Xác định đột biến lặp đoạn gen Dystrophin bằng kỹ thuật Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN LẶP ĐOẠN GEN DYSTROPHIN BẰNG<br /> KỸ THUẬT MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION<br /> Phạm Lê Anh Tuấn, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh<br /> Trư ng h YH N<br /> <br /> t g t n- n nt Pr t n( P ) th t h nh ư ng ụng h t<br /> h n t n n ng n tr h n h nh nh n n ư ng ơ h nn r( )<br /> Ngh n n ư t n h nh ụ t h th n t n ng n tr h n ụng th t P 0<br /> nh nh n ư h n nh t n n nh nh n n ư ng ng<br /> th t t PC ( PC ) Ch ng t h th n ư 2 nh nh n t n n 1 nh nh n t<br /> n n n 5- 1 nh nh n t n n n 14 - 1 th t P th ng ụng<br /> nh t n ng n tr h n tr n nh nh n<br /> <br /> Từ khóa: Đột biến lặp đoạn, gen dystrophin, MLPA<br /> <br /> <br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ mRNA, bao gồm 79 exon; quy định tổng hợp protein<br /> dystrophin, là một protein nằm trên màng tế bào cơ, có<br /> Kỹ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ khi hoạt động.<br /> Amplification (MLPA) hay kỹ thuật khuếch đại đầu dò Đột biến gen dystrophin là nguyên nhân gây bệnh DMD<br /> đa mồi dựa vào phản ứng nối - là một biến thể của phản do sự mất toàn vẹn của protein dystrophin dẫn đến tế<br /> ứng PCR đa mồi (Multiplex Polymerase Chain Reaction) bào cơ bị tổn thương. DMD/BMD là một trong những<br /> cho phép khuếch đại nhiều đích chỉ với một cặp mồi duy bệnh lý về cơ do di truyền thường gặp nhất có tần suất<br /> nhất [1, 2]. Mỗi đầu dò bao gồm hai oligonucleotide, mỗi mắc bệnh vào khoảng 1/3.500 trẻ trai, biểu hiện lâm<br /> đoạn đều chứa một trình tự mồi cho phản ứng PCR và sàng nặng với triệu chứng yếu cơ mang tính chất tuần<br /> một trình tự bổ sung với trình tự đích (được gọi là trình tiến, trẻ bị teo cơ, mất khả năng đi lại và chết trước tuổi<br /> tự lai). Khi các đầu dò được lai chính xác vào trình tự trưởng thành do suy tim và rối loạn hô hấp. Đột biến<br /> đích, chúng sẽ được nối lại bởi enzym ligase bền nhiệt. tạo mã kết thúc sớm hoặc gây lệch khung dịch mã sẽ<br /> Phản ứng PCR sẽ chỉ khuếch đại các đầu dò đã được gây nên thể nặng DMD trong khi đó đột biến không gây<br /> nối lại hoàn chỉnh. Vì mỗi đầu dò đều được đánh dấu lệnh khung dịch mã sẽ gây nên thể nhẹ BMD. Xác định<br /> huỳnh quang và có kích thước riêng biệt, nên có thể đột biến gen dystrophin có vai trò rất quan trọng trong<br /> thu được tín hiệu của mỗi đầu dò đã được phân tách tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, đặc biệt giúp<br /> và xác định trên hệ thống điện di mao quản. Kỹ thuật cho liệu pháp điều trị gen [5; 6]. Có nhiều dạng đột biến<br /> MLPA có thể định lượng số bản sao của nhiều trình trên gen dystrophin bao gồm đột biến xóa đoạn chiếm<br /> tự trong một gen với năng suất lên tới 40 trình tự đích 50 - 65%, đột biến điểm 20 - 25% và đột biến lặp đoạn<br /> trong một phản ứng [3; 4]. MLPA là một kỹ thuật có độ chiếm 5 - 10% [6]. Nghiên cứu được tiến hành với mục<br /> chính xác cao được ứng dụng để phát hiện đột biến tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA xác định đột biến lặp<br /> xóa đoạn và lặp đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ<br /> DMD/BMD. Tuy nhiên, giá thành cao hơn so với một số Duchenne / Becker.<br /> kỹ thuật thông thường khác. Nghiên cứu này lựa chọn<br /> những bệnh nhân đã được xác định đột biến xóa đoạn II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> bằng kỹ thuật mPCR và xác định các đột biến lặp đoạn<br /> gen dystrophin bằng kỹ thuật MLPA. Gen dystrophin có 1. Đối tượng<br /> chiều dài hơn 3000 Kb nằm trên NST X, mã hóa 14 - kb 30 bệnh nhân được chẩn đoán là DMD/BMD dựa<br /> vào các dấu hiệu lâm sàng và cận lâm sàng điển hình.<br /> h n h T Th nh n nH nh trư ng Bệnh nhân có dấu hiệu yếu cơ, đi lại hay vấp ngã, phì<br /> h YH N đại cơ cẳng chân, dấu hiệu Gower dương tính. Xét<br /> t th nh n h n nghiệm enzym Creatine Kinase (CK) tăng cao (bình<br /> Ng nh n 2 2014 thường 200 UI/l). Bệnh nhân đã được sàng lọc không<br /> Ng h th n 1 11 2014 mang đột biến xóa đoạn trên gen dystrophin bằng kỹ<br /> <br /> 19<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> thuật mPCR [7]. 02 người bình thường được lựa chọn (P034/P035) vào ống mẫu. Để ở 95°C trong 1 phút, sau<br /> làm mẫu đối chứng đi kèm với mẫu bệnh nhân trong đó giữ ở 60°C trong 16 giờ. Phản ứng nối: Giữ ở 54°C.<br /> mỗi phản ứng MLPA. Thêm vào: 3 µl Ligase - 65 buffer A + 3 µl Ligase - 65<br /> 2. Phương pháp buffer B + 1 µl Ligase - 65 + 25 µl DW. Để ở 54°C trong<br /> 2.1. Quy trình lấy mẫu: Bệnh nhân sẽ được lấy 2ml 15 phút, sau đó là 98°C trong 5 phút và giữ ở 15°C.<br /> máu tĩnh mạch chống đông trong EDTA. Quy trình đảm Phản ứng PCR: Thêm vào: 7,5 µl DW + 2 µl Cy5 Primer<br /> bảo tuyệt đối vô trùng. Mix + 0,5 µl Salsa Polymerase. Chạy chu trình nhiệt : 35<br /> 2.2. Quy trình tách chiết DNA tổng số: Quy trình x [95°C/30 giây - 60°C/30 giây - 72°C/60 giây] - 72°C/20<br /> tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo quy trình phút – Giữ ở 15°C [4]. Chạy trên máy Beckman Coulter<br /> phenol/chloroform [7]. Nồng độ và độ tinh sạch DNA CEQ600, phân tích trên phần mềm GeneMarker. Tính<br /> được kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260 toán theo công thức: RPA(Relative Peak Area) = [As/<br /> / 280). ΣAs] / [Ac/ΣAc]. X ≥ 1.5: đột biến lặp đoạn.<br /> 2.3. Quy trình MLPA xác định đột biến lặp đoạn 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> Nguyên lý: Sử dụng 79 đầu dò (probe) DNA lai đặc Bệnh nhân và người nhà hoàn toàn tự nguyện tham<br /> hiệu với 79 exon của gen dystrophin. Mỗi probe gồm gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút<br /> hai chuỗi oligonucleotide, một chuỗi ngắn và một chuỗi lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia<br /> dài. Mỗi chuỗi có 2 trình tự quan trọng: vào nghiên cứu. Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân<br /> - Vị trí liên kết đặc hiệu và liền kề nhau trên trình tự exon sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp<br /> đích tương ứng, tạo điều kiện cho enzym ligase gắn 2 cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ<br /> chuỗi lại thành probe hoàn chỉnh. Nếu có đột biến lặp điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm<br /> đoạn trong mẫu DNA. bảo bí mật.<br /> - Vị trí gắn mồi phản ứng PCR khuếch đại probe, có<br /> trình tự giống hệt nhau, nên chỉ cần một cặp mồi duy III. KẾT QUẢ<br /> nhất để khuếch đại tất cả các probe.<br /> Quy trình: Sử dụng bộ kit MLPA P034 - A3 và P035 - A3 1. Kết quả xác định đột biến lặp đoạn gen bằng<br /> của MRC - Holland.Chuẩn bị mẫu DNA, đưa về nồng độ kỹ thuật MLPA<br /> 30ng/µl.Biến tính DNA; Cho vào ống 0,2ml; 2µl DNA + 30 bệnh nhân DMD/BMD đã được tiến hành xác<br /> 3 µl DW; Biến tính tại 98°C trong 5 phút, giữ ở 25°C. định đột biến lặp đoạn gen dystrophin, kết quả phát hiện<br /> Lai đầu dò: Thêm 1,5µl MLPA buffer + 1,5 µl ProbeMix 2/30 bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Kết quả phân tích đột biến lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân MS12 bằng kỹ thuật MLPA (mũi tên<br /> chỉ exon đột biến). A: Kết quả đột biến lặp đoạn exon 14 - 17. B: Tỉ lệ RPA của từng exon bệnh nhân MS 12<br /> so với mẫu chứng nam<br /> <br /> 20<br />  TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> Tỉ lệ RPA của exon 14 - 17 ≥ 1,5, trong khi đó tỷ lệ RPA của các exon còn lại tương ứng với 1, chứng tỏ bệnh nhân<br /> có đột biến lặp đoạn exon 14 - 17 gen dystrophin.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả phân tích đột biến lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân MS 21 bằng kỹ thuật MLPA<br /> ( t n h n t n)<br /> A: Kết quả đột biến lặp đoạn exon 5-7. B: Tỉ lệ RPA của từng exon bệnh nhân MS 21 so với mẫu chứng nam<br /> Tỷ lệ RPA của exon 5 - 7 ≥ 1,5, trong khi đó tỷ lệ RPA của các exon còn lại tương ứng với 1, chứng tỏ bệnh nhân<br /> có đột biến lặp đoạn exon 5 - 7 gen dystrophin.<br /> 2. Tỷ lệ đột biến lặp đoạn gen dystrophin<br /> <br /> Bảng 1. Tỷ lệ đột biến lặp đoạn gen dystrophin<br /> <br /> STT Bệnh nhân Đột biến n<br /> 1 Bệnh nhân 12 Lặp đoạn Exon 14-17 1<br /> 2 Bệnh nhân 21 Lặp đoạn Exon 5-7 1<br /> Bệnh nhân có đột biến lặp đoạn 2/30<br /> 3 Tổng Bệnh nhân không có đột biến lặp đoạn 28/30<br /> 30<br /> <br /> 2/30 bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin chiếm tỷ lệ khoảng 6,5%.<br /> <br /> <br /> IV. BÀN LUẬN trong quá trình co cơ, từ đó gây bệnh loạn dưỡng cơ<br /> Duchenne. Kỹ thuật MLPA là một kỹ thuật có độ chính<br /> Loạn dưỡng cơ Duchenne là một trong những bệnh xác cao được ứng dụng để phát hiện đột biến xóa đoạn<br /> lý di truyền cơ phổ biến nhất, các đột biến trên gen dys- và lặp đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân DMD/BMD.<br /> trophin đã được chứng minh in vitro làm mất hoặc giảm Tuy nhiên, kỹ thuật này giá thành cao hơn so với một số<br /> chức năng protein dystrophin - một protein quan trọng kỹ thuật thông thường khác. Để giảm giá thành, chúng<br /> <br /> 21<br /> TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> tôi đã lựa chọn bệnh nhân đã được xác định đột biến Lời cảm ơn<br /> xóa đoạn bằng kỹ thuật mPCR, kỹ thuật này rẻ hơn so<br /> với kỹ thuật MLPA, chỉ những bệnh nhân nào không Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ<br /> có đột biến xóa đoạn mới được chúng tôi lựa chọn để đề tài cấp nhà nước KC.04.08/11-15 “Nghiên cứu xây<br /> xác định đột biến lặp đoạn. Đột biến lặp đoạn trên gen dựng quy trình điều trị gen cho bệnh loạn dưỡng cơ<br /> dystrophin chiếm tỷ lệ từ 5 - 10% [3; 4; 6]. Tuy nhiên, Duchenne” thực hiện từ năm 2013 - 2015.<br /> đột biến lặp đoạn không xác định được bằng những kỹ<br /> thuật sinh học phân tử thông thường (PCR, giải trình tự TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> gen…). Nhóm nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật MLPA để<br /> giải quyết khó khăn này. Kỹ thuật MLPA là một kỹ thuật 1. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R et al (2002).<br /> sinh học phân tử mới, có độ nhạy và độ chính xác cao, Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by<br /> tiết kiệm thời gian, đặc biệt là trên một gen dài 79 exon multiplex ligation-dependent probe amplification. N -<br /> như gen dystrophin [1; 2; 3; 4; 5]. Kỹ thuật MLPA có độ 30 (12).<br /> tin cậy cao nhờ những mồi nội chuẩn được thiết kế sẵn 2. Murugan S, Chandramohan A, Lakshmi BR (2010).<br /> để kiểm tra chất lượng mẫu, có độ đặc hiệu cao nhờ Use of multiplex ligation-dependent probe amplification<br /> thiết kế đầu dò hai đầu hai trình tự đặc biệt, khuếch đại (MLPA) for Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene<br /> dựa vào phản ứng nối. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy mutation analysis. n n 132, 303 - 311.<br /> ưu điểm của phương pháp MLPA trong phân tích đột 3. Kent K.S. Lai, Ivan F.M. Lo et al, (2006).Detecting<br /> biến lặp đoạn nhanh chóng, chính xác, giúp ứng dụng exon deletions and duplications of the DMD gene us-<br /> trong chẩn đoán trước sinh bệnh DMD và các bệnh di ing Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification<br /> truyền, làm rút ngắn thời gian và công sức [8]. (MLPA). C n h tr 39, 367 – 72.<br /> Trong nghiên cứu này, 30 bệnh nhân được chẩn 4. Marzese D.M., Mampel A., Gomez L.C., (2008).<br /> đoán mắc bệnh DMD/BMD và đã được sàng lọc không Detection of deletions and duplications in the Duchenne<br /> mang đột biến xóa đoạn bằng kỹ thuật mPCR. 2/30 bệnh muscular dystrophy gene by the molecular method<br /> nhân (6,7%) được xác định mang đột biến lặp đoạn gen MLPA in the first Argentine affected families. n t<br /> dystrophin kết quả này, tương đồng với những nghiên n r r h 7, 223 - 233.<br /> cứu khác ở Việt Nam và trên thế giới [4; 5; 6]. Tuy cỡ 5. Mendell R.J., Griggs C.R. (1991). Muscular dystro-<br /> mẫu chưa được lớn, nhưng đây là nghiên cứu đầu tiên phin. H rr n r n nt rn n 12th edi-<br /> áp dụng kỹ thuật MLPA vào xác định đột biến lặp đoạn tion, 2112 - 2118.<br /> gen dystrophin ở Việt Nam. 6. Takeshima Y, Yagi M, Okizuka Y et al (2010). Muta-<br /> tion spectrum of the dystrophin gene in 442 Duchenne/<br /> V. KẾT LUẬN Becker muscular dystrophy cases from one Japanese<br /> referral center. H n t 55(6), 379 - 388.<br /> Sử dụng kỹ thuật MLPA, nghiên cứu đã xác định 7. Van Khanh Tran, Van Thanh Ta, Dung Chi Vu, et al<br /> được đột biến lặp đoạn gen dystrophin ở 2/30 bệnh (2013). Exon Deletion Patterns of the Dystrophin Gene<br /> nhân đã được chẩn đoán xác định là DMD/BMD. in 82 Vietnamese Duchenne/Becker Muscular Dystro-<br /> phy Patients. N r g n t 27(4), 170 - 175.<br /> 8. Minh-Hieu Ta, Thinh Huy Tran, Ngoc-Hai Do, et al<br /> (2013). Rapid method for targeted prenatal diagnosis<br /> of Duchenne muscular dystrophy in Vietnam.T n<br /> rn t tr n g 52, 534 - 539.<br /> <br /> Summary<br /> MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION FOR<br /> DETECTION OF DUPLICATION IN DYSTROPHIN GENE<br /> The multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) assay is the most powerful tool in screening for<br /> deletions and duplications in the dystrophin gene in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy (DMD/<br /> BMD). The purpose of this study is to detect duplication in dystrophin gene using MLPA technique. 30 unrelated male<br /> patients with DMD/BMD were selected for this study. These patients had already been screened by multiplex PCR<br /> <br /> 22<br />  TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014<br /> <br /> <br /> (mPCR). We detected two duplications that had been missed by mPCR, in one DMD patient showing a duplication<br /> from exon 5-7 and other one showing a duplication from exon 14-17. The results of our study confirmed MLPA to be<br /> the method of choice for detecting DMD duplication in DMD/BMD patients.<br /> <br /> Keywords: Duplication, dystrophin gene, MLPA<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 23<br />