zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Y Tế - Sức Khoẻ

» Y khoa - Dược

Ứng dụng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt (droplet digital PCR) trong phân tích đột biến gen phục vụ điều trị đích ung thư

Chia sẻ: ViAnkanra2711 ViAnkanra2711 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Báo xấu

51
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày việc xây dựng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp với tạo vi giọt (digital droplet PCR, ddPCR) nhằm phân tích các đột biến liên quan đến điều trị đích UT phổi trên gen EGFR từ các mẫu sinh thiết lỏng (ctDNA). Phương pháp ddPCR được xây dựng có ngưỡng phát hiện đột biến ở tần suất 0.5-1% (nghĩa là 5-10 phân tử DNA ung thư trong 10.000 phân tử DNA bình thường).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt (droplet digital PCR) trong phân tích đột biến gen phục vụ điều trị đích ung thư

GIẢI PHẪU BỆNH ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR KỸ THUẬT SỐ KẾT HỢP TẠO VI GIỌT (DROPLET DIGITAL PCR) TRONG PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ TRẦN LÊ SƠN1,2, PHẠM THỊ HỒNG ANH1, TRẦN THANH TRƯỜNG1, TRẦN VŨ UYÊN1, ĐẶNG MAI ANH TUẤN3, ĐINH NGUYỄN THIÊN KIM4, PHAN VĂN HIẾU3, GIANG HOA1,2, NGUYỄN HOÀI NGHĨA5 TÓM TẮT Thuốc điều trị ung thư (UT) thuộc nhóm ức chế hoạt tính của enzyme tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor, TKI) được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) phê duyệt cho điều trị UT phổi không tế bào nhỏ. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy các bệnh nhân UT mang những kiểu đột biến đặc trưng cho đáp ứng khác nhau với các thế hệ thuốc TKI khác nhau và sau một thời gian điều trị biểu hiện các đột biến kháng thuốc mới. Do đó, việc xác định các kiểu đột biến đặc trưng này rất quan trọng cho dự đoán và đề ra liệu pháp điều trị trúng đích hiệu quả, đồng thời theo dõi đáp ứng của bệnh nhân trong quá trình điều trị lâm sàng. Sinh thiết mô u hiện vẫn là phương pháp chuẩn vàng cho xác định các đột biến gen. Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất của phương pháp xâm lấn này là khó tiến hành lấy mẫu nhiều lần và trong nhiều trường hợp không thể thu nhận đủ mô u cho phân tích di truyền. Gần đây phương pháp sinh thiết lỏng dựa trên việc phát hiện các DNA ngoại bào được phóng thích từ tế bào ung thư (circulating tumor DNA, ctDNA) cho phép phân tích di truyền của khối u. Tuy nhiên do tỉ lệ DNA phóng thích bởi các tế bào UT so với DNA của các loại tế bào khác thường rất thấp nên cần một phương pháp có độ nhạy cao để có thể phát hiện các đột biến với tần suất thấp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp với tạo vi giọt (digital droplet PCR, ddPCR) nhằm phân tích các đột biến liên quan đến điều trị đích UT phổi trên gen EGFR từ các mẫu sinh thiết lỏng (ctDNA). Phương pháp ddPCR được xây dựng có ngưỡng phát hiện đột biến ở tần suất 0.5-1% (nghĩa là 5-10 phân tử DNA ung thư trong 10.000 phân tử DNA bình thường). Qui trình ddPCR này được sử dụng để phát hiện đột biến trên các mẫu sinh thiết lỏng và mô u của 43 bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ. Phương pháp ddPCR cho kết quả tương đồng cao (87.5%) khi so sánh kết quả phân tích đột biến từ các mẫu sinh thiết lỏng và mô u tương ứng của cùng bệnh nhân. Như vậy, ddPCR là phương pháp có độ nhạy cao, đơn giản và dễ dàng triển khai hỗ trợ quá trình điều trị UT lâm sàng. ABSTRACT Detection of clinically actionable mutations in cancer liquid biopsies using droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are a series of pharmaceutical drugs approved by the Food and Drug Administration (FDA) for treatment of many types of cancers including non-squamous cell lung cancer. Clinical studies showed that patients with somatic mutations in certain cancer driver genes exhibit strong correlation with therapeutic efficacy to different types of TKIs and tend to acquire new mutations rendering resistance to previous TKI therapies. Hence, the identification of such mutations is critically important for effective genotype- directed therapies and assessment of patients’ responses in clinical practice. Tumor biopsy remains the gold standard for assessing genetic mutations in both lung and colorectal cancer. However, it is not always feasible to obtain sufficient tumor tissue or perform repeat biopsy in these patients. Recently, “liquid biopsy” which involves isolating cell free DNA released by cancer cells into the bloodstream (circulating tumor DNA, ctDNA) represents a noninvasive and potential technique for tumor genetic analysis. Due to the relatively low 1 Công ty giải pháp gene 2 Viện di truyền Y học 3 Trung tâm Pháp Y TP.HCM 4 Bệnh viện Đa khoa Tân Hưng 5 Đại học Y dược TP.HCM TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 229
GIẢI PHẪU BỆNH abundance of ctDNA in the peripheral circulation, a highly sensitive genotyping assay is required to detect such low frequency mutations. In this study, we developed a novel digital droplet PCR (ddPCR) assays to identify clinically actionable mutations of a cancer driver gene, EGFR. The limit of detection of our assays was 0.5-1% (5-10 target mutation DNA molecules in 10.000 wild type DNA molecules). These assays were further applied to evaluate the sensitivity and specificity for detection of mutations in both plasma and matched formalin- fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples of 43 non-small cell lung cancer patients. Our results suggested that ddPCR based mutation detection assays are highly accurate and accessible platforms for directing and assisting targeted cancer therapy in clinical practice. ĐẶT VẤN ĐỀ hay đột biến mất đoạn vùng exon19 (del19) trên gen mã hóa thụ thể tyrosine kinase EGFR cho đáp ứng Tyrosine kinase là nhóm enzyme đóng vai trò tốt với nhóm TKI thế hệ I như Iressa (Gefitinib) và quan trọng trong các con đường tín hiệu kiểm soát Tarceva (Erlotinib)[3]. Tuy nhiên, sau một thời gian chu trình phân bào và được chứng minh liên quan điều trị (khoảng 1-2 năm), hầu hết các bệnh nhân đến nhiều dạng ung thư[1]. Hiện nay, một nhóm gồm này biểu hiện một đột biến kháng thuốc T790M cũng 37 chất ức chế hoạt tính của các enzyme này trên gen EGFR[4]. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy các (Tyrosine kinase inhibitor, TKI) được FDA chấp trường hợp NSCLC mang đột biến T790M lại cho thuận cho sử dụng cho điều trị UT lâm sàng[2]. Tuy đáp ứng tốt với TKI thế hệ thứ ba như AZD9291 nhiên, hiệu quả điều trị của nhóm thuốc này được (Osimertinib)[5]. Như vậy, việc xác định các đột biến quyết định bởi kiểu đột biến đặc trưng mà bệnh nhân của UT có ý nghĩa quan trọng giúp dự đoán đáp ứng biểu hiện (Bảng 1). Chẳng hạn, nghiên cứu lâm sàng với thuốc và đề ra phác đồ điều trị trúng đích thích cho thấy bệnh nhân ung thư (UT) phổi không tế bào hợp cho bệnh nhân. nhỏ (Non-small-cell lung carcinoma, NSCLC) mang các đột biến thay thế amino acid thứ 858 (L858R) Bảng 1. Các kiểu đột biến khảo sát và tính đáp ứng với thuốc kháng UT Tính đáp ứng với thuốc Kí hiệu Kiểu đột biến TKI Thế Hệ I TKI Thế Hệ II TKI Thế Hệ III (erlotinib, gefitinib) (afatinib, dacomitinib, neratinib) (Osimertinib) Mất đoạn Nucleotide + del19 thuộc vùng exon 19, gen EGFR Thay thế amino acid + + + L858R tại codon 858, exon 21, gen EGFR Thay thế amino acid - + T790M tại codon 790, exon 20, gen EGFR (+): tăng đáp ứng với thuốc (-): giảm đáp ứng với thuốc Hiện nay sinh thiết mô u vẫn được xem là có thể hỗ trợ phân tích di truyền khối u[7]. Tuy nhiên, chuẩn vàng cho đánh giá di truyền nhưng phương để có thể phát hiện các đột biến trên ctDNA cần một pháp này mang tính xâm lấn và khó thực hiện thu phương pháp có độ nhạy cao vì hàm lượng ctDNA mẫu nhiều lần để theo dõi quá trình điều trị[6]. Ngoài trong máu của bệnh nhân và tần suất của các đột ra, kết quả phân tích di truyền tại một vị trí sinh thiết biến thường rất thấp[8]. mô u xác định không phản ảnh được tính phức tạp Nhiều phương pháp đã được phát triển để phát và đa dạng của khối u, đặc biệt ở các trường hợp u hiện các đột biến trên ctDNA như phương pháp di căn[6]. khuyếch đại chịu nhiệt (amplification refractory Gần đây, phương pháp sinh thiết lỏng thu nhận mutation system, ARMS), giải trình tự thế hệ kế tiếp các đoạn DNA do các tế bào UT phóng thích vào (next-generation sequencing, NGS) và PCR kỹ thuật máu (ctDNA) trong quá trình chết theo chương trình số (digital PCR). Nhiều công bố gần đây cho thấy 2 của tế bào (apoptosis) hoặc hoại tử (necrosis) là phương pháp ARMS và NGS chưa đạt độ nhạy tốt phương pháp không xâm lấn và được chứng minh trong việc phát hiện các đột biến có tần suất thấp [5,9]. 230 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM
GIẢI PHẪU BỆNH Phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) theo (droplet digital PCR, ddPCR) được phát triển và hướng dẫn của nhà sản xuất. thương mại hoá từ năm 2011[8]. Phương pháp này Phương pháp phân mảnh tạo DNA chứng dương cho phép phân tách các phân tử DNA bản mẫu vào hàng chục nghìn giọt dầu và phản ứng PCR sẽ diễn Mẫu DNA chuẩn mang các đột biến khảo sát ra độc lập trong từng giọt riêng lẻ này. Kết quả được với tần suất đột biến (MAF) xác định được cung cấp xác định dựa trên tín hiệu phát huỳnh quang của bởi Horizon Discovery (Bảng 2). Các mẫu chuẩn mẫu dò (probe) sau khi phản ứng PCR kết thúc [10]. mang đột biến này và mẫu không mang đột biến Nguyên lý này cho phép ddPCR định lượng tuyệt đối (WT) được phân mảnh ngẫu nhiên bằng bộ kit và chính xác đột biến có tần suất 1% [10]. tự cfDNA (~160bp). DNA sau phân mảnh có kích Ngoài ra, so với phương pháp giải trình tự thế hệ kế thước từ 100bp- 450bp được chọn lọc bằng hạt từ tiếp, ddPCR có thể phát hiện đột biến xác định với Kapa Pure Beads (Roche). Sau đó, DNA chuẩn và độ nhạy tốt hơn và có giá thành thấp hơn[10]. DNA WT được định lượng bằng QuantiFluor® dsDNA System (Promega) và trộn với nhau để tạo Trong nghiên cứu này chúng tôi xây dựng bộ các mẫu DNA chứng dương có tần suất biến xác phản ứng ddPCR để phát hiện các đột biến trên gen định. Tổng lượng DNA đầu vào cũng được sử dụng EGFR xuất hiện phổ biến nhất ở các trường hợp UT tương tự như hàm lượng trung bình của DNA ngoại phổi và có liên quan tính đáp ứng của dạng UT này bào tách chiết từ các bệnh nhân ung thư: 1.6ng. với nhóm thuốc điều trị UT được FDA công nhận. Phương pháp của chúng tôi đạt độ phát hiện các đột Bảng 2. Mẫu chuẩn mang đột biến biến ở tần suất tối thiểu là 0.5-0.1% (nghĩa là 5-10 phân tử DNA ung thư trong 1,000 phân tử DNA bình Genomic DNA chuẩn Tần thường). Đồng thời, hiệu quả phát hiện đột biến của Gene Đột biến suất đột (Horizon Discovery) biến (%) phương pháp này khi ưng dụng trên mẫu sinh thiết lỏng và sinh thiết mô u đạt độ tương đồng khá cao là Structural Control EGFR Del19: ΔE746 5.3 87.5%. - A750 Tru- Q1 EGFR T790M 4.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tru- Q2 EGFR L858R 4.2 Vật liệu Máu và sinh thiết mô u tương ứng của 43 bệnh nhân UT phổi tế bào không nhỏ (kí hiệu là LBL001- Phương pháp droplet digital PCR (ddPCR) LBL043) được thu nhận tại các bệnh viện Phạm Phương pháp ddPCR được thực hiện theo Ngọc Thạch, Đại Học Y Dược và Thủ Đức. Các hướng dẫn của hãng Bio-rad gồm 4 giai đoạn bệnh nhân này đều chưa qua điều trị và đồng ý tham chính[11]: gia nghiên cứu. Mẫu sinh thiết mô u sau khi cố định trong formalin và đúc trong nến paraffin (formalin- Chuẩn bị mẫu: mỗi phản ứng PCR có tổng thể fixed paraffin-embedded, FFPE) được xác định đặc tích là 20l gồm các thành phần chính sau: DNA bản điểm mô bệnh học và giai đoạn của UT. Trong một mẫu được định lượng bằng phương pháp bằng số trường hợp mẫu sinh thiết quả nhỏ không thể tiến Quantus (Promega), 900nM mồi và 250nM mẫu dò, hành tách DNA và phân tích di truyền. 2X supermix (Bio-rad). Đối với DNA tách chiết từ mẫu FFPE, phản ứng PCR được bổ sung enzym cắt Máu ngoại biên (10ml) sẽ được thu nhận trong (2 units) giới hạn HindIII và UDG (Uracil DNA ống EDTA Vacutainer (Becton Dickinson) và giữ mát glycosylase) (2 units), ủ ở 370C trong 20 phút. Mồi tại 4°C không quá 6 giờ trước khi tiến hành tách và mẫu dò cho phản ứng phát hiện đột biến EGFR chiết DNA ngoại bào (cell free DNA, cfDNA). del19 được cung cấp bởi hãng Bio-rad. Với đột biến Phương pháp tách chiết DNA EGFR T790M và L858R, mồi và mẫu do được chúng tôi thiết kế. Từ mẫu máu: máu được ly tâm li tâm 2 đợt: 2.000 g trong 10 phút và 16.000 g, 10 phút để tách Tạo vi giọt: 20.000 vi giọt được tạo bởi hệ thống huyết tương. Bộ kit MagMAX™ Cell-Free DNA QX200 droplet genenator (Bio-rad) Isolation Kit (Thermo Fisher) được sử dụng để tách Phản ứng PCR: Vi giọt được chuyển lên đĩa 96 cfDNA từ các mẫu huyết tương. giếng. Phản ứng PCR được tiến hành với chu trình Từ mẫu mô u FFPE: DNA bộ gen được tách nhiệt: 95°C trong 10 phút, 94°C trong 30 giây và chiết từ các mẫu mô u đã cố định sử dụng bộ kit TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 231
GIẢI PHẪU BỆNH 55°C trong 60 giây và lặp lại 40 chu kỳ, 98°C trong (Hình 1) cho thấy sau khi xử lý phân mảnh, mẫu 10 phút. không mang đột biến (WT) và mẫu chuẩn mang đột biến (MT) xuất hiện vệt “smear” là những đoạn DNA Đọc và phân tích kết quả: Sau khi PCR, kết quả bị đứt gãy, trong đó có những đoạn có kích thước nhân bản trong vi giọt được đọc bởi hệ thống QX200 khoảng 160 bp, tương tự như cfDNA. Droplet reader (Bio-Rad) có thể đọc đồng thời 2 màu huỳnh quang khác nhau (FAM và VIC hoặc HEX). Sau khi thu hồi các đoạn có kích thước tương Dữ liệu ddPCR được phân tích bằng phần mềm tự ctDNA, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu MT với phân tích QuantaSoft (Bio-Rad). mẫu WT để thu được các mẫu có phổ tần suất đột biến khác nhau. Các mẫu này được chạy cùng với 2 KẾT QUẢ mẫu chứng âm là mẫu chỉ có DNA WT (WT) và mẫu Kết quả xác định ngưỡng phát hiện đột biến không có DNA bản mẫu (No template control, NTC). (Limit of Detection, LOD) Chứng âm được sử dụng để kiểm soát khả năng ngoại nhiễm và tính đặc hiệu của mồi và mẫu dò của Các vị trí đột biến được lựa chọn trong nghiên phản ứng ddPCR. Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh cứu này là những đột biến xuất hiện phổ biến trên quang của hơn 10.000 vi giọt trong các mẫu chứng gen gây UT EGFR và có liên quan đến tính đáp ứng âm (WT và NTC) (Hình 2) đều không thấy xuất hiện thuốc của tế bào UT. Để phát hiện các đột biến này, vi giọt có tín hiệu huỳnh quang của mẫu dò đặc hiệu chúng tôi thiết kế 2 phản ứng multiplex PCR: (1) 1 cho các trình tự đột biến. Ngược lại, tín hiệu huỳnh phản ứng duplex với 2 mẫu dò huỳnh quang khác quang của mẫu dò đột biến xuất hiện ở các mẫu nhau đặc hiệu cho 2 vị trí đột biến thay thế amino chuẩn mang đột biến khảo sát và có số lượng vi giọt acid là T790M (FAM) và L858R (HEX); (2) 1 phản dương tính giảm dần khi tần suất đột biến giảm. Kết ứng duplex (Bio-rad) với mẫu dò huỳnh quang quả này chứng tỏ mồi và mẫu dò sử dụng trong các (FAM) phát hiện 15 kiểu đột biến mất đoạn trên vùng phản ứng ddPCR đặc hiệu cho các vị trí đột biến exon 19 (del19) và mẫu dò huỳnh quang (HEX) đặc khảo sát. Ở vị trí đột biến T790M, tần suất tối thiểu hiệu cho trình tự không mang đột biến (WT). mà ddPCR vẫn phát hiện được vi giọt dương tính là WT L L MT 1% (Hình 2a). Trong khi, phản ứng ddPCR phát hiện các vị trí đột biến còn lại gồm L858R (Hình 2b) và Del19 (Hình 2c) đạt tần suất tối thiểu là 0.5%. Như vậy, phản ứng ddPCR trong nghiên cứu này đạt LOD là 0.5-1%, nghĩa là có thể phát hiện được 5-10 500 bản sao DNA mang các đột biến này trong tổng số 300 1000 bản sao DNA phân tích. 200 a b EGFR T790M EGFR L858R 75 500 4% 1% 0.5% WT NTC 4% 1% 0.5% WT NTC EGFR T790M Amplitude EGFR L858R Amplitude 300 200 75 Event number Event number c EGFR Del19 Hình 1. Kết quả xử lý phân mảnh mẫu DNA 1% 0.5% 0.1% WT NTC EGFR Del19 Amplitude không mang đột biến (WT) và mẫu chuẩn DNA mang đột biến (MT). L: thang DNA Trước tiên, chúng tôi tiến hành xác định Event number ngưỡng phát hiện đột biến (LOD) của từng phản ứng PCR này. LOD là giá trị tần suất đột biến thấp Hình 2. Kết quả xác định LOD của phản ứng ddPCR nhất mà phương pháp ddPCR cho phép phân biệt đặc hiệu cho các vị trí đột biến trên gen EGFR mẫu mang đột biến (Mutant, MT) với mẫu không Sau khi xử lý phân mảnh, mẫu DNA chuẩn mang đột biến (wild type, WT). Thông số này cũng mang các đột biến khảo sát gồm T790M (a), L858R cho phép đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi (b) và del19 (c) trên gen EGFR được pha loãng với (primers), mẫu dò (probe) của từng phản ứng mẫu DNA không mang đột biến (WT) để đạt phổ tần ddPCR. LOD được xác định dựa trên các mẫu suất đột biến là 4%, 1%, 0,5% và 0,1%. 1,6ng DNA chuẩn thương mại (Horizon) mang các đột biến khảo của mỗi mẫu chuẩn này được sử dụng để xác định sát có tần suất xác định (Bảng 2). Các mẫu chuẩn LOD. Mẫu chỉ DNA WT và mẫu không có DNA bản này được tiến hành phân mảnh để tạo những đoạn mẫu (NTC) được sử dụng làm chứng âm. Điểm bắt DNA có kích thước tương tự ctDNA. Kết quả điện di 232 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM
GIẢI PHẪU BỆNH đầu phát hiện tín hiệu huỳnh quang của mẫu dò đột Mẫu được kết luận là dương tính với đột biến khảo biến (Threshold, đường màu hồng) được xác định sát khi ddPCR xuất hiện vi giọt có tín hiệu huỳnh bởi phần mềm QuantaSoft (Bio-Rad). LOD là tần quang của mẫu dò đột biến và có tần suất đột biến suất đột biến thấp nhất mà phản ứng ddPCR có thể (MAF, mutation allelic frequency) lớn hơn giá trị LOD phát hiện được ít nhất 1 vi giọt mang tín hiệu huỳnh đã xác định. Trong số 43 mẫu, chúng tôi phát hiện 7 quang của mẫu dò đột biến. trường hợp (16.33%) mang một trong các đột biến khảo sát trên gen EGFR. Trong đó, 5 trường hợp Kết quả ứng dụng ddPCR phát hiện đột biến gen mang đột biến L858R và 2 trường hợp mang đột EGFR của bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ biến del19 đều là các đột biến có đáp ứng tốt với TKI Sau khi xác lập giá trị LOD của mỗi phản ứng và không có trường hợp mang đột biến kháng thuốc ddPCR, chúng tôi ứng dụng phương pháp này để T790M được phát hiện. phân tích đột biến trên cfDNA thu từ mẫu sinh thiết lỏng của 43 bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ. Bảng 3. Kết quả phát hiện đột biến trên gen EGFR từ mẫu cfDNA và DNA mô u (FFPE) bằng phương pháp ddPCR MT: trình tự đột biến N/A: bệnh nhân không thu được mẫu DNA mô u TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 233
GIẢI PHẪU BỆNH Ngoài ra, chúng tôi tiến hành thu nhận DNA từ kit này phương pháp ddPCR chúng tôi phát triển có các mẫu mô u được cố định trong paraffin (FFPE) độ nhạy hơn 10 lần. Đồng thời, trong nghiên cứu của các bệnh nhận này và thực hiện ddPCR để so này, chúng tôi chứng minh phương pháp ddPCR có sánh với kết quả phát hiện đột biến trên mẫu sinh thể ứng dụng trong lâm sàng để phát hiện đột biến thiết lỏng. Tuy nhiên, do điều kiện bệnh lý của bệnh trên ctDNA từ các mẫu sinh thiết lỏng của bệnh nhân nhân nên trong một số trường hợp chúng tôi không UT phổi với độ tương đồng cao (87.5%) khi so sánh thể thu đủ mẫu sinh thiết mô u cho phân tích di với kết quả phát hiện đột biến trên mẫu DNA mô u. truyền. Do đó, chúng tôi chỉ tiến hành so sánh kết Các trường hợp cho kết quả không tương quan giữa quả của 32 trường hợp có cả mẫu cfDNA và DNA ctDNA và DNA mô u có thể do 1) tế bào ung thư mô u. phóng thích ít ctDNA hoặc khối u ở vị trí mà DNA ngoại bào khó được phóng thích vào máu ngoại vị Bảng 3 cho thấy ddPCR cho kết quả phát hiện hoặc tỉ lệ ctDNA mang đột biến quá thấp dưới đột biến gen EGFR có mức tương đồng khá cao là ngưỡng phát hiện của phương pháp 2) sinh thiết mô 87.5% (28/32) giữa cfDNA thu từ máu và mẫu DNA u tại vị trí không có các dòng tế bào UT mang đột thu nhận từ mô u tương ứng của cùng một bệnh biến. Những nghiên cứu lâm sàng với số lượng mẫu nhân. Trong đó, đột biến L858R cùng được phát lớn trước đây (AURA và AURA3) cho thấy với hiện trên cả cfDNA và DNA mô u của 2 bệnh nhân những mẫu cfDNA có tần suất đột biến >1% thì LBL015 và LBL017. Đặc biệt, mẫu LBL015 mang đột phương pháp ddPCR có thể đạt độ nhạy phát hiện là biến L858R ở tần suất khá cao trên cả cfDNA và 97% và mức âm tính giả chấp nhận là 3%[12]. Vì vậy, DNA mô u lần lượt là 46.25% và 38.99%. Kết quả Hiệp Hội Ung Thư Hoa Kỳ (ASCO) khuyến cáo nếu này cho thấy bệnh nhân này có thể mang đột biến kết quả phát hiện các đột biến trên cfDNA là dương L858R là dạng đột biến được di truyền (germline tính sẽ cho phép kết luận là bệnh nhân mang đột mutation). Trong 4 trường hợp có kết quả không biến khảo sát. Tuy nhiên, do giới hạn về độ nhạy của tương quan (LBL021, LBL026, LBL030 và LBL033), phương pháp sử dụng nên trong những trường hợp ddPCR phát hiện được đột biến del19 trên DNA mô kết quả âm tính trên cfDNA thi ASCO khuyến cáo u nhưng cho kết quả âm tính trên mẫu cfDNA tương cần phải tiến hành phân tích đột biến trên mẫu mô u ứng cùng bệnh nhân. để có thể đưa ra kết luận chính xác[12]. Tóm lại, bộ phản ứng ddPCR của chúng tôi xây Tóm lại, với độ nhạy tốt và việc phân tích kết dựng có thể xác định các kiểu đột biến trên gen quả không quá phức tạp, ddPCR là phương pháp có EGFR có liên quan đến đáp ứng thuốc của bệnh thể triển khai phát hiện một số đột biến gen xác định nhân ung thư phổi từ nguồn mẫu sinh thiết lỏng của nhằm hỗ trợ điều trị ung thư lâm sàng. Đặc biệt, và đạt độ tương đồng cao (87.5%) khi so sánh với phương pháp này có ý nghĩa lớn trong các trường kết quả trên mẫu sinh thiết mô u. hợp bệnh nhân ung thư đã di căn hoặc đã qua phẫu KẾT LUẬN VÀ BIỆN LUẬN thuật mà sinh thiết mô u không thể thực hiện. Đột biến trên gen EGFR xuất hiện phổ biến ở TÀI LIỆU THAM KHẢO các bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ (35%) và 1. Schlessinger J. Cell signaling by receptor liên quan đến tính đáp ứng của bệnh nhân này với tyrosine kinases. Cell 2000; 103: 211-25. các thuốc điều trị UT hiện được công nhận bởi FDA[2]. Hiện nay, việc xác định các đột biến này 2. Bhullar KS, Lagaron NO, McGowan EM, Parmar được tiến hành chủ yếu trên nguồn DNA thu nhận I, Jha A, Hubbard BP, et al. Kinase-targeted bằng phương pháp sinh thiết mô u. Phương pháp cancer therapies: progress, challenges and này mang tính xâm lấn nên không thể tiến hành lấy future directions. Molecular cancer 2018; 17: 48. mẫu lặp lại để theo dõi đáp ứng của bệnh nhân 3. Douillard JY, Ostoros G, Cobo M, Ciuleanu T, trước và sau điều trị và trong nhiều trường hợp McCormack R, Webster A, et al. First-line không đủ mẫu để phân tích di truyền [6]. Hơn nữa gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive việc lấy mẫu sinh thiết tại một vị trí xác định có thể NSCLC patients: a phase-IV, open-label, single- không phản ảnh được tính đa dạng và phức tạp của arm study. British journal of cancer 2014; 110: khối u[6]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển 55-62. phương pháp ddPCR có độ nhạy phát hiện đột biến ở tần suất tối thiểu là 0.5% (ngoại trừ đột biến 4. Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, Sima CS, T790M được phát hiện ở LOD 1%). Hiện nay, bộ thử Zakowski MF, Pao W, et al. Analysis of tumor nghiệm thương mại Cobas (Roche) được FDA công specimens at the time of acquired resistance to nhận và cho lưu hành dựa trên nguyên lý của phản EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR- ứng PCR thông thường có thể phát hiện đột biến mutant lung cancers. Clinical cancer research: del19 và L858R ở LOD là 5%[6]. Như vậy, so với bộ 234 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM
GIẢI PHẪU BỆNH an official journal of the American Association for throughput droplet digital PCR system for Cancer Research 2013; 19: 2240-7. absolute quantitation of DNA copy number. Analytical chemistry 2011; 83: 8604-10. 5. Gu J, Zang W, Liu B, Li L, Huang L, Li S, et al. Evaluation of digital PCR for detecting low-level 9. Feng WN, Gu WQ, Zhao N, Pan YM, Luo W, EGFR mutations in advanced lung Zhang H, et al. Comparison of the SuperARMS adenocarcinoma patients: a cross-platform and Droplet Digital PCR for Detecting EGFR comparison study. Oncotarget 2017; 8: 67810- Mutation in ctDNA From NSCLC Patients. 20. Translational oncology 2018; 11: 542-5. 6. Kim SS, Choi HJ, Kim JJ, Kim MS, Lee IS, Byun 10. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet B, et al. Droplet digital PCR-based EGFR Digital PCR versus qPCR for gene expression mutation detection with an internal quality control analysis with low abundant targets: from variable index to determine the quality of DNA. Scientific nonsense to publication quality data. Scientific reports 2018; 8: 543. reports 2017; 7: 2409. 7. Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, 11. Bio-Rad Laboratories I. Rare Mutation Detection Bardelli A. Liquid biopsy: monitoring cancer- Best Practices Guidelines. genetics in the blood. Nature reviews. Clinical 12. Meador C, Hu Y, Yang JC-H, Mok T, Laus G, oncology 2013; 10: 472-84. Hovey T, et al. 8. Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA, Belgrader P, Heredia NJ, Makarewicz AJ, et al. High- TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 235

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.