Nghiêm Ngọc Minh và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
82(06): 97 - 102<br />
<br />
XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN RPOB LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG<br />
RIFAMPICIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LAO THU THẬP<br />
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM<br />
Nghiêm Ngọc Minh1*, Nguyễn Văn Bắc1, Vũ Thị Mai1, Cung Thị Ngọc Mai1,<br />
Vũ Thị Thanh1, Nguyễn Thái Sơn2<br />
1<br />
<br />
Viện Công nghệ sinh học - Viện KH&CN Việt Nam, 2Bệnh viện 103 - Học viện Quân y<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis, MTB) là một trong những nhiễm trùng phổ biến<br />
nhất ở loài người. Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Hiện nay, bệnh<br />
lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện của nhiều chủng vi khuẩn lao với đặc trưng là<br />
kháng đa thuốc, lao kháng thuốc phổ rộng và lao đồng nhiễm HIV/AIDS. Những chủng vi khuẩn<br />
lao kháng rifampicin (RIF) đồng thời cũng kháng với nhiều kháng sinh chống lao khác. Phương<br />
pháp sinh học phân tử cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác các trường hợp bệnh nhân bị nhiễm<br />
vi khuẩn lao kháng thuốc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cặp mồi rpoB-F1 và rpoB-R1<br />
đã được thiết kế nhằm khuếch đại đoạn gen rpoB gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB<br />
(còn gọi là “the mutation hot spot region”). Sau khi PCR nhân gen rpoB ở 7 chủng vi khuẩn lao<br />
thu thập tại Viện Lao và Bệnh phổi Trung ương, phân tích trình tự đoạn gen rpoB của chúng thấy<br />
xuất hiện các đột biến sai nghĩa xảy ra tại codon 516 (GAC→GTC) (20%) và codon 531<br />
(TCG→TTG) (66,67%) có liên quan đến kháng RIF. Kết quả này có ý nghĩa rất lớn trong việc thay<br />
đổi phác đồ điều trị và kiểm soát bệnh lao ở một nước có mức độ bệnh nhân lao cao như nước ta.<br />
Từ khóa: Gen rpoB, lao kháng đa thuốc, rifampicin, vi khuẩn lao<br />
∗<br />
<br />
MỞ ĐẦU<br />
Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis,<br />
MTB) thuộc giống Mycobacterium, họ<br />
Mycobacteriaceae [7]. Đây là vi khuẩn truyền<br />
nhiễm được tổ chức y tế thế giới (WHO)<br />
khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu<br />
bởi mức độ lây lan và hậu quả nghiêm trọng<br />
của chúng gây ra đối với sức khỏe con người.<br />
Theo ước tính của WHO trên thế giới có<br />
khoảng 42 vạn người mắc lao đa kháng thuốc,<br />
chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây<br />
Thái Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế<br />
đến là khu vực Đông Nam Á và sau đó là khu<br />
vực Châu Phi và Đông Âu. Ở Việt Nam mỗi<br />
năm có khoảng 100.000 người mắc bệnh lao<br />
và 20.000 người chết đứng thứ 12 trong tổng<br />
số 22 quốc gia có số bệnh nhân lao cao [2].<br />
Ngày nay, bệnh lao càng trở nên nghiêm<br />
trọng hơn khi xuất hiện các chủng vi khuẩn<br />
lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs Resistant –<br />
MDR), kháng thuốc phổ rộng (Extensively<br />
∗<br />
<br />
Tel:<br />
<br />
Drug Resistance – XDR) và đồng nhiễm<br />
HIV/AIDS. Vì vậy, việc nghiên cứu chẩn<br />
đoán vi khuẩn lao kháng thuốc có ý nghĩa hết<br />
sức to lớn đối với y học cũng như sức khỏe<br />
con người.<br />
Hai phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc<br />
được sử dụng rộng rãi hiện nay là phương<br />
pháp xác định kiểu hình và phương pháp xác<br />
định kiểu gen. Trong đó, phương pháp xác<br />
định kiểu hình dựa trên khả năng phát triển<br />
của vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy có<br />
kháng sinh phải mất 4 – 8 tuần và đòi hỏi<br />
nồng độ của mẫu cao, nên độ nhạy của phản<br />
ứng thấp. Khắc phục những nhược điểm trên,<br />
phương pháp xác định kiểu gen dựa trên cơ sở<br />
xác định đột biến ở các gen có liên quan<br />
kháng thuốc tương ứng như giải trình tự gen,<br />
lai trên pha rắn, real-time PCR…[13]. Trong<br />
đó giải trình tự gen vẫn là phương pháp cơ<br />
bản, xác định MDR trong các mẫu bệnh phẩm<br />
lâm sàng chính xác và rõ ràng nhất.<br />
Genome của M. tuberculosis được giải trình<br />
tự, phân tích và công bố năm 1998 gồm<br />
97<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />
Nghiêm Ngọc Minh và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
4.411.529 bp, chứa 65% guanine và cytosine.<br />
Trên 90% tổng số gen được dự đoán là có mã<br />
hóa cho protein và chỉ có 6 gen giả<br />
(pseudogene) [8]. Gen rpoB là một đoạn DNA<br />
có kích thước 3519 bp, nằm trên nhiễm sắc thể<br />
của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa<br />
tiểu đơn vị β của enzyme RNA polymerase<br />
[12]. Thông qua enzyme này, RIF gây tác dụng<br />
lên chức năng phiên mã tạo RNA thông tin<br />
(mRNA) ở vi khuẩn lao. Người ta nhận thấy có<br />
khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng<br />
RIF có đột biến trên gen này [7, 12]. Trong đó,<br />
các đột biến sai nghĩa làm thay đổi amino acid<br />
Ser→Leu, His→Arg, Arg→Val tương ứng với<br />
vị trí đột biến tại codon 531 (TCG→TTG),<br />
codon 526 (CAC→GAC), và codon 516<br />
(GAC→GTC) [6,12].<br />
VẬT<br />
LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
Vật liệu nghiên cứu<br />
Nguồn DNA tổng số của vi khuẩn lao<br />
DNA tổng số được tách chiết và tinh sạch từ<br />
các chủng vi khuẩn lao có trong các mẫu bệnh<br />
phẩm ở Viện Lao và Bệnh phổi Trung ương<br />
theo phương pháp phenol/chloroform/isoamyl<br />
alcohol [9].<br />
Các sinh phẩm hóa chất chính<br />
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR<br />
(Fermentas), kit tách chiết plasmid (Qiagen),<br />
vector nhân dòng pBT, chủng vi khuẩn E.coli<br />
DH5α (Fermentas) và một hóa chất khác như:<br />
cao nấm men, peptone từ ICN (Mỹ), các<br />
enzyme BamHI, T4 ligase từ Fermentas.<br />
Các chủng M. tuberculosis được nuôi cấy trên<br />
môi trường Lowenstein-Jensen. Các chủng E.<br />
coli được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng<br />
(10 g/l Bacto-tryptone; 5 g/l Yeast extract; 10<br />
g/l NaCl; pH 7,2).<br />
Phương pháp nghiên cứu<br />
Thiết kế mồi<br />
Các cặp mồi được thiết kế tại những vùng có<br />
độ bảo thủ cao nhất và phải chứa vùng<br />
“nóng” - “hot-spot region” gồm 27 codon<br />
nằm gần trung tâm của gen rpoB của chủng<br />
dại H37Rv. Trên cơ sở đó, các cặp mồi đặc<br />
<br />
82(06): 97 - 102<br />
<br />
hiệu rpoB-F1 (5’-GCC ACC ATC GAA TAT<br />
CTG GT-3’) và rpoB-R1 (5’-ACA CGA TCT<br />
CGT CGC TAA CC-3’) được thiết kế để<br />
nhân vùng gen 571 bp của gen rpoB.<br />
Tách chiết DNA và khuếch đại gen<br />
DNA tổng số của M. tuberculosis được tách chiết<br />
theo phương pháp phenol/chlorofrom/isoamyl<br />
alcohol [9]. Phản ứng PCR nhân đoạn gen<br />
rpoB đặc hiệu với thể tích 25 µl gồm: 2,5 µl<br />
đệm PCR 10X; 2 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl<br />
dNTP 2,5 mM; 1 µl mỗi loại mồi rpoB-F1 và<br />
rpoB-R1 10 pmoles/µl; 0,25 µl Taq DNA<br />
polymerase 5 U/µl; 3 µl mẫu DNA tổng số,<br />
12,75 µl nước deion và theo chu trình nhiệt như<br />
sau: 01 chu kỳ 950C/5 phút; 32 chu kỳ (940C/1<br />
phút; 560C/45 giây; 720C/1 phút); 01 chu kỳ<br />
720C/10 phút; và giữ ở 40C đến khi phân tích.<br />
Dòng hóa rpoB vào vector pBT<br />
Sau khi khuếch đại, tinh sạch bằng bộ kit<br />
AccuPrep PCR Purification của hãng Bioneer,<br />
đoạn gen rpoB tiếp tục được dòng hóa vào<br />
vector pBT để tạo vector tái tổ hợp mang gen<br />
rpoB (ký hiệu : pBrpoB). Hỗn hợp phản ứng nối<br />
ghép 10 µl (1 µl dung dịch đệm 10X T4 ligase;<br />
1 µl vector pBT; 5 µl sản phẩm PCR; 1 µl T4<br />
ligase; 2 µl nước deion), hỗn hợp phản ứng<br />
được ủ ở 220C trong 1 giờ. Mix 5 µl sản phẩm<br />
nối ghép với tế bào khả biến E. coli DH5α và<br />
sốc nhiệt ở 420C trong 70 giây. Sản phẩm biến<br />
nạp được bổ sung 200 µl LB lỏng, lắc 220<br />
vòng/phút 370C trong 1 giờ và hút 100 µl dịch<br />
khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩa thạch LB đặc<br />
có bổ sung carbenicillin 100 mg/l, IPTG<br />
100mg/l và X-gal 200 mg/l. Đĩa thạch được ủ<br />
qua đêm ở 370C. Khi trên đĩa thạch xuất hiện<br />
các khuẩn lạc xanh trắng, lựa chọn khuẩn lạc<br />
trắng nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng<br />
có bổ sung kháng sinh carbenicillin 100 mg/l.<br />
Tách chiết DNA plasmid theo hướng dẫn của<br />
hãng Qiagen để kiểm tra gen rpoB có gắn thành<br />
công vào vector pBT hay không bằng phản ứng<br />
cắt bằng enzyme hạn chế BamHI. Plasmid cho<br />
kết quả dương tính tiếp tục phục vụ cho quá<br />
trình giải trình tự gen.<br />
<br />
98<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />
Nghiêm Ngọc Minh và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
Tách chiết DNA và khuếch đại gen<br />
DNA tách từ các chủng M. Tuberculosis được<br />
chạy điện di kiểm tra trên gel agarose 1%<br />
(không minh họa kết quả). DNA tinh sạch<br />
được dùng làm khuôn để nhân gen rpoB bằng<br />
phản ứng PCR với cặp mồi rpoB-F1 và rpoBR1. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel<br />
agarose 1% (Hình 1) đã thu được một băng<br />
DNA đặc hiệu, có kích thước 571 bp tương<br />
ứng với kích thước dự đoán khi thiết kế mồi.<br />
Do vậy, sản phẩm PCR tiếp tục được dùng để<br />
dòng hóa và xác định trình tự.<br />
<br />
Hình 1. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen<br />
rpoB bằng cặp mồi rpoB-F1 và rpoB-R1.<br />
M: thang chuẩn DNA 1 kb; 1-7 các chủng tương<br />
ứng TB02-111, TB02-115, TB02-116, TB02-117,<br />
TB02-118, TB02-122; 8 đối chứng âm.<br />
<br />
Hình 2. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ<br />
hợp gen rpoB bằng enzyme BamHI.<br />
M: thang chuẩn DNA 1 kb; 1-7 các chủng tương<br />
ứng TB02-111, TB02-115, TB02-116, TB02-117,<br />
TB02-118, TB02-122.<br />
<br />
Sản phẩm PCR được chèn vào vector nhân<br />
dòng pBT thành vector tái tổ hợp pBrpoB và<br />
biến nạp vào E. Coli DH5α. Khuẩn lạc trắng<br />
<br />
82(06): 97 - 102<br />
<br />
(do có đoạn DNA quan tâm chèn vào giữa<br />
gen β-galactosidase) mọc trên đĩa thạch được<br />
chọn để nuôi cấy và tách plasmid kiểm tra.<br />
Để xác định chính xác gen chèn, plasmid được<br />
cắt bằng enzyme cắt giới hạn BamHI. Kết quả<br />
điện di kiểm tra cho một băng có kích thước<br />
tương ứng với đoạn gen rpoB (∼ 571 bp) các<br />
băng còn lại là pBT đã bị cắt (∼ 2,7 kb) hoặc<br />
pBrpoB chưa cắt hết<br />
Hình 2 Điều đó cho thấy đoạn gen rpoB đã<br />
được chèn vào vector pBT. Các vector tái tổ<br />
hợp này được chọn để xác định trình tự gen.<br />
Đọc trình tự và phân tích gen<br />
Đoạn gen rpoB của các chủng vi khuẩn lao<br />
nghiên cứu sau khi đọc trình tự được xử lý kết<br />
quả qua phần mềm tin sinh học BioEdit. So<br />
sánh trình tự nucleotide và acid amin từ các<br />
mẫu nghiên cứu với trình tự nucleotide và<br />
acid amin của chủng dại H37Rv chúng tôi<br />
thấy xuất hiện các đột biến khác nhau trên các<br />
chủng lao kháng thuốc, kết quả được thể hiện<br />
ở hình 3 và hình 4.<br />
Trong số 6 chủng kháng thuốc RIF có chủng<br />
TB02-111 xảy ra đột biến tại codon 516<br />
(GAC→GTC) (20%) làm thay đổi amino acid<br />
Asp→Val. Có 4 chủng TB02-115, TB02-116,<br />
TB02-117, TB02-122 xảy ra đột biến tại 531<br />
(TCG→TTG) (66,67%) làm thay đổi amino<br />
acid Ser →Leu. Chủng nhạy cảm với RIF<br />
không phát hiện thấy đột biến nào trên đoạn<br />
gen này.<br />
Nhiều quan sát về đột biến ở vùng nóng 81 bp<br />
của gen rpoB đã được công bố [1, 3, 4],<br />
khoảng 96% các chủng lao kháng RIF có đột<br />
biến ở vùng này của gen rpoB. Đột biến chủ<br />
yếu xảy ra ở các vị trí codon 516, 526, 531.<br />
Năm 2008, Gonul Aslan và cộng sự đã tiến<br />
hành thu thập 30 mẫu bệnh phẩm tại nhiều<br />
vùng khác nhau của Châu Á. Kết quả thu<br />
đươc 14 mẫu kháng RIF có đột biến tại codon<br />
531 (64,2%), 516 (7,1%) [5].<br />
Tại Việt Nam, Caws và các đồng tác giả<br />
(2006) đã xác định đột biến liên quan đến tính<br />
kháng đa thuốc trên 131 chủng vi khuẩn lao<br />
99<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />
Nghiêm Ngọc Minh và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
được phân lập tại bệnh viện Phạm Ngọc<br />
Thạch. Kết quả đã xác định được 100 chủng<br />
có đột biến trên gen rpoB tại codon 531<br />
(43%), 526 (31%), 516 (15%) [3].<br />
Những kết quả nghiên cứu trên thế giới đều<br />
cho rằng đột biến ở gen rpoB chủ yếu là thay<br />
thế một nucleotide, ít có các đột biến phức tạp<br />
[12, 4]. Theo tác giả Lishi Qian và cộng sự<br />
năm 2002 đã nghiên cứu đột biến ở RRDR<br />
(rifampin resistance determining region –<br />
vùng quyết định kháng RIF) của gen rpoB<br />
trên 66 chủng vi khuẩn lao được thu thập ở 4<br />
nước Đông Á là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn<br />
Quốc và Đài Loan. Trong số các chủng vi<br />
<br />
82(06): 97 - 102<br />
<br />
khuẩn lao đó có 59/66 (89,4%) được xác định<br />
là có đột biến.<br />
Ở các chủng đột biến đã xác định trình tự cho<br />
thấy mỗi chủng chỉ có một đột biến điểm ở<br />
một codon. Có 58/59 trường hợp là đột biến<br />
thay thế, chỉ có 1 trường hợp duy nhất là đột<br />
biến thêm nucleotide [10] Như vậy, các mẫu<br />
lao kháng thuốc được thu thập từ nhiều nơi<br />
trên thế giới có đặc điểm chung đó là xảy ra<br />
đột biến tại codon 516, 531 với dạng đột biến<br />
điển hình là 531 Ser→Leu với một tần suất<br />
rất cao (66,67%). Như vậy, nghiên cứu của<br />
chúng tôi hoàn toàn thống nhất với các công<br />
bố trong và ngoài nước.<br />
<br />
Hình 3. So sánh trình tự nucleotide các chủng nghiên cứu với trình tự nucleotide của chủng dại H37Rv<br />
<br />
100<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />
Nghiêm Ngọc Minh và đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
82(06): 97 - 102<br />
<br />
Hình 4. So sánh trình tự acid amin các chủng nghiên cứu với trình tự acid amin của chủng dại H37Rv<br />
<br />
KẾT LUẬN<br />
Đoạn gen rpoB của 7 chủng M. tuberculosis<br />
nghiên cứu thu nhận từ Viện Lao và Bệnh<br />
phổi Trung ương đã được nhân lên thông qua<br />
phản ứng PCR. Tách dòng, tạo vector tái tổ<br />
hợp, tách chiết DNA plasmid có chứa đoạn<br />
gen rpoB và xác định trình tự đã được thực<br />
hiện thành công. Tiến hành xác định trình tự<br />
và phát hiện đột biến trên gen rpoB 571 bp<br />
của 6 chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thì có<br />
chủng TB02-111 xuất hiện dạng đột biến thay<br />
thế một nucleotid tại codon 516 Asp→Val, và<br />
đột biến tại codon 531 Ser →Leu ở 4 chủng<br />
TB02-115, TB02-116, TB02-117, TB02-122<br />
của gen rpoB. Điều này cũng phù hợp với<br />
những công bố thường gặp nhất về đột biến<br />
sai nghĩa tại codon 516 và codon 531 của các<br />
tác giả trong nước và trên thế giới.<br />
Lời cảm ơn<br />
Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ<br />
kinh phí của đề tài nhánh “Nghiên cứu tối ưu<br />
hóa quy trình xác định nhanh các chủng vi<br />
khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật<br />
sinh học phân tử” thuộc chương trình<br />
KC10/06-10. Một số kết quả xác định trình tự<br />
được thực hiên trên các thiết bị của phòng thí<br />
nghiệm trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện<br />
Công nghệ sinh học.<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
[1]. Andréia Rosane M. Valim, Maria Lucia R., et<br />
al (2000), “Mutations in rpoB Gene of Multidrug<br />
Resistant Mycobacterium tuberculosis isolates<br />
from Brazil”, J. Clin. Microbiol, 38: 3119-3122.<br />
[2]. Bộ Y Tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia<br />
(2006), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao<br />
quốc gia 2005, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.<br />
<br />
[3]. Caws, M., Duy, P. M., Tho, D. Q., Lan, N. T.<br />
N., Hoa, D. V., Farrar, J. (2006), “Mutations<br />
Prevalent among Rifampin and Isoniazid Resistant<br />
Mycobacterium tuberculosis Isolate from a<br />
Hospital in Vietnam”, J. Clin. Microbiol. 44:<br />
2333-2337<br />
[4]. Cavusoglu, C., Hilmioglu, et al (2002),<br />
“Characterization of rpoB mutations in rifampinresistant clinial isolates of Mycobacterium tuberculosis<br />
from Turkey by DNA sequencing and Line Probe<br />
Assay”, J. Clin. Microbiol. 40: 4435-4438.<br />
[5]. Gonul Aslan and et al (2008), “Genotypic<br />
analysis of isoniazid and rifampicin resistance in<br />
drug resistant clinical mycobacterium tuberculosis<br />
complex isolates in southern Tukey”, Jpn. J.<br />
Infect. Dis., 61, 255-260<br />
[6]. James M (1995) Antimicrobial agent<br />
resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic<br />
Insights. Clinical Microbiol Rev 8: 496-514.<br />
[7]. Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi Sinh Vật Y<br />
học, Nhà Xuất bản Học viện Quân Y, Hà Nội.<br />
[8]. Palomino, J.C., Leao, S.C., Ritacco, V.<br />
(2007), Tuberculosis 2007 – from basic science to<br />
patient care, www.tuberculosistextbook.com<br />
[9]. Phạm Hùng Vân (2007) Các quy trình kỹ<br />
thuật sinh học phân tử thường được sử dụng trong<br />
chẩn đoán và nghiên cứu y sinh học.<br />
(http:www.nk-biotek.com.vn).<br />
[10]. Qian, L., Abe, C., Lin, T.P., Lin, T.P., Yu,<br />
M.C., Cho, S.N., Wang, S., Douglas, J.T. (2002),<br />
“rpoB genotypes of Mycobacterium tuberculosis<br />
Beijing family isolates from East Asian countries”<br />
J. Clin. Microbiol., 40, pp. 1091-1094.<br />
[11]. Tuberculosis (2007), External gene search<br />
for ‘Rv0667’,<br />
[12]. Telenti, A., Imboden, P., Marchesi, F.,<br />
Lowrie, D., Cole, S., Colston, M.J., Matter, L.,<br />
Schopfer, K., Bodmer, T. (1993), “ Detection of<br />
rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium<br />
tuberculosis”, Lancet 341, pp. 647-650.<br />
13. Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng<br />
thuốc cách phòng và điều trị, Nhà xuất bản Giáo<br />
dục, Hà Nội.<br />
<br />
101<br />
<br />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên<br />
<br />
http://www.lrc-tnu.edu.vn<br />
<br />