Ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA

Chia sẻ: Sunshine_6 Sunshine_6 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

119
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phức hệ chủ yếu hoà hợp mô ở ng-ời chiếm một vùng kho.ng từ 4 đến 5 megabaes (Mb) trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6. Trong lịch sử, kháng nguyên bạch cầu ng-ời (HLA: Human leucocyt Antigen) đ-ợc xác định bằng huyết thanh học, sau đó là kỹ thuật tế bào, kỹ thuật tính đa dạng các m.nh do men hạn chế(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP). Ngày nay, kỹ thuật đ-ợc sử dụng nhiều và có độ tin cậy cao là oligonucleotid probe. Phân tử HLA rất đa dạng, các kháng nguyên này gây ra c. miễn...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA

TCNCYH 23 (3) 2003 øng dông kü thuËt PCR-SSP trong ®Þnh nhãm HLA TS. B¹ch Kh¸nh Hoµ Labo trung t©m y sinh häc, §¹i häc Y Hµ Néi Phøc hÖ chñ yÕu hoµ hîp m« ë ng−êi chiÕm mét vïng kho¶ng tõ 4 ®Õn 5 megabaes (Mb) trªn c¸nh ng¾n cña nhiÔm s¾c thÓ sè 6. Trong lÞch sö, kh¸ng nguyªn b¹ch cÇu ng−êi (HLA: Human leucocyt Antigen) ®−îc x¸c ®Þnh b»ng huyÕt thanh häc, sau ®ã lµ kü thuËt tÕ bµo, kü thuËt tÝnh ®a d¹ng c¸c m¶nh do men h¹n chÕ(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP). Ngµy nay, kü thuËt ®−îc sö dông nhiÒu vµ cã ®é tin cËy cao lµ oligonucleotid probe. Ph©n tö HLA rÊt ®a d¹ng, c¸c kh¸ng nguyªn nµy g©y ra c¶ miÔn dÞch thÓ dÞch vµ miÔn dÞch qua trung gian tÕ bµo. Trong bµi nµy chóng t«i tr×nh bµy kü thuËt: Ph¶n øng chuçi polymerase víi nh÷ng måi cã tr×nh tù ®Æc hiÖu (PCR- SSP: Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Primers) ®Ó ®Þnh nhãm HLA nh»m môc ®Ých sö dông trong l©m sµng chän hoµ hîp ng−êi cho vµ ng−êi nhËn t¹ng mµ chóng t«i ®· thùc hiÖn ë ViÖt Nam tõ 2000. 1. Më ®Çu: kh¸ng nguyªn miÔn dÞch b¹ch sinh häc ph©n tö nh»m x¸c ®Þnh tÝnh ®a d¹ng cÇu cña ng−êi (human leucocyte antigen- cña HLA béc lé trªn bÒ mÆt tÕ bµo. HLA) n»m mét phÇn quan träng trong hÖ thèng 2.1.Kü thuËt huyÕt thanh häc: nh÷ng n¨m di truyÒn, ®−îc gäi lµ hÖ thèng chñ yÕu hoµ hîp 1954 lµ nh÷ng n¨m ®Çu t×m hiÓu vÒ hÖ thèng m« (complex major histocompatibilite – HLA, ng−êi ta chØ dïng ph¶n øng ng−ng kÕt CMH), hÖ thèng nµy n»m trªn c¸nh ng¾n cña b¹ch cÇu sau ®ã tiÕn thªm mét b−íc, ®ã lµ kü nhiÔm s¾c thÓ sè 6 (®o¹n 6p21.3). LÇn ®Çu tiªn thuËt vi ®éc tÕ bµo tiªu thô bæ thÓ. Dïng tÕ bµo hÖ thèng nµy ®−îc ph¸t hiÖn bëi J.Dausset, b¹ch cÇu sau khi t¸ch qua Ficoll råi nhá vµo 1958, vµ «ng ®· ®−îc nhËn gi¶i th−ëng Nobel c¸c giÕng ®· cã nh÷ng huyÕt thanh mang kh¸ng vÒ Y häc n¨m 1980 [1]. HLA cã vai trß chñ thÓ ®Æc hiÖu ®−îc biÕt tr−íc, sau ®ã nhá thªm ®¹o trong ®¸p øng miÔn dÞch. TÝnh ®a d¹ng bæ thÓ thá sÏ dÉn ®Õn hiÖn t−îng chÕt tÕ bµo trong cÊu tróc ®· dÉn ®Õn nh÷ng khã kh¨n nÕu cã ph¶n øng kh¸ng nguyªn kh¸ng thÓ vµ trong x¸c ®Þnh kh¸ng nguyªn vµ hiÓu biÕt vÒ x¸c ®Þnh hiÖn t−îng nµy th«ng qua nhuém tÕ chøc n¨ng cña nã øng dông trong l©m sµng. bµo b»ng thuèc nhuém, ®äc kÕt qu¶ d−íi kÝnh Vai trß cña HLA trong sù nhËn biÕt c¸i t«i vµ hiÓn vi ®¶o ng−îc. Cho ®Õn nay kü thuËt nµy kh«ng ph¶i t«i rÊt quan träng trong ghÐp c¬ vÉn ®−îc sö dông ë nhiÒu phßng xÐt nghiÖm. quan, ghÐp tuû, còng nh− ®¸p øng miÔn dÞch ë Trong bµi nµy chóng t«i ®Ò cËp ®Õn nh÷ng møc ®é peptit. Nh− vËy, víi nh÷ng cÊu tróc vµ kü thuËt ®ang ®−îc sö dông nhiÒu nhÊt, ®ã lµ chøc n¨ng kh¸c nhau ph©n tö HLA gióp cho nh÷ng kü thuËt vÒ sinh häc ph©n tö. chóng ta hiÓu ngµy cµng râ h¬n c¬ chÕ ®¸p øng 2.2. Sù ph¸t triÓn ngµy cµng gia t¨ng trong miÔn dÞch. nu«i cÊy dßng tÕ bµo th× sù hiÓu biÕt gen cña 2. Kü thuËt ®Þnh nhãm HLA: tr¶i qua líp I (1980) vµ líp II (1982) còng ngµy cµng nhiÒu giai ®o¹n kÓ tõ khi ph¸t minh ra hÖ thèng s©u s¾c h¬n gióp cho gi¶i thÝch ®−îc ADN bæ HLA cho ®Õn nay cã rÊt nhiÒu kü thuËt ®· ®−îc sung vµ bé gen (genomique) cho phÐp chóng ta ¸p dông trong viÖc x¸c ®Þnh kh¸ng nguyªn cña sö dông sonde thø hai cña HLA.Ng−êi ta cã thÓ hÖ thèng nµy, ng−êi ta t¹m chia nã ra lµm hai sö dông sond nµy trong ph¶n øng lai víi ADN nhãm: kü thuËt huyÕt thanh häc vµ kü thuËt cña bé gen ®Ó nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng cña loci TiÕn sÜ, phã tr−ëng Labo Trung t©m Y sinh häc – tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi. 130
TCNCYH 23 (3) 2003 hay cña allen. Kü thuËt sinh häc ph©n tö ®Çu 2.3. Kü thuËt PCR-SSP: ngµy nay trong tiªn ®−îc ¸p dông trong ®Þnh nhãm HLA dùa nhiÒu phßng thÝ nghiÖm hoµ hîp m« trªn thÕ trªn sù ph©n tÝch sè l−îng vµ kÝch th−íc ®o¹n giíi ng−êi ta sö dông kü thuËt PCR lµ kü thuËt ADN lai víi sond ®Æc hiÖu cña HLA sau khi th−êng quy ®Ó ®Þnh nhãm kh¸ng nguyªn b¹ch nã bÞ c¾t bëi enzym giíi h¹n. Kü thuËt nµy gäi cÇu, 1999 Ph¹m §¨ng Khoa, Vò TriÖu An vµ tªn lµ " tÝnh ®a d¹ng c¸c m¶nh do men h¹n chÕ céng sù cña bé m«n MiÔn dÞch- Sinh lý bÖnh “(RFLP) [2]. §©y lµ kü thuËt ®Þnh nhãm HLA tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi ®· thùc hiÖn kü thuËt ®−îc sö dông chñ yÕu trong workshop-HLA nµy ®Ó ®Þnh nhãm DRB1 [2]. Tõ th¸ng 10- 1997, vµ cho thÊy cã nhiÒu tiÕn bé quan träng, 2000 t¹i phßng thÝ nghiÖm Y Sinh häc cña nhÊt lµ trong x¸c ®Þnh vµ nghiªn cøu tÝnh ®a tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi, chóng t«i còng ®−a d¹ng cña líp II, trong ghÐp c¬ quan vµ tæ chøc. vµo thùc hiÖn kü thuËt PCR-SSP ®Ó ®Þnh nhãm Kü thuËt RFLP còng lÇn ®Çu tiªn cho phÐp x¸c cho HLA- A, B, DR, DQ. Lo¹i kit chóng t«i sö ®Þnh HLA-DP mµ kh«ng cÇn ®Õn kü thuËt tÕ dông lµ “§é ph©n gi¶i thÊp (Low resolution)” bµo vµ gi¶i thÝch nh÷ng hiÖn t−îng kh«ng cña Dynal, nã cho kÕt qu¶ t−¬ng ®−¬ng víi kÕt gièng nhau cña DP trong nu«i cÊy hçn hîp hai qu¶ lµm huyÕt thanh häc. Kü thuËt PCR-SSP quÇn thÓ tÕ bµo (culture mixte) [3]. Nã còng ®−îc sö dông ®Ó chän lùa ng−êi cho vµ ng−êi cßn lµ mét cuéc c¸ch m¹ng vÒ mèi liªn quan nhËn trong ghÐp tuû, ghÐp c¬ quan, t×m mèi gi÷a HLA vµ bÖnh, miÔn dÞch kh¸ng b¹ch cÇu liªn quan gi÷a HLA víi mét sè bÖnh.... §èi víi gi÷a mÑ vµ con... [4] kÝt “§é ph©n gi¶i cao (High resolution)” x¸c Kü thuËt ph¶n øng chuçi khuyÕch ®¹i gen ®Þnh ®−îc allele cã mÆt trªn nhiÔm s¾c thÓ sÏ (polymerase chain reaction - PCR) lµ mét cuéc cho kÕt qu¶ cã ®é ph©n tÝch cao h¬n nh−ng gi¸ c¸ch m¹ng cho mäi nghiªn cøu vÒ gen, gi¶i thµnh ®¾t. V× vËy chóng t«i lùa chän kü thuËt tr×nh tù gen, vµ nhÊt lµ nghiªn cøu vÒ tÝnh ®a PCR-SSP ®é ph©n gi¶i thÊp dùa trªn nh÷ng d¹ng. Kü thuËt nµy cã ®é nh¹y cao, ®Æc hiÖu vµ ®iÓm sau: ®¬n gi¶n trong nh÷ng nghiªn cøu vÒ gen. §iÒu - ChÊt l−îng kü thuËt: kh«ng cho hoÆc rÊt Ýt quan träng trong lµ sù chän lùa ®o¹n måi sao hiÖn t−îng d−¬ng tÝnh gi¶ cho ®¹t ®−îc nh÷ng yªu cÇu vÒ tÝnh ®Æc hiÖu. - Thêi gian thùc hiÖn kü thuËt ng¾n Dùa trªn nh÷ng nguyªn t¾c chÝnh mµ ng−êi ta - Gi¸ thµnh xÐt nghiÖm kh«ng cao t¹m chia nã lµm 3 nhãm ph−¬ng ph¸p nh− sau: - Trang thiÕt bÞ trong phßng thÝ nghiÖm cña Ph¶n øng chuçi polymerase víi nh÷ng chóng t«i ®¶m b¶o thùc hiÖn ®−îc kü thuËt nµy oligosondes ®Æc hiÖu ®¸nh dÊu phãng x¹ hoÆc Kh«ng g©y ®éc nhiÒu cho ng−êi thùc hiÖn enzym cña allele hay tr×nh tù gen (PCR-SSO: do ho¸ chÊt sö dông g©y ra. Polymerase Chain Reaction -Sequence Specific V× vËy, chóng t«i nhËn thÊy kü thuËt nµy Oligoprobes) phï hîp víi t×nh h×nh thùc tÕ ë ViÖt Nam TÝnh ®a d¹ng c¸c m¶nh do men h¹n chÕ Kü thuËt PCR-SSP lµ kü thuËt sö dông (RFLP). nh÷ng måi ®−îc khuyÕch ®¹i tõ phÝa ®Çu tËn Ph¶n øng chuçi polymerase víi nh÷ng måi 3’. Ph¶n øng chØ bao gåm 2 giai ®o¹n chÝnh lµ cã tr×nh tù ®Æc hiÖu (PCR- SSP) PCR vµ ®iÖn di trªn gen agarose ®Ó ®äc kÕt Kü thuËt PCR cho phÐp ®¸nh dÊu sù tiÕn bé qu¶. trong x¸c ®Þnh tÝnh ®a d¹ng cña gen HLA líp II C¸c b−íc tiÕn hµnh nh− sau: vµ nhËn biÕt ®−îc chÝnh x¸c nh÷ng alleles kh¸c . T¸ch ADN tõ m¸u toµn phÇn theo kü thuËt nhau cña DRB1 vµ DPB1. TÝnh ®a d¹ng cña líp perchlorate sodium (kü thuËt S.A. Miller, D.D. I còng gÆp nh÷ng khã kh¨n khi sö dông kü Polesky- 1988). thuËt PCR v× lý do giµu pseudogenes cïng khuyÕch ®¹i trong vïng cña líp I. .Thùc hiÖn ph¶n øng PCR b»ng kit Dynal: trong mçi tube ®· cã s½n måi ®Æc hiÖu vµ nhá 131
TCNCYH 23 (3) 2003 thªm 10 µl bao gåm: 0.1 µl Amplitaq DNA Chóng t«i còng xin tr×nh bµy s¬ l−îc vÒ quy polymerase, 8,9µl ®Öm SSP-PCR Maaster mix, ®Þnh danh ph¸p quèc tÕ: do cã sù tiÕn bé trong 1µl DNA cÇn x¸c ®Þnh, trén kü vµ ch¹y trªn kü thuËt ®Þnh nhãm HLA nªn c¸c quy ®Þnh vÒ m¸y khuyÕch ®¹i gen Gene Amp PCR system danh ph¸p còng th−êng xuyªn ®−îc th«ng qua 9700 víi chu kú: 96oC trong 2 phót, tiÕp ®Õn 10 ë c¸c héi nghÞ quèc tÕ vÒ HLA, nã cho phÐp chu kú: 96oC trong 15 gi©y, 65oC trong 60 gi©y, ph©n biÖt kü thuËt sö dông trong ®Þnh nhãm vµ 20 chu kú: 96oC trong 10 gi©y, 61oC trong HLA lµ huyÕt thanh häc hay sinh häc ph©n tö 50 gi©y, 72oC trong 30 gi©y [4]. B»ng kü thuËt sinh häc ph©n tö ng−êi ta quy ®Þnh c¸ch viÕt nh− sau: . §iÖn di trªn gen agarose 2% trong ®Öm TAE 0.5M, 100vol trong 15phót HLA + locus + * + alen (2 hoÆc 4 con sè). . Chôp ¶nh vµ ph©n tÝch kÕt qu¶ b»ng phÇn mÒm cña Dynal b¸n kÌm theo kit. H×nh 1: KÕt qu¶ s¶n phÈm PCR-SSP sau ®iÖn di trªn gen agarose 2% 2 con sè ®Çu t−¬ng øng víi tÝnh ®Æc hiÖu HLA vµ bÖnh: tuú thuéc vµo líp I hay líp cña kh¸ng nguyªn ®−îc x¸c ®Þnh II mµ ng−êi ta ®· ®−a ra nh÷ng mèi liªn quan (A* 01 lµ kh¸ng nguyªn A1) ®iÒu nµy ®«i gi÷a HLA vµ mét sè bÖnh nh− : viªm cét sèng khi kh«ng ®óng víi mét sè alen vÝ dô trong dÝnh khíp, ®¸i ®−êng kh«ng phô thuéc insulin nhãm alen B*15 th× B*1502 t−¬ng øng víi týp I…vµ dùa vµo mèi liªn quan nµy ng−êi ta kh¸ng nguyªn ®−îc x¸c ®Þnh b»ng huyÕt thanh ®· ®−a ra nh÷ng c¬ chÕ mµ trong ®ã peptid cña häc lµ B75, ng−îc l¹i cã tr−êng hîp cã nh÷ng ph©n tö HLA gi÷ vai trß chñ yÕu. alen ®−îc ph¸t hiÖn b»ng kü thô©t sinh häc §Þnh nhãm HLA trong ghÐp: dùa trªn nhãm ph©n tö mµ kü thuËt huyÕt thanh häc kh«ng HLA ®−îc x¸c ®Þnh gi÷a ng−êi cho vµ ng−êi ph¸t hiÖn ®−îc. nhËn ®Ó quyÕt ®Þnh cã ghÐp thËn cho bÖnh nh©n C¸c ¸p dông chÝnh trong viÖc ®Þnh nhãm hay kh«ng? HLA b»ng kü thuËt PCR-SSP: ®èi víi kü thuËt Tãm l¹i: do chøc n¨ng tr×nh diÖn ®Æc hiÖu PCR-SSP chóng t«i ®· øng dông trong l©m sµng kh¸ng nguyªn peptid, do tÝnh ®a d¹ng cña c¸c víi mét sè tr−êng hîp sau: ph©n tö ®−îc biÓu lé, vai trß ph©n ®Þnh danh 132
TCNCYH 23 (3) 2003 môc cña lymph« T nªn hÖ thèng HLA ®ãng DNA from humain nucleated cells. Nucleic mét vai trß chñ yÕu trong ®¸p øng miÔn dÞch. acids research. 1988, 16: 1215-1218. §iÒu nµy gi¶i thÝch nh÷ng ®ãng gãp cña hÖ 3. Wake CT, Long EO, Mach B: Allelic thèng nµy trong ghÐp , trong mèi liªn quan cña polymorphism and complexity of the genes for nã víi mét sè bÖnh, trong c¶nh gi¸c víi ph¸t HLA-DR β chains – direct analysis by DNA- triÓn u, trong truyÒn m¸u vµ trong nghiªn cøu DNA hybridization. Nature. 1982, 300: 372- quÇn thÓ hay trong ph¸p y. 374. NÕu viÖc m« t¶ tÝnh ®a d¹ng cña ph©n tö vµ 4. Bignon JD, Semana G, Tiercy M et al: gen häc ®· cho nh÷ng thµnh c«ng liªn tôc trong DNA- RFLP analysis: HLA-DR β workshop ghÐp (®Æc biÖt trong ghÐp tuû x−¬ng). Nh÷ng report. In : Dupon B, ed. Immunology of HLA. nghiªn cøu vÒ tr×nh tù kh¸ng nguyªn vµ gen Newyork: Springer-Verlag. 1989, 851-860. cßn gi¶i thÝch ®−îc ngµy cµng râ h¬n sù liªn 5. Williams F et al.: Development of PCR – quan trong tÝnh nh¹y c¶m hay ®Ò kh¸ng cña SSOP for the identification of HLA-A* 02 mét sè bÖnh (®Æc biÖt lµ bÖnh tù miÔn). §iÒu subtypes and determination of HLA- A* 02 nµy ®· gióp c¸c thÇy thuèc l©m sµng trong frequencies within different ethnic populations. miÔn dÞch trÞ liÖu nh»m kh«i phôc l¹i nh÷ng TISSUE Antigens. 1997, 49: 129-133. ho¹t ®éng b×nh th−êng cña hÖ thèng miÔn dÞch. 6. Bodmer JG et al: Nomenclature for Tµi liÖu tham kh¶o factors of the HLA system 1998. Tissue 1. Vò TriÖu An, J.C.Homberg : MiÔn dÞch Antigens. 1999, 53: 407- 446. häc. 1997, 105: 120-123. 2. S.A.Miller, D.D.Dykes and H.F. Polesky: A simple salting out procedure for extracting Summary Genotyping for HLA The major histocompatibility complex in humans (MHC), located on the short arm of chromosome 6, spans a distance of approximately about 4 to 5 megabase (Mb). Historically, HLA antigens have been defined by serologic techniques, and cellular techniques, DNA analyses using restriction fragment length polymorphisme (RFLP) and now is oligonucleotid probe (used in conjunction with the polymerase chain reaction or another process that amplifies the relevant gene copy). HLA molecules contain multiple alloepitopes that are capable of inducing humoral and cellular responses during alloimmunization. This paper, we present the clinical HLA testing: HLA typing (PCR-SSP) to identify HLA specificities to determine compatibility between a specific donnor- recipient pair. 133