Ứng dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng xác định mức độ sao chép của heparansulphat interacting protein ở mô ung thư

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007<br /> <br /> ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PCR BÁN ĐỊNH LƢỢNG<br /> VÀ ĐỊNH LƢỢNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ SAO CHÉP<br /> CỦA HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN Ở MÔ UNG THƢ<br /> Trần Vân Khánh*, Tạ Thành Văn*<br /> Phương pháp PCR bán định lượng và định lượng là những phương pháp đơn giản, chính xác và cho độ<br /> tin cậy tương đối cao được sử dụng rất rộng rãi để xác định mức độ biểu hiện của mỗi gen được khuyếch đại<br /> sau mỗi phản ứng PCR.<br /> Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng để đánh giá mức độ sao chép của<br /> Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở mô ung thư so với mô lành tính; so sánh kết quả của 2 phương<br /> pháp trên.<br /> Phương pháp: Tách triết mRNA tổng số từ mô ung thư và lành tính; tổng hợp cDNA; xác định mức<br /> độ sao chép của HIP sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng.<br /> Kết quả: Cả phương pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau; HIP được tăng cường sao chép rất<br /> rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp trên mẫu lành tính.<br /> Kết luận: Mức độ biểu hiện của HIP ở mô ung thư và mô lành tính khác biệt nhau một cách rõ rệt.<br /> Chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp PCR bán định lượng và định lượng trên để đánh giá mức<br /> độ sao chép của HIP trong chẩn đoán bệnh ung thư.<br /> Từ khóa: HIP/L29; cancer; transcript.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> THE DETERMINATION HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN (HIP) TRANSCRIPT IN<br /> CANCER TISSUES USING SEMIQUANTITATIVE PCR AND QUANTITATIVE PCR METHODS<br /> Tran Van Khanh, Ta Thanh Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 – Supplement of No 3 – 2007: 36 – 40<br /> Semiquantitative PCR and quantitative PCR are accurate and simple methods. They are commonly<br /> used to determine amplified gene levels in PCR reaction.<br /> Objective: Using semiquantitative PCR and quantitative PCR methods to determine HIP transcript<br /> levels in cancer and normal tissue; to evaluate sensibility of tow methods.<br /> Methods: mRNA was extracted from cancer and normal tissues, cDNA synthesis by reverse<br /> transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR); HIP transcript determination using semiquantitative PCR<br /> and quantitative PCR methods.<br /> Results: Both methods showed the same results: HIP transcript was up regulated in cancer tissues.<br /> Conclusion: Levels of HIP transcript was different between cancer tissue and the normal control.<br /> Semiquantitative PCR and quantitative PCR are useful methods to determine HIP transcript for cancer<br /> diagnosis.<br /> Key words: HIP/L29; cancer; transcript<br /> <br /> ĐẶT VẤNĐỀ<br /> Heparin và heparansulfate (HP/HS) là đại<br /> phân tử mang điện âm với độ sulphate hóa rất<br /> <br /> cao, chính vì vậy chúng có khả năng tương tác<br /> với nhiều loại protein trong các quá trình sinh<br /> học khác nhau và đóng vai trò rất quan trọng<br /> trong việc hình thành và duy trì cấu trúc chức<br /> <br /> * Trường Đại học Y Hà Nội<br /> <br /> 36<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007<br /> năng của tế bào(6). Daniel D. Carson và cộng sự<br /> đã phát hiện ra một protein bề mặt tế bào biểu<br /> mô thận người và một số dòng tế bào khác,<br /> protein này được đặt tên là Heparansulphat<br /> Interacting Protein (HIP)(2). Đây là một protein<br /> có chiều dài 155 aa với trọng lượng phân tử<br /> khoảng 18 kDa(3). Khi nghiên cứu sâu hơn về<br /> chức năng sinh học của HIP các tác giả đã phát<br /> hiện ra rằng HIP cũng có chức năng tương tự<br /> như những protein gắn ái lực với HP/HS và<br /> chúng được tổng hợp nhiều ở các dòng tế bào<br /> nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành. Một<br /> số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng<br /> HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế<br /> bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông<br /> tin và protein như: ung thư tuyến giáp trạng<br /> và ung thư vú, ung thư đại tràng... Đặc biệt<br /> mức độ biểu hiện của HIP liên quan chặt chẽ<br /> với quá trình phát triển và xâm lấn của ung<br /> thư và phụ thuộc vào mức độ ác tính của các<br /> dòng ung thư(1,7). Việc nghiên cứu tìm hiểu cơ<br /> chế ung thư ở mức độ phân tử, từ đó tìm ra<br /> phương pháp chẩn đoán hữu hiệu và điều trị<br /> sớm là một lĩnh vực đang được rất nhiều nhà<br /> khoa học quan tâm. Trong một vài nghiên cứu<br /> gần đây, bằng phương pháp RT-PCR chúng<br /> tôi đã phát hiện thấy mRNA của HIP được sao<br /> chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư<br /> vú và ung thư tuyến tiền liệt trong khi đó<br /> không phát hiện được hoặc phát hiện rất thấp<br /> ở mô u xơ(4,5). Trong nghiên cứu này, chúng tôi<br /> đã sử dụng phương pháp RT-PCR bán định<br /> lượng và định lượng để xác định mức độ sao<br /> chép của HIP ở mô ung thư, từ đó so sánh kết<br /> quả, đánh giá độ tin cậy của 2 phương pháp<br /> trên để ứng dụng chúng xác định mức độ sao<br /> chép của HIP và các gen khác trong chẩn đoán<br /> bệnh ung thư.<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Đối tƣợng<br /> 30 bệnh nhân ung thư được chẩn đoán xác<br /> định dựa trên lâm sàng, cận lâm sàng (siêu<br /> âm, hoá sinh, mô bệnh học) tại Bệnh viện K<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hà nội. Chúng tôi sử dụng 15 mẫu mô lành<br /> tính để làm đối chứng.<br /> <br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> Tách chiết mRNA và tổng hợp cDNA<br /> RNA tổng số được tách chiết từ mô ung<br /> thư theo quy trình chuẩn đã được mô tả trước<br /> đây(5). 5µg RNA tổng số được sử dụng để tổng<br /> hợp chuỗi cDNA bổ xung bằng phản ứng<br /> reverse transcript-polymerase chain reaction<br /> RT- PCR.<br /> Phương pháp PCR bán định lượng<br /> Cặp mồi đặc hiệu với HIP có trình tự như<br /> sau: HIP-F: 5’-GCT TAT GGT GCA GAC ATG<br /> G -3’; HIP-R: 5’-CAG AGA TAT CTA CTC<br /> TGA AGC-3’. PCR được tiến hành với tổng<br /> thể tích 20µl gồm: 4 µl cDNA, 2 µl 10x Ex Taq<br /> Buffer, 2 µl 2.5mM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi<br /> và ngược, 1 unit Ex Taq Polymerase (Takara<br /> Bio Inc.Kyoto, Japan). Chu trình nhiệt của<br /> phản ứng PCR như sau: Biến tính 940C - 5<br /> phút, 35 chu kỳ 940C - 50 giây, 580C - 50 giây,<br /> 720C - 50 giây , 720C - 5 phút. Sử dụng gen nội<br /> chuẩn GAPDH để đánh giá chất lượng RNA<br /> và so sánh lượng mẫu sử dụng trong phản<br /> ứng RT-PCR. Đậm độ mỗi vạch HIP và<br /> GAPDH được xác định nhờ phần mềm chuyên<br /> dụng. Mức độ sao chép của HIP được tính bằng tỉ<br /> lệ HIP/GAPDH rồi vẽ đồ thị.<br /> Phương pháp PCR định lượng<br /> (Agilent 2100 Bioanalyzer with DNA 1000<br /> Lab Chips; Agilent Technologies, Palo Alto,<br /> CA): Phương pháp PCR định lượng được ứng<br /> dụng để đánh giá độ tin cậy của phương pháp<br /> trên. Quy trình PCR được tiến hành tương tự<br /> như phương pháp PCR bán định lượng. Vì<br /> phương pháp này rất nhạy và có thể đánh giá<br /> được mức độ sao chép của HIP cho dù ở mức<br /> độ rất thấp nên chu kỳ của phản ứng được<br /> giảm từ 35 xuống 24 chu kỳ. Sản phẩm PCR<br /> sau đó được điện di trên hệ thống capillary<br /> (Capillary electrophoresis) và mức độ sao<br /> chép của HIP được xác định thông qua hệ<br /> thống máy tính. Kết quả PCR định lượng được<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh – Tế Bào Bệnh Học<br /> <br /> 37<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> biểu thị trên đồ thị tương ứng với các đỉnh.<br /> GAPDH cũng được sử dụng để so sánh lượng<br /> mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng.<br /> <br /> và mẫu lành tính. Sau khi được điện di trên<br /> agarose 2%, sản phẩm PCR nhận được có kích<br /> thước phân tử 444 bp (hình 1a). Quan sát<br /> chúng ta thấy đậm độ vạch PCR ở những mẫu<br /> ung thư rõ hơn so với những mẫu lành tính,<br /> kết quả gợi ý rằng HIP tăng cường sao chép ở<br /> những mô ung thư trong khi đó sao chép rất thấp<br /> ở những mô lành tính.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊNCỨU<br /> Để xác định mức độ sao chép của HIP, sử<br /> dụng cặp mồi đặc hiệu với HIP chúng tôi tiến<br /> hành phản ứng RT-PCR bán định lượng trên<br /> những mẫu RNA tổng số tách từ mẫu ung thư<br /> <br /> a.<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> HIP<br /> <br /> GAPDH<br /> <br /> b.<br /> 200<br /> 180<br /> 160<br /> 140<br /> 120<br /> 100<br /> 80<br /> 60<br /> 40<br /> 20<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> 2<br /> <br /> 3<br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> 6<br /> <br /> 7<br /> 7<br /> <br /> Hình 1: Kết quả của phản ứng RT-PCR của HIP và GAPDH ở mô ung thư và mô lành tính (a). Sản phẩm<br /> được khuyếch đại từ cDNA của mô ung thư (1-5) và mô lành tính (6-7). Kết quả định lượng của<br /> HIP/GAPDH tương ứng với hình a đã được tính và vẽ đồ thị (b).<br /> Nhận xét: Sản phẩm PCR đặc hiệu của gen<br /> <br /> mRNA tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng,<br /> <br /> GAPDH trên những mẫu ung thư và những<br /> <br /> đồng thời không có sự khác biệt về lượng mẫu<br /> <br /> mẫu lành tính tương ứng có kích thước 350 bp<br /> <br /> đã sử dụng trong mỗi phản ứng PCR. Kết quả vẽ<br /> <br /> (hình 1a). GAPDH là một gen thể hiện trên<br /> <br /> đồ thị của tỉ lệ HIP/GAPDH ở hình 1b cho thấy<br /> <br /> mọi tế bào, không phụ thuộc vào thể loại,<br /> <br /> HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những<br /> <br /> trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên được<br /> <br /> mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp<br /> <br /> dùng như một gen nội chuẩn. Kết quả của<br /> <br /> trên những mẫu lành tính. Điều này khẳng định<br /> <br /> phản ứng khuếch đại GAPDH chỉ ra rằng cả 7<br /> <br /> rõ sự khác biệt về mức độ biểu hiện của HIP ở<br /> <br /> bệnh nhân nghiên cứu đều có chất lượng<br /> <br /> mô ung thư so với mô lành tính.<br /> <br /> 38<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007<br /> <br /> M<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> G<br /> <br /> H<br /> M<br /> M<br /> <br /> 1<br /> M<br /> <br /> M<br /> <br /> H<br /> <br /> M<br /> G<br /> <br /> M<br /> <br /> M<br /> <br /> 2<br /> M<br /> <br /> M<br /> <br /> 3**<br /> <br /> G<br /> <br /> M<br /> <br /> i<br /> <br /> 3<br /> ***<br /> <br /> ***<br /> <br /> G<br /> <br /> ***<br /> <br /> 4<br /> ***<br /> <br /> ***<br /> <br /> M<br /> M<br /> <br /> M<br /> <br /> G<br /> M<br /> <br /> ***<br /> <br /> 5<br /> ***<br /> <br /> G<br /> <br /> 6<br /> <br /> ***<br /> <br /> ***<br /> <br /> M<br /> <br /> ***<br /> <br /> M<br /> <br /> G<br /> <br /> 7<br /> <br /> ***<br /> <br /> ***<br /> <br /> M<br /> <br /> HIP<br /> <br /> M<br /> <br /> GAPDH<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh của phản ứng RT-PCR định lượng. Kết quả PCR định lượng của HIP tương ứng với đỉnh<br /> H ở mô ung thư và mô lành tính (bên trái). Kết quả PCR của gen GAPDH tương ứng với đỉnh G (bên<br /> phải). Đỉnh M tương ứng với marker 15 và 1500 bp. Sản phẩm được khuyếch đại từ cDNA của mô ung thư<br /> (1-5) và mô lành tính (6-7)<br /> phản ứng. Kết quả này một lần nữa khẳng<br /> Nhận xét: Kết quả PCR định lượng đánh<br /> định HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở<br /> giá mức độ sao chép của HIP sử dụng hệ<br /> những mô ung thư.<br /> thống điện di cappilary (hình 2) chỉ rõ: đỉnh H<br /> (bên trái) tương ứng với mức độ mức độ biểu<br /> hiện của HIP ở những mẫu ung thư (1-5) cao<br /> hơn rõ ràng so với những mẫu lành tính (6-7)<br /> trong khi đó đỉnh G (bên phải) tương ứng với<br /> mức độ biểu hiện của gen GAPDH không thấy<br /> có sự khác biệt, điều này chứng tỏ không có sự<br /> khác biệt về lượng mẫu sử dụng trong mỗi<br /> <br /> BÀNLUẬN<br /> Việc nghiên cứu tìm hiểu những gen tăng<br /> cường tổng hợp ở mô ung thư sẽ giúp hiểu rõ<br /> hơn về cơ chế phân tử của bệnh, từ đó cho<br /> phép chúng ta tìm ra những marker có giá trị<br /> để chẩn đoán xác định và mức độ tiến triển<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh – Tế Bào Bệnh Học<br /> <br /> 39<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007<br /> <br /> của mô ung thư. HIP là một protein bề mặt tế<br /> bào được phát hiện lần đầu tiên ở dòng tế bào<br /> biểu mô thận người và được tổng hợp rất<br /> nhiều ở các dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu<br /> mô trưởng thành. HIP gắn trực tiếp vào<br /> Heparin, một loại protein có khả năng tương<br /> tác với nhiều loại protein khác nhau vì vậy<br /> HIP tham gia vào quá trình liên kết tế bào – tế<br /> bào, tế bào – khoảng gian bào. Rohde và cộng<br /> sự đã chứng minh rằng HIP giúp cho những tế<br /> bào trophoblast gắn vào biểu mô thận và tăng<br /> cường quá trình xâm lấn tế bào. Một vài<br /> nghiên cứu trong và ngoài nước gần đây đã<br /> chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng<br /> hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức<br /> độ RNA thông tin và protein(1,4,5,7). Sự tăng<br /> cường tổng hợp của HIP ở những mô ung thư<br /> sẽ thúc đẩy sự tương tác tế bào-tế bào, tế bàongoại bào đồng thời nó có thể đóng vai trò<br /> quan trọng cho sự phát triển, khư trú và xâm<br /> lấn của khối u.<br /> Trong nghiên cứu này chúng tôi đã dùng<br /> phương pháp RT-PCR bán định lượng và định<br /> lượng để xác định mức độ biểu hiện của gen<br /> HIP ở mô ung thư so sánh với mô lành tính.<br /> Đây là những kỹ thuật đơn giản, chính xác và<br /> cho độ tin cậy tương đối cao. Cả 2 phương<br /> pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau:<br /> HIP được tăng cường tổng hợp rất rõ ở những<br /> mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất<br /> thấp ở mô lành tính. Điều này giúp cho chúng<br /> tôi có những định hướng tiếp theo và có thể<br /> ứng dụng những phương pháp này như một<br /> công cụ hữu ích không chỉ trong việc đánh giá<br /> mức độ biểu hiện của HIP ở những mô ung<br /> thư mà trong cả việc nghiên cứu tìm hiểu<br /> đánh giá mức độ biểu hiên của những marker<br /> khác trong chẩn đoán bệnh ung thư.<br /> Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp<br /> với các nghiên cứu của các tác giả nước ngoài<br /> cho thấy mức độ sao chép mRNA của HIP<br /> được tăng cường ở dòng tế bào và mô ung thư<br /> <br /> 40<br /> <br /> trong khi đó không biểu hiện hoặc biểu hiện<br /> rất thấp ở mô lành tính. Sự tăng cường tổng<br /> hợp của HIP ở những mô ung thư cho phép<br /> chúng ta kết luận rằng, HIP có mối liên hệ<br /> chặt chẽ với sự phát triển mô ung thư và có<br /> thể dùng HIP như một marker có giá trị góp<br /> phần chẩn đoán bệnh ung thư.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Từ những kết quả nghiên cứu trên cho<br /> phép chúng tôi rút ra một số kết luận sau:<br /> - Mức độ biểu hiện của HIP giữa mô ung<br /> thư và mô lành tính khác biệt nhau một cách<br /> rõ rệt.<br /> - Cả 2 phương pháp PCR bán định lượng<br /> và định lượng đều cho kết quả tương tự nhau<br /> với độ tin cậy cao. Chúng ta có thể dùng một<br /> trong hai phương pháp này để đánh giá mức<br /> độ sao chép của HIP và một số marker khác<br /> trong chẩn đoán xác định bệnh ung thư.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO.<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> 7.<br /> <br /> De Nigris, F., Visconti, R.,Fusco, A., et al. (1998).<br /> Overexpression of the HIP gene coding for a heparin/<br /> heparin sulfate – binding protein in human thyroid<br /> carcinomas. Cancer Res. 58, 4745-4751.<br /> Jacobs, A.L., Julian, J.A., Sahin, A.A., and Carson, D.D.<br /> (1997). Heparin/Heparansulfate interacting protein<br /> expression and functions in human breast cancer cells and<br /> normal breast epithelia. Cancer Research 57, 5148-5154.<br /> Liu. S., Smith, E. Sott, Julian, J., Rohde, H.L, Karin, J.<br /> Norman., and Carson, D.D. (1996). cDNA Cloning and<br /> expression of HIP, a novel cell surface heparan<br /> sulfate/heparin-binding protein of human uterine<br /> Epithelial cells and cell lines. Journal of biological<br /> chemistry.271, 11817-11823.<br /> Nguyễn Thị Phương Ngọc, Trần Vân Khánh, Đào Kim<br /> Chi, Phạm Thị Lý và Tạ Thành Văn (2006). Tăng cường<br /> tổng hợp heparan sulfate interacting protein ở mô ung<br /> thư tuyến tiền liệt. Tạp chí dược học. 367, 132-135.<br /> Phan Tôn Hoàng và Tạ Thành Văn (2005). Sự sao chép<br /> Heparin/Heparan Sulfate Interacting Protein (HIP) ở mô<br /> ung thư vú. Tạp chí nghiên cứu Y học. 38, 5-10.<br /> Tạ Thành Văn (1989). Heparin: Sự tương tác với protein<br /> Tạp chí nghiên cứu Y học 6, 69-72.<br /> Wang, Y., Cheong, D., Chan, S., Chuan Hooi, S. (1997).<br /> heparin/heparan sulfate interacting protein gene<br /> expression is up – regulated in human colorectal<br /> carcinoma and correlated with differentiation status and<br /> metastasis. Cancer Res. 59, 2989-2994.<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học<br /> <br />