Xác định hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 TRONG<br /> SÂM NGỌC LINH TỰ NHIÊN VÀ SINH KHỐI TẾ BÀO<br /> SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ<br /> LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Trần Quang Trung*; Phan Thị Thu Hằng*; Nguyễn Văn Bạch*<br /> TÓM TẮT<br /> Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) để định lượng 3 ginsenoside<br /> (Rb1, Re và Rg1) trong sâm Ngọc Linh và trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, kết quả cho thấy:<br /> + Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh lần lượt là: 1,0916%,<br /> 0,1226% và 1,4215%.<br /> + Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh lần<br /> lượt là: 0,3281%, 0,0817% và 0,3646%.<br /> Như vậy, tổng hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh gấp 3,4 lần<br /> tổng hàm lượng của 3 ginsenoside này trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh.<br /> * Từ khoá: Sâm Ngọc Linh; Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> DETERMINATION OF GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 IN<br /> NATURAL NGOCLINH GINSENG AND ITS PLANT CELL BY<br /> HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY<br /> SUMMARY<br /> Applying the method to quantifying ginsenoside Rb1, Re, Rg1 in natural Ngọclinh ginseng<br /> and its plant cell, the result showed that:<br /> - The quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 of natural Ngọclinh ginseng was 1.0916%<br /> 0.1226% and 1.4215%, respectively.<br /> - The quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 of Ngọclinh ginseng’s plant cell was<br /> 0.3281%, 0.0817% and 0.3646%, respectively.<br /> The data indicated that total quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 in 100 grams of<br /> natural Ngọclinh ginseng was 3.4 times as much as its total quantity in 100 grams of<br /> Ngọclinh ginseng’s plant cell.<br /> * Key words: Ngoclinh ginseng, High performance thin layer chromatography.<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Trần Quang Trung (tranquangtrunghvqy@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 26/12/2012; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/10/2013<br /> Ngày bài báo được đăng: 19/11/2013<br /> 25<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Sâm Ngọc Linh là dược liệu quý sinh<br /> trưởng ở núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh<br /> Quảng Nam và Kon Tum [2]. Ngoài ra,<br /> từ sâm Ngọc Linh tự nhiên, Học viện<br /> Quân y đã nghiên cứu, sản xuất thành<br /> công sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh.<br /> Ginsenoside Rb1, Re, Rg1 là 3 hoạt chất<br /> chính thuộc nhóm dammaran có trong<br /> sâm Ngọc Linh tự nhiên và trong sinh<br /> khối tế bào sâm Ngọc Linh. Để tiêu<br /> chuẩn hoá chất lượng của nguyên liệu và<br /> các thành phẩm từ sâm Ngọc Linh tự<br /> nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Vật liệu nghiên cứu<br /> * Nguyên liệu, dung môi, hoá chất:<br /> - Thân rễ (củ) sâm Ngọc Linh tự nhiên<br /> trên 10 năm tuổi (đã được Viện Dược<br /> liệu - Bộ Y tế thẩm định).<br /> - Sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh<br /> (do Trung tâm Nghiên cứu Y học quân sự,<br /> Học viện Quân y cung cấp).<br /> - Chất chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1<br /> loại SH (Hãng Chromadex, Mỹ).<br /> - Các dung môi, hoá chất: đạt tiêu<br /> chuẩn PA.<br /> <br /> Linh, việc xác định hàm lượng 3 hoạt<br /> <br /> * Dụng cụ và trang thiết bị:<br /> <br /> chất trên là việc làm rất cần thiết.<br /> <br /> - Hệ thống HPTLC của Hãng DESAGA.<br /> <br /> Hiện nay, một số dược điển đã ứng<br /> dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để<br /> <br /> - Bản mỏng HPTLC 10 x 10 cm; 20 x<br /> 10 cm; 20 x 20 cm.<br /> <br /> định lượng các chất trong phân tích định<br /> <br /> - Micropipet 2 l; pipet tự động 1 -<br /> <br /> lượng [3]. Tuy nhiên ở Việt Nam, chưa<br /> có đề tài nào áp dụng phương pháp<br /> HPTLC để xác định hàm lượng của<br /> ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm<br /> Ngọc Linh tự nhiên và sinh khối tế bào<br /> sâm Ngọc linh. Vì vậy, chúng tôi tiến<br /> hành nghiên cứu xác định hàm lượng<br /> ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm<br /> Ngọc Linh tự nhiên và trong sinh khối tế<br /> bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp<br /> HPTLC.<br /> <br /> 10 l, 1 - 20 l, 100 l, 200 l, 500 l.<br /> - Cột chiết pha rắn C18.<br /> - Máy lắc siêu âm Soniclean của<br /> Australia.<br /> - Máy ly tâm.<br /> - Cân phân tích Mettler có độ chính<br /> xác 0,1 mg.<br /> - Dụng cụ chiết Soxhlet.<br /> - Các loại dụng cụ thuỷ tinh có độ<br /> chính xác thích hợp.<br /> 26<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Xây dựng đường chuẩn các gensenosid<br /> Rb1, Re, Rg1:<br /> Từ các chất chuẩn, pha dãy dung dịch<br /> Rb1, Re, Rg1 có nồng độ khoảng 50, 150,<br /> 250, 350 và 450 mcg/ml. Tiến hành HPTLC<br /> theo điều kiện của Trần Quang Trung và<br /> CS đã xây dựng [4].<br /> * Chiết xuất saponin toàn phần trong<br /> mẫu thử:<br /> Cân chính xác 1 gam bột sâm Ngọc<br /> Linh (hoặc sinh khối tế bào sâm Ngọc<br /> Linh) cho vào bình nón dung tích 100<br /> ml, gắn được với bộ phận hồi lưu. Thêm<br /> chính xác 50 ml methanol. Cân khối<br /> lượng của bình nón đã chứa mẫu (bao<br /> gồm cả nắp) được khối lượng m1. Đun<br /> hồi lưu cách thủy trong 1 giờ (tính từ lúc<br /> sôi). Để nguội bình nón và cân lại khối<br /> lượng bình nón (gồm cả nắp) được khối<br /> lượng m2. Nếu m2 < m1, thêm methanol<br /> vào bình nón sau khi đun hồi lưu cho<br /> đến khi đạt đến khối lượng m1 ban đầu.<br /> Ly tâm với tốc độ 2.500 vòng/phút trong<br /> 10 phút.<br /> Hút chính xác 25 ml dịch trong sau<br /> khi ly tâm. Cô khô trên cách thủy. Hoà<br /> tan cắn trong 5 ml nước cất. Sau đó, ứng<br /> dụng phương pháp chiết pha rắn để xử<br /> lý mẫu [1]. Cụ thể: cho dịch qua cột<br /> chiết pha rắn (C18, 360 mg) đã được hoạt<br /> hoá lần lượt bằng 5 ml methanol, 5 ml<br /> methanol 50%, 5 ml H2O cất. Rửa cột đã<br /> chứa mẫu lần lượt với 20 ml nước, 10 ml<br /> <br /> methanol 30% với tốc độ 20 - 25 giọt/phút.<br /> Bỏ các dịch rửa. Rửa giải bằng 40 ml<br /> methanol. Lấy dịch rửa giải cô tới khô<br /> trên cách thuỷ. Hoà tan cắn trong 10 ml<br /> ethanol đem đi chấm sắc ký.<br /> * Phương pháp xử lý mẫu:<br /> - Mẫu thử:<br /> + Thân rễ (củ) sâm Ngọc Linh tự nhiên<br /> rửa sạch, thái lát mỏng hoặc sinh khối<br /> tế bào sâm Ngọc Linh, sấy khô ở 600C<br /> trong 20 giờ. Nghiền thành bột.<br /> + Cân chính xác 1 gam bột, chiết theo<br /> quy trình thu được dịch ethanol chấm<br /> sắc ký.<br /> - Dung dịch chuẩn hỗn hợp:<br /> + Chuẩn hỗn hợp 1: pha dung dịch<br /> có ginsenoside Rb1 nồng độ 51,1875<br /> mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ<br /> 20,0625 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng<br /> độ 51,475 mcg/ml.<br /> + Chuẩn hỗn hợp 2: pha dung dịch có<br /> ginsenoside Rb1 nồng độ 150,9375 mcg/ml;<br /> ginsenoside Re nồng độ 40,125 mcg/ml;<br /> ginsenoside Rg1 nồng độ 200,575 mcg/ml.<br /> + Chuẩn hỗn hợp 3: pha dung dịch<br /> ginsenoside Rb 1 nồng độ 250,6875<br /> mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ<br /> 60,1875 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng<br /> độ 351,45 mcg/ml.<br /> + Chuẩn hỗn hợp 4: pha dung dịch<br /> ginsenoside Rb1 nồng độ 350,4375 mcg/ml;<br /> ginsenoside Re nồng độ 80,25 mcg/ml;<br /> ginsenoside Rg1 nồng độ 500,55 mcg/ml.<br /> 27<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> + Chuẩn hỗn hợp 5: pha dung dịch<br /> ginsenoside Rb 1 nồng độ 450,1875<br /> mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ<br /> 100,3125 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng<br /> độ 651,425 mcg/ml.<br /> * Định lượng các mẫu thử sâm Ngọc<br /> Linh tự nhiên và các mẫu thử sinh khối<br /> tế bào sâm Ngọc Linh:<br /> - Dung dịch thử: dịch chiết saponin toàn<br /> phần các mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên<br /> và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh.<br /> Dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn<br /> hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong ethanol.<br /> Chấm lần lượt 20 l mỗi dung dịch thử<br /> và dung dịch chuẩn hỗn hợp lên bản mỏng<br /> HPTLC và tiến hành sắc ký với các điều<br /> kiện sau:<br /> - Máy HPTLC (Hãng DESAGA).<br /> - Pha động: chloroform/AcOEt/MeOH/<br /> H2O (15/40/22/10).<br /> <br /> - Bản mỏng HPTLC 20 x 10 cm hoạt<br /> hóa ở 1000C trong 30 phút.<br /> - Thuốc thử hiện màu: dung dịch H2SO4<br /> 10% trong ethanol.<br /> Tiến hành định lượng bằng cách dựa<br /> vào đường chuẩn. Diện tích pic mẫu thử<br /> và mẫu chuẩn thực hiện trong cùng một<br /> điều kiện sắc ký. Từ đó, tính hàm lượng<br /> (%) ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong mẫu<br /> sâm Ngọc linh tự nhiên và mẫu sinh khối<br /> tế bào sâm Ngọc Linh theo công thức sau:<br /> <br /> Trong đó:<br /> Ct: nồng độ (mcg/ml) của ginsenoside<br /> Rb1 (hoặc Re, Rg1) tương ứng với diện<br /> tích pic thu được từ phổ đồ thông qua<br /> đường chuẩn.<br /> m: khối lượng (g) của sâm Ngọc Linh tự<br /> nhiên hoặc sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh.<br /> k: hệ số pha loãng dung dịch thử.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Rb1, Re, Rg1.<br /> <br /> Nồng độ (mcg/ml)<br /> <br /> Hình 1: Đường chuẩn ginsenoside Rb1<br /> 28<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> Nồng độ (mcg/ml)<br /> <br /> Hình 2: Đường chuẩn ginsenoside Re.<br /> <br /> Nồng độ (mcg/ml)<br /> <br /> Hình 3: Đường chuẩn ginsenoside Rg1.<br /> <br /> Trong khoảng nồng độ khảo sát<br /> (50 - 450 mcg/ml) có sự tương quan<br /> tuyến tính giữa nồng độ nồng độ các<br /> ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với diện tích<br /> pic và r  1. Các đường chuẩn này có<br /> thể sử dụng để định lượng 3 ginsenoside<br /> Rb1, Re, Rg1 trong mẫu sâm Ngọc Linh<br /> tự nhiên và sinh khối tế bào sâm<br /> Ngọc Linh.<br /> <br /> 2. Kết quả xác định Rb1, Re, Rg1<br /> trong mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên<br /> và mẫu thử sinh khối tế bào sâm Ngọc<br /> Linh bằng phƣơng pháp HPTLC.<br /> * Tạo mẫu thử:<br /> - Mẫu thử 1: cân chính xác 1 gam bột<br /> sâm Ngọc Linh tự nhiên, chiết xuất theo<br /> quy trình trên, thu được dịch ethanol<br /> saponin toàn phần sâm Ngọc Linh tự<br /> nhiên chấm sắc ký.<br /> 29<br /> <br />