 chủng thuộc nhóm EIEC (mang gen sxt) và 3 chủng thuộc nhóm EHEC (mang đồng thời gen eae và sxt). * Từ khóa: E. coli; Multiplex-PCR; Gen eae, sxt, ipaH. Multiplex-PCR Assay for Identification of Human Diarrheagenic Escherichia coli Summary Objectives: To identify virulent gene of eae, sxt and ipaH in the strains of E. coli isolated from diarrhea patients by multiplex-PCR assay. Subjects and methods: Four E. coli strains (EPEC, EIEC, EHEC and EC) and 23 strains of E. coli isolated from diarrhea patients were subjected to extract total DNA from bacterial colonies. Amplification of eae, sxt and ipaH genes in the standard E. coli strains were carried out by PCR and multiplex PCR. Multiplex-PCR assays with similar primer pairs were used to simultaneously detect eae, sxt and ipaH genes from the genomic DNA of E. coli strains isolated from diarrhea patients. Results and conclusions: Eae, sxt and ipaH genes were successfully amplified in EPEC, EIEC and EHEC strains by PCR and multiplex-PCR. By using multiplex-PCR, 9 out of 23 strains of E. coli isolated from diarrhea patients were identified. Two strains of EPEC (possessed single eae, four strains of EIEC (carried single sxt) and three strains of EHEC (possessed both eae and sxt). * Keywords: E. coli; Multiplex-PCR; Gene eae, sxt, ipaH. * Trường Đại học Y-Dược Thái Nguyên ** Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đắc Trung (dactrung69@gmail.com) Ngày nhận bài: 31/10/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/01/2018 Ngày bài báo được đăng: 24/01/2018 32 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Có nhiều tác nhân đường ruột gây tiêu chảy đã được ghi nhận như virut, vi khuẩn, ký sinh trùng. Trong số các vi khuẩn, nhóm E. coli gây tiêu chảy thường gặp hơn cả ở các nước đang phát triển [4]. Dựa trên đặc điểm độc lực, các chủng E. coli gây tiêu chảy ở người được phân thành nhóm STEC (shiga toxin producing E. coli), ETEC (enterotoxigenic E. coli), EPEC (enteropathogenic E. coli), EIEC (enteroinvasive E. coli), EHEC (enterohemorrhagic E. coli), EaggEC (enteroaggregative E. coli) và DAEC (diffusely adherent E. coli) [7]. Những bệnh lý tiêu chảy do E. coli có sự phối hợp của gen độc lực khác nhau giúp cho vi khuẩn gắn bám, giải phóng yếu tố tan máu và độc tố ruột. Có sự khác biệt đáng kể về trình tự và đa hình thái trong tính đồng nhất phân tử của gen mã hóa cho các yếu tố độc lực này. Trong số các gen độc lực của nhóm E. coli gây tiêu chảy phải kể đến ipaH - một gen nằm trên nhiễm sắc thể và plasmid, mã hóa cho một kháng nguyên 60 kDa và phát hiện ở các chủng EIEC; gen nhiễm sắc thể eae (E. coli attaching and effacing) mã hoá cho một protein màng ngoài có trọng lượng phân tử 94 - 97 kDa, được gọi là intimin, protein này đóng vai trò quan trọng trong định vị vi khuẩn ở ruột. Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá huỷ ở đại tràng do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô. Gen eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC; các chủng EHEC còn tạo ra cytotoxin, còn gọi là độc tố Shiga sxt (Shiga toxins). Kỹ thuật multiplex-PCR được phát triển để phát hiện đồng thời vài gen độc lực của E. coli trong một phản ứng PCR, những kỹ thuật này cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phát hiện các chủng E. coli gây tiêu chảy ở người [1, 2, 5, 6, 8]. Việc xác định các chủng E. coli gây tiêu chảy tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên mới chỉ dựa trên thử nghiệm hóa sinh. Vì vậy, chưa thể khẳng định chắc chắn những chủng vi khuẩn này có thực sự gây tiêu chảy, mang gen độc lực hay không?. Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện gen độc lực eae, sxt và ipaH ở các chủng E. coli phân lập từ BN bị tiêu chảy bằng phản ứng multiplex-PCR. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu. 4 chủng E. coli chuẩn quốc tế do Phòng Vi khuẩn Đường ruột, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, gồm: EPEC, EHEC, EIEC và EC (EC là chủng đối chứng không có gen độc lực). 23 chủng E. coli phân lập được từ BN tiêu chảy điều trị tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên từ tháng 01 đến tháng 6 - 2017. 2. Phương pháp nghiên cứu. Các chủng vi khuẩn E. coli được phân lập và định danh trên hệ thống máy tự động Vitek 2 compact 60. Các chủng chuẩn E. coli và E. coli phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng được nuôi cấy qua đêm trên môi trường thạch MPA, thu khuẩn lạc. Tách trực tiếp ADN tổng số từ khuẩn lạc theo phương pháp của Cebula và CS [3]. Khuếch đại gen độc lực eae, stx và ipaH của chủng E. coli bằng phản ứng PCR và multiplex-PCR với mồi đặc hiệu 33 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 cho gen eae 376 bp là 5’-CACACGAATAAACTGACTAAAATG-3’, gen stx 298 bp: 5’-ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA-3’ và gen ipaH 620 bp: 5’GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACC G-3’. Hỗn hợp PCR mix (Hãng Thermo Scientific) cho phản ứng multiplex-PCR gồm: 200 µM của mỗi loại dNTP; 2,5 mM MgCI2; 0,2 pmol của mỗi loại ADN mồi; 1 U Taq ADN polymerase và 1x đệm PCR (20 mM Tris-HCI, pH 8,4, 50 mM KCI), bổ sung nước khử ion tới thể tích 25 µl. Trên hệ thống luân nhiệt BioRad, thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt: 3 phút biến tính ở 940C, 30 chu kỳ (940C/1 phút; 520C/1 phút; 720C/1 phút), chu kỳ tổng hợp cuối cùng ở 720C/10 phút; chu trình nhiệt phản ứng multiplex-PCR: 3 phút biến tính ở 940C, 35 chu kỳ (940C/1 phút; 520C/1 phút; 720C/1 phút), chu kỳ tổng hợp cuối cùng ở 720C/10 phút. Kiểm tra hiệu quả quá trình khuếch đại và kích thước sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1x, nhuộm gel bằng ethidium bromide và chụp ảnh gel bằng hệ thống ghi và phân tích gel BioDoc. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả khuếch đại các gen độc lực ở chủng chuẩn E. coli bằng phản ứng PCR. * Gen độc lực eae: Trên cơ sở nghiên cứu trình tự của gen eae đã công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế, cặp mồi đặc hiệu thiết kế nhằm khuếch đại gen này bằng kỹ thuật PCR. Theo tính toán lý thuyết, việc sử dụng cặp mồi eae cho phản ứng PCR sẽ khuếch 34 đại một băng ADN có kích thước 376 bp ở các chủng: EPEC và EHEC. Các chủng EIEC và EC sẽ cho kết quả âm tính do genome của chúng không chứa gen này. Hình 1: Kết quả khuếch đại gen eae ở các chủng chuẩn E. coli. (M: Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1: EPEC; 2: EIEC; 3: EHEC; 4: EC) Phân tích kết quả điện di cho thấy phân đoạn ADN khuếch đại có kích thước khoảng 376 bp là gen eae, hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Các chủng EPEC, EHEC đều cho kết quả dương tính, các chủng EIEC và EC đều âm, kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu đã công bố [1, 5, 6, 8]. Như vậy, nếu sử dụng gen eae làm chỉ thị phân tử để chẩn đoán, tuy không phân biệt được E. coli đó thuộc nhóm nào trong các chủng EPECvà EHEC nhưng có ý nghĩa quan trọng để nhận biết đó là E. coli gây bệnh chứ không phải E. coli thông thường. * Gen độc lực stx: Các chủng thuộc E. coli nhóm EHEC sinh ra độc tố cytotoxin hay Shiga toxin T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 (stx). Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố, có các gen mã hoá nằm trên nhiễm sắc thể. Hình 2: Kết quả khuếch đại gen stx ở các chủng chuẩn E. coli. (M: Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1: EPEC; 2: EHEC; 3: EIEC; 4: EC) Trên hình ảnh điện di cho thấy băng ADN khuếch đại có kích thước khoảng 298 bp và chỉ xuất hiện ở chủng EHEC (đường số 2), các chủng còn lại (EPEC, EIEC và EC) không mang gen này. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. * Gen độc lực ipaH: EIEC là nhóm E. coli gây bệnh bằng cơ chế xâm nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc đại tràng. Các gen mã hoá cho yếu tố liên quan đến quá trình này nằm trên cả plasmid và nhiễm sắc thể. Những plasmid chứa một số gen mã hoá cho protein cần thiết của quá trình xâm nhập gồm IpaA, IpaB, IpaC, IpaD và IpaH. Trong đó, IpaH là gen chỉ có ở E. coli thuộc nhóm EIEC, gen này có kích thước khoảng 620 bp [5, 6, 8]. Trên cơ sở đó, cặp mồi IpaH đã được lựa chọn thiết kế để khuếch đại gen này bằng phản ứng PCR. Hình 3: Kết quả khuếch đại gen ipaH ở các chủng chuẩn E. coli. (M: Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1: EPEC; 2: EIEC; 3: EHEC; 4: EC) Kết quả điện di sau phản ứng PCR cho thấy một băng ADN có kích thước khoảng 620 bp được tìm thấy ở chủng EIEC (đường số 2); các băng ADN có kích thước tương tự không thấy xuất hiện ở chủng EPEC (đường 1), EHEC (đường 3) và EC (đường 4). Do đó, gen này có thể sử dụng là marker chuẩn cho nhận diện chủng EIEC. Bảng 1: Kết quả khuếch đại gen độc lực các chủng chuẩn E. coli bằng phản ứng PCR. Gen Chủng EPEC EHEC EIEC EC eae (376 bp) + + - - stx (298 bp) - + - - ipaH (620 bp) - - + - 35 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2018 Bằng việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu, thông qua phản ứng PCR, nhóm nghiên cứu đã phát hiện được một số gen độc lực trong ADN tách trực tiếp từ khuẩn lạc các chủng chuẩn E. coli. Qua bảng 1 cho thấy gen eae được tìm thấy ở chủng EPEC và EHEC, gen stx chỉ xuất hiện ở chủng EHEC và chỉ có chủng EIEC mang gen ipaH, chủng E. coli thông thường không mang gen độc lực. Kết quả thu được cũng phù hợp với những nghiên cứu đã công bố trên thế giới và ở Việt Nam [1, 2, 5, 6, 8]. Như vậy, có thể sử dụng các gen độc lực eae, stx và ipaH như chỉ thị phân tử để phát hiện chủng E. coli gây tiêu chảy. Nếu kết quả phản ứng PCR phát hiện được duy nhất gen eae sẽ cho chủng E. coli thuộc nhóm EPEC, duy nhất gen ipaH đó là chủng E. coli nhóm EIEC, phát hiện đồng thời hai gen eae và ipaH, chứng tỏ chủng E. coli thuộc nhóm EHEC. 2. Kết quả khuếch đại gen độc lực ở các chủng chuẩn E. coli bằng phản ứng multiplex-PCR. Đối với phản ứng PCR, để phát hiện được 3 chủng E. coli gây tiêu chảy (EPEC, EHEC và EIEC), cần thực hiện một loạt phản ứng PCR khác nhau với những cặp mồi tương ứng đặc hiệu cho từng chủng vi khuẩn. Với cách thức này, tuy phản ứng PCR cho kết quả có độ chính xác cao, nhưng đây chưa thể coi là phương pháp tối ưu, vì vẫn tốn nhiều thời gian và hoá chất, đó cũng chính là hạn chế của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đơn lẻ. Để tìm ra một phương pháp tối ưu hơn, kỹ thuật multiplex-PCR được lựa chọn trong nghiên cứu, chỉ với một phản ứng multiplex-PCR, 3 cặp mồi đặc hiệu 36 đã sử dụng để khuếch đại đồng thời các gen eae, stx và ipaH có trong ADN khuôn tách trực tiếp từ khuẩn lạc của chủng EPEC, EHEC và EIEC. Điều này cũng có nghĩa có thể xác định được từng chủng E. coli gây tiêu chảy kể trên chỉ bằng một phản ứng PCR, giúp khắc phục được hạn chế của các phản ứng PCR sử dụng cặp mồi riêng lẻ. Hình 4: Kết quả khuếch đại gen độc lực bằng phản ứng multiplex-PCR. (1: EHEC; 2: EIEC; 3: EPEC; M: Marker ФX 174 cắt bằng Hae III) Từ kết quả điện di sản phẩm của phản ứng multiplex-PCR cho thấy, trên các đường chạy đều xuất hiện băng ADN khá rõ, không có sản phẩm phụ. Tại đường chạy số 1 (EHEC), thu được 2 băng ADN có kích thước khác nhau, đối chiếu với ADN marker chuẩn, một băng có kích thước khoảng 298 bp (gen stx), băng còn lại có kích thước khoảng 376 bp (gen eae). Tại đường chạy số 2 (EIEC) và số 3 (EPEC), chỉ thu được một băng ADN duy nhất với kích thước lần lượt khoảng 620 bp (gen ipaH) và 376 bp (gen eae). Kết quả của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với