Ứng dụng realtime - PCR để xác định nhanh các đa hình gen CYP2C19 và ITGB3 trong chẩn đoán tính kháng thuốc clopidogrel và aspirin bệnh nhân đặt stent động mạch vành

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> ỨNG DỤNG REALTIME - PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH NHANH<br /> CÁC ĐA HÌNH GEN CYP2C19 VÀ ITGB3 TRONG CHẨN ĐOÁN<br /> TÍNH KHÁNG THUỐC CLOPIDOGREL VÀ ASPIRIN<br /> BỆNH NHÂN ĐẶT STENT ĐỘNG MẠCH VÀNH<br /> Nguyễn Thị Minh Ngọc*; Nguyễn Thị Trang*<br /> Lương Thị Lan Anh*; Nguyễn Thị Mai Ngọc**; Triệu Tiến Sang***<br /> TÓM TẮT<br /> Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các đa hình CYP2C19*2, CYP2C19*3 gen CYP2C19<br /> và PlA1/PlA2(Leu33Pro) gen ITGB3 có liên quan đến đề kháng clopidogrel và aspirin. Tách<br /> ADN được từ 40 bệnh nhân (BN), sử dụng kỹ thuật realtime - PCR để xác định đa hình gen<br /> CYP2C19*2, CYP2C19*3 và PlA1/PlA2 (Leu33Pro). Khi phân tích đa hình gen CYP2C19<br /> (CYP2C19*2 và CYP2C19*3) phát hiện 21 người (52,5%) có mang đột biến gen, trong đó 14<br /> người (35%) mang gen dị hợp tử và 4 người (10%) mang đồng hợp tử đột biến CYP2C19*2 và<br /> 3 người mang gen dị hợp CYP2C19*3. Với đa hình PlA1/PlA2 gen ITGB3, phát hiện 4 người<br /> mang gen dị hợp tử (10%). Như vậy, tỷ lệ phát hiện đa hình gen trên khá cao ở nhóm BN điều<br /> trị kép clopidogrel và aspirin.<br /> * Từ khóa: Bệnh mạch vành; CYP2C19; Kháng clopidogrel; ITGB3; Kháng aspirin.<br /> <br /> Realtime-PCR Application for Determine Polymorphism of<br /> CYP2C19 and ITGB3 Gene in Clinical Diagnostic Clopidogrel and<br /> Aspirin Resistance in Patients Placed Coronary Stent<br /> Summary<br /> Numerous studies have shown that the polymorphisms of CYP2C19*2, CYP2C19*3 gene<br /> CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro) of the ITGB3 gene are associated with clopidogrel and<br /> aspirin resistance. DNA was extracted from 40 patients. Using realtime-PCR technique to<br /> identify polymorphisms CYP2C19*2, CYP2C19*3 gene CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro)<br /> gene ITGB3. Results: In 40 samples, carriers of at least one CYP2C19 loss-of-function<br /> approximately 52.5% of the study population. CYP2C19*2: 10% homozygous genotype, 35%<br /> heterozygous genotype and 55% wild type. CYP2C19*3: 7.5% heterozygous genotype and<br /> 92.5% wild type. Carriers of the Leu33Pro polymorphism of ITGB3 gene approximately 10% of<br /> the study population. Conclusions: Initial description of polymorphisms of CYP2C19*2,<br /> CYP2C19*3 gene CYP2C19 and PlA1/PlA2 (Leu33Pro) gene ITGB3 have been found to be<br /> high rate in group patient used clopidogrel and aspirin dual therapy.<br /> * Keywords: Coronary artery disease; CYP2C19; Clopidogrel resistance; ITGB3; Aspirin resistance.<br /> * Trường Đại học Y Hà Nội<br /> * Viện Tim mạch Quốc gia<br /> *** Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Trang (trangtrang1182@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 06/09/2017<br /> <br /> 311<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh mạch vành là nguyên nhân gây<br /> tử vong hàng đầu tại các nước phát triển.<br /> Tại các nước đang phát triển, trong đó có<br /> Việt Nam, bệnh mạch vành đang có xu<br /> hướng gia tăng nhanh trong những năm<br /> gần đây. Đặt stent động mạch vành qua<br /> da là phương pháp điều trị hiệu quả cho<br /> BN mạch vành cần can thiệp. Khuyến cáo<br /> mới nhất<br /> của Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ và<br /> Hiệp hội Tim mạch châu Âu nhấn mạnh<br /> tầm quan trọng của duy trì thuốc kháng<br /> tiểu cầu kép sau đặt stent động mạch<br /> vành. Cụ thể, BN được can thiệp mạch<br /> vành (nong bóng động mạch vành hoặc<br /> đặt stent) cần dùng phối hợp aspirin với<br /> một thuốc kháng tiểu cầu thuộc nhóm ức<br /> chế P2Y12 như clopidogrel để giảm nguy<br /> cơ nhồi máu cơ tim hoặc tử vong. Tuy<br /> nhiên, đáp ứng thuốc ở mỗi BN khác<br /> nhau. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã<br /> chỉ ra đề kháng clopidogrel và aspirin bị<br /> ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố di truyền, cụ<br /> thể là liên quan đến kiểu gen của enzym<br /> chuyển hóa thuốc như CYP2C19 và<br /> ITGB3.<br /> CYP2C19*2 (CYP2C19 G681A, rs<br /> 4244285) và CYP2C19*3 (CYP2C19<br /> G636A, rs 4986893) là hai alen quy định<br /> enzym CYP2C19 giảm khả năng chuyển<br /> hóa clopidogrel đã được nhiều nghiên<br /> cứu chứng minh có liên quan đến gia<br /> tăng các biến cố tim mạch [2, 3, 4 . PlA1<br /> và PlA2 (Leu33Pro, rs5918) là 2 đa hình<br /> gen ITGB3 có liên quan đến đáp ứng với<br /> aspirin [5 . Undass và CS (2001) chỉ ra<br /> mối liên quan giữa đa hình PlA2 với tăng<br /> cường chức năng thrombin và giảm chức<br /> 312<br /> <br /> năng chống kết tập tiểu cầu của aspirin<br /> khi sử dụng thuốc trong chấn thương vi<br /> mạch [6 . Như vậy, trước một BN mạch<br /> vành đã đặt stent, để xác định phác đồ<br /> điều trị chống kết tập tiểu cầu hiệu quả<br /> nhất, cần xác định các đa hình gen liên<br /> quan đến chuyển hóa 2 thuốc clopidogrel<br /> và aspirin.<br /> Phương pháp realtime - PCR là<br /> phương pháp xác định đa hình chính xác<br /> với ưu điểm kỹ thuật tương đối đơn giản,<br /> thời gian nhanh chóng, mở ra nhiều triển<br /> vọng cho việc ứng dụng kỹ thuật này như<br /> một xét nghiệm thường quy trước khi chỉ<br /> định điều trị clopidogrel và aspirin cho BN<br /> mạch vành đã đặt stent. Vì vậy, chúng tôi<br /> tiến hành nghiên cứu này nhằm: Xác định<br /> các<br /> đa<br /> hình<br /> gen<br /> CYP2C19*2,<br /> CYP2C19*3 (G681A và G636A) và<br /> Leu33Pro (T1565) gen ITGB3 bằng kỹ<br /> thuật realtime - PCR ở BN mạch vành đã<br /> đặt stent.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 40 BN mạch vành (được chẩn đoán<br /> mắc hội chứng vành cấp: nhồi máu cơ<br /> tim, đau thắt ngực không ổn định), được<br /> đặt stent động mạch vành qua da và có<br /> chỉ định điều trị clopidogrel và aspirin.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Tách chiết AND từ máu ngoại vi<br /> (chống đông EDTA) bằng kít tách ADN<br /> Express của (Hãng Lytech, Nga). Sử<br /> dụng kỹ thuật realtime - PCR để xác định<br /> đa hình gen CYP2C19(CYP2C19*2 và<br /> CYP2C19*3) và PlA1/PlA2 (Leu33Pro)<br /> gen ITGB3 với trình tự mồi:<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Bảng 1:<br /> Đa h nh<br /> <br /> Tr nh tự mồi<br /> <br /> CYP2C19*2<br /> (G681A)<br /> <br /> CYP2C19*3<br /> (G636A)<br /> <br /> Leu33Pro<br /> (T1565C)<br /> <br /> FP<br /> <br /> 5’ - CCCACTATCATTGATTATTTCTCG - 3’<br /> <br /> ASP<br /> <br /> 5’- CCCACTATCATTGATTATTTCTCA - 3’<br /> <br /> RP<br /> <br /> 5’ - ACGCAAGCAGTCACATAACTA - 3’<br /> <br /> FP<br /> <br /> 5’ - GGATTGTAAGCACCCCCAGG - 3’<br /> <br /> ASP<br /> <br /> 5 - GGATTGTAAGCACCCCCAGA - 3’<br /> <br /> RP<br /> <br /> 5’ - TCACCCCATGGCTGTCTAGG - 3’<br /> <br /> FP<br /> <br /> 5’ - GCTCCAATGTACGGGGTAAAC - 3’<br /> <br /> ASP<br /> <br /> 5’ - GCTCCAATGTACGGGGTAAAT - 3’<br /> <br /> RP<br /> <br /> 5’ - GGGGACTGACTTGAGTGACCT - 3’<br /> <br /> (FP: forward primer; ASP: allele specific<br /> primer; RP: reverse primer)<br /> Thực hiện kỹ thuật realtime - PCR trên<br /> máy CFX96 (BioRad, Mỹ) với chu trình<br /> luân nhiệt: 93oC - 1 phút, 35 chu kỳ (93oC<br /> - 10s, 64oC - 10s, 72oC - 20s), 72oC - 5<br /> phút.<br /> Sử dụng bộ kít ADN-express để tách<br /> chiết ADN và kỹ thuật realtime - PCR<br /> nhân gen và phân tích đột biến là phương<br /> pháp tiết kiệm thời gian: trung bình 45<br /> phút cho tách chiết ADN và 90 phút cho<br /> <br /> xác định đa hình gen. Như vậy, kỹ thuật<br /> này có khả năng ứng dụng cao trong thực<br /> hành lâm sàng để xác định nhanh và<br /> chính xác kiểu gen của BN trước khi đưa<br /> ra phác đồ, liều điều trị clopidogrel và<br /> aspirin.<br /> * Đạo đức nghiên cứu:<br /> Số liệu và thông tin nghiên cứu hoàn<br /> toàn chính xác, trung thực và khách quan<br /> đã được cơ sở nghiên cứu xác nhận và<br /> chấp thuận. Thông tin về BN được giữ bí<br /> mật và chỉ phục vụ công tác nghiên cứu.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Thông tin chung về mẫu nghiên cứu.<br /> Bảng 2: Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu.<br /> Đặc điểm<br /> <br /> T lệ (n = 40)<br /> <br /> Tuổi (trung bình ± độ lệch)<br /> <br /> 62,6 ± 9,5<br /> <br /> Giới: nam<br /> nữ<br /> <br /> 34 ( 85%)<br /> 6 (15%)<br /> <br /> Tăng huyết áp<br /> <br /> 29 (72,5%)<br /> <br /> Đái tháo đường<br /> <br /> 9 (22,5%)<br /> <br /> Rối loạn lipid máu<br /> <br /> 13 (32,5%)<br /> <br /> Số lần đặt stent ≥ 2 lần<br /> <br /> 7 (17,5%)<br /> <br /> 313<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> 40 BN tham gia nghiên cứu, độ tuổi từ 39 - 79,nam giới chiếm đa số (85%). BN có<br /> yếu tố nguy cơ cao bệnh tim mạch chiếm tỷ lệ tương đối lớn, đặc biệt là tăng huyết áp<br /> và rối loạn lipid máu.<br /> 2. Tỷ lệ phát hiện đa hình gen CYP2C19 và ITGB3 bằng kỹ thuật realtime - PCR.<br /> Bảng 3:Tỷ lệ phát hiện đa hình gen CYP2C19 và ITGB3 ở nhómnghiên cứu.<br /> Chỉ số<br /> <br /> Gen CYP2C19<br /> <br /> Gen ITGB3<br /> <br /> Gi i<br /> <br /> Đa hình gen *2, *3<br /> <br /> Đa hình gen Leu33Pro<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 16 (47,1%)<br /> <br /> 3 (8,8%)<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 4 (66,7%)<br /> <br /> 1 (16,7%)<br /> <br /> Chung<br /> <br /> 21 (52,5%)<br /> <br /> 4 (10%)<br /> <br /> Tỷ lệ các đa hình gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 ở nhóm nghiên cứu tương đối lớn:<br /> 52,5% BN mang ít nhất 1 alen CYP2C19 làm giảm chức năng chuyển hóa clopidogrel.<br /> Bên cạnh đó, 10% BN có đa hình gen ITGB3 liên quan đến đề kháng aspirin.<br /> 3. T lệ các đa h nh gen CYP2C19 và ITGB3 ở nhóm nghiên cứu.<br /> Bảng 4: Kết quả xác định kiểu gen CYP2C19 và ITGB3 ở nhóm nghiên cứu.<br /> Tần số kiểu gen<br /> Gen<br /> <br /> Bình thường<br /> <br /> Dị hợp tử<br /> <br /> Đồng hợp tử đa hình<br /> <br /> (%)<br /> <br /> (%)<br /> <br /> (%)<br /> <br /> n = 22<br /> <br /> n =14<br /> <br /> n=4<br /> <br /> (55%)<br /> <br /> (35%)<br /> <br /> (10%)<br /> <br /> CYP2C19*2<br /> (G681A)<br /> CYP2C19*3<br /> (G636A)<br /> <br /> n = 37<br /> <br /> n=3<br /> <br /> n=0<br /> <br /> (92,5%)<br /> <br /> (7,5%)<br /> <br /> (0%)<br /> <br /> PlA1/PlA2<br /> <br /> n = 36<br /> <br /> n=4<br /> <br /> n=0<br /> <br /> (T1565C)<br /> <br /> (90%)<br /> <br /> (10%)<br /> <br /> (0%)<br /> <br /> 45% BN mang alen CYP2C19*2, chủ yếu kiểu gen dị hợp tử (35%), kiểu gen đồng<br /> hợp tử 10%. 7,5% BN mang alen CYP2C19*3, đều có kiểu gen dị hợp tử. 10% BN<br /> mang alen PlA2 - đều có kiểu gen dị hợp tử.<br /> BÀN LUẬN<br /> Bệnh mạch vành ngày càng gia tăng<br /> và chiếm tỷ lệ lớn trong các bệnh tim<br /> mạch nói riêng và mô hình bệnh tật nói<br /> chung. Liệu pháp chống kết tập tiểu cầu<br /> đóng vai trò thiết yếu trong điều trị hội<br /> <br /> 314<br /> <br /> chứng vành cấp và các thủ thuật can<br /> thiệp mạch vành qua da. Hiện nay,<br /> phương pháp điều trị phối hợp aspirin và<br /> clopidogrel được xem như liệu pháp<br /> kháng tiểu cầu chuẩn cho những bệnh lý<br /> này. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ<br /> ra đề kháng với aspirin và clopidogrel làm<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> giảm hiệu quả điều trị. Theo nghiên cứu<br /> của Boris T và CS (2009), tỷ lệ không đáp<br /> ứng với aspirin dao động từ 5 - 60%, với<br /> clopidogrel 6 - 25% và cả hai thuốc là<br /> 10,4% [7 . Ở Việt Nam, Đỗ Quang Huân<br /> (2013) khảo sát 174 BN mạch vành thấy<br /> tỷ lệ không đáp ứng với aspirin 21,3%,<br /> với clopidogrel 26,4% [1 . Như vậy,<br /> nghiên cứu về các yếu tố liên quan đến<br /> đề kháng clopidogrel và aspirin, đặc biệt<br /> yếu tố di truyền rất cần thiết trong việc<br /> phòng và điều trị bệnh mạch vành.<br /> Trong nghiên cứu của chúng tôi, 52,5%<br /> BN có mang ít nhất 1 alen CYP2C19 làm<br /> giảm khả năng chuyển hóa clopidogrel<br /> (CYP2C19*2 hoặc CYP2C19*3). Kết quả<br /> này tương tự với nghiên cứu của Liu Mao<br /> và CS (2013): khoảng 55% người châu Á<br /> mang ít nhất 1 alen làm giảm hoạt tính<br /> của enzym CYP2C19 [8 . Trong đó, chủ<br /> yếu là BN có kiểu gen dị hợp CYP2C19*2<br /> (14 BN - 35%) và 3 BN mang kiểu gen dị<br /> hợp CYP2C19*3 (7,5%). Như vậy, kiểu<br /> gen chuyển hóa ở mức trung bình<br /> (intermediate metabolizers) clopidogrel<br /> chiếm tỷ lệ tương đối lớn. Kiểu gen<br /> chuyển hóa kém (poor metabolizers) đồng hợp CYP2C19*2 và đồng hợp<br /> CY2C19*3 có 4 BN(10%). Theo khuyến<br /> cáo của Hội Dược lý Lâm sàng và Điều trị<br /> Hoa Kỳ (ASCPT) (2013) về sử dụng<br /> thuốc chống ngưng tập tiểu cầu dựa trên<br /> kiểu gen CYP2C19 [9 , BN có kiểu gen<br /> CYP2C19 chuyển hóa trung gian hoặc<br /> chuyển hóa kém cần xem xét tăng liều<br /> clopidogrel hoặc điều trị thay thế prasugrel,<br /> ticagrelor…<br /> Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi<br /> còn ghi nhận 4 BN (10%) mang đa hình<br /> Leu33Pro gen ITGB3, tất cả những BN<br /> <br /> này đều có kiểu gen dị hợp tửPlA1/PlA2.<br /> Không có BN mang kiểu gen đồng hợp tử<br /> PlA2/PlA2. Nghiên cứu của Sperr W.R và<br /> CS (1998) trên người châu Âu thấy 20 30% nhóm nghiên cứu mang kiểu gen<br /> PlA1/PlA2 và 1 - 3% mang kiểu gen<br /> PlA2/PlA2 [10 . Nghiên cứu này chỉ ra<br /> kiểu gen PlA1/PlA2 và PlA2/PlA2 làm<br /> tăng phản ứng hoạt hóa thrombin hơn so<br /> với kiểu gen đồng hợp tử PlA1/PlA1. Do<br /> đó làm giảm tác dụng chống kết tập tiểu<br /> cầu của aspirin, hay nói cách khác, người<br /> có mang alen PlA2 sẽ tăng khả năng<br /> kháng thuốc aspirin hơn. Nghiên cứu của<br /> Jussi M và CS (2000) ở người Phần Lan<br /> thấy trong nhóm nghiên cứu có 73,1%<br /> mang kiểu gen PlA1/PlA1, 24,2% PlA1/PlA2<br /> và 2,7% PlA2/PlA2 [11 . Nghiên cứu cũng<br /> chỉ ra mối liên quan chặt chẽ giữa alen<br /> PlA2 và gia tăng các biến cố tim mạch<br /> như huyết khối động mạch hoặc đột quỵ.<br /> Với kết quả nghiên cứu trên của chúng<br /> tôi, bước đầu thấy tỷ lệ mang đa hình gen<br /> CYP2C19 làm giảm khả năng chuyển hóa<br /> clopidogrel và đa hình gen ITGB3 làm<br /> giảm đáp ứng với aspirin ở nhóm BN<br /> mạch vành ở Việt Nam tương đối lớn,<br /> người thầy thuốc cần quan tâm trước khi<br /> điều trị phác đồ chống kết tập tiểu cầu kép.<br /> KẾT LUẬN<br /> Tỷ lệ BN mang đa hình gen<br /> CYP2C19*2 và CYP2C19*3 trong nghiên<br /> cứu 52,5%, tỷ lệ BN mang đa hình<br /> Leu33Pro gen ITGB3 10%. Như vậy, số<br /> BN có khả năng đáp ứng với clopidogrel<br /> và aspirin kém tương đối lớn, cần xác<br /> định kiểu gen để cân nhắc liều lượng<br /> thuốc, hoặc thay thế thuốc cho phù hợp<br /> <br /> 315<br /> <br />