Xác định hàm lượng lycopen trong một số dược liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> <br /> XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYCOPEN TRONG MỘT SỐ<br /> DƢỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Nguyễn Văn Thịnh*; Vũ Tuấn Anh*; Đặng Trường Giang*<br /> TrÇn ThÞ Oanh**; Chử Đức Thành*<br /> TÓM TẮT<br /> Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector PDA được nghiên cứu thẩm định để<br /> định lượng lycopen trong một số dược liệu. Phương pháp phân tích sử dụng cột Phenomenex Develosil<br /> C30 (10 mm x 250 mm), 5 µm với pha động, bao gồm methyl-tert butyl ether (MtBE), ethyl acetate,<br /> methanol (45:45:10, % v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Giới hạn định lượng được xác định từ 1 - 100<br /> mg/ml. Các giá trị độ lệch chuẩn tương đối của quy trình phân tích nhỏ hơn 4,5%. Sử dụng phương<br /> pháp để định lượng lycopen trong gấc và cà chua đã sấy khô cho kết quả lần lượt là 0,271% và<br /> 0,072%.<br /> * Từ khóa: Lycopen; Màng gấc; Cà chua; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF LYCOPENE<br /> IN SOME PLANT MATERIALS<br /> SUMmARY<br /> A simple and sensitive isocratic method of HPLC with photodiode array detector was developed<br /> and validated for determination of lycopene in some plant materials. The method utilizes Phenomenex<br /> Develosil C30 column (10 mm x 250 mm), 5 µm particle size and a mobile phase consisting of<br /> methyl-tert butyl ether (MtBE), ethyl acetate, methanol (45:45:10, % v/v) at a flow rate of 1.0 ml/min.<br /> The method was validated for the concentration range 1 - 100 mg/ml. Relative standard deviations<br /> were less than 4.5%. The contents of lycopene in the dried aril of Momordica cochinchinesis and dried<br /> tomato determined by the validated method were about 0.271% and 0.072% respectively.<br /> * Key words: Lycopene; Gac aril; Tomato; HPLC.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trên thế giới, lycopen được ứng dụng<br /> rộng rãi trong công nghiệp sản xuất dược<br /> phẩm và mỹ phẩm. Hàm lượng lycopen<br /> được biết cao nhất trong màng gấc và cà<br /> chua. Hiện nay, ở Việt Nam có những khu<br /> vực trồng gấc với quy mô lớn để xuất khẩu<br /> và phục vụ cho việc sản xuất trong nước<br /> các sản phẩm chứa lycopen và carotenoid<br /> khác. Vì vậy, việc xây dựng một phương<br /> <br /> pháp phân tích đơn giản và có khả năng<br /> xác định hàm lượng lycopen trong dược<br /> liệu có chứa các carotenoid khác rất cần<br /> cho việc kiểm soát chất lượng sản phẩm và<br /> nguyên liệu chứa lycopen. Trong bài báo<br /> này, chúng tôi trình bày một phương pháp<br /> phân tích lycopen đơn giản đã được thẩm<br /> định và kết quả định lượng lycopen trong<br /> một số dược liệu bằng HPLC.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bộ Y tế<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thịnh<br /> thinhnv@hotmail.com<br /> <br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> * Nguyên liệu:<br /> Màng gấc mua từ Công ty Cổ phần Nông<br /> nghiệp Đông Phương, bảo quản ở -20oC trước<br /> khi sử dụng. Cà chua mua tại khu vực Sơn<br /> Tây, Thành phố Hà Nội. Chuẩn lycopen mua<br /> từ hãng Sigma-Aldrich. Các hóa chất dung<br /> môi tinh khiết khác đạt tiêu chuẩn dùng cho<br /> HPLC.<br /> * Thiết bị:<br /> Hệ thống HPLC Alliance Water 2695D:<br /> 4 kênh dung môi, autosampler, buồng gia<br /> nhiệt cột, Detector PDA, Cột Phenomenex<br /> Develosil C30, 5 µm, 10 mm x 250 mm.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Xây dựng quy trình phân tích lycopen trong<br /> một số dược liệu như màng gấc và cà chua<br /> sấy khô.<br /> Tiến hành thẩm định phương pháp trên<br /> các mẫu dược liệu về độ đặc hiệu, tính thích<br /> hợp của hệ thống, khoảng tuyến tính, độ<br /> lặp lại, độ đúng.<br /> Áp dụng phương pháp đã xây dựng để<br /> xác định hàm lượng lycopen có trong hai<br /> dược liệu trên.<br /> <br /> Qua khảo sát chúng tôi xác định được<br /> quy trình xử lý mẫu để định lượng lycopen<br /> trong màng gấc như sau: cân chính xác 1 g<br /> bột màng gấc khô (đã xác định hàm Èm),<br /> thêm 50 ml chloroform, chiết siêu âm trong<br /> 2 giờ, lọc lấy dịch chloroform. Tiến hành<br /> quá trình chiết như vậy thêm một lần nữa.<br /> Gộp dịch chiết chloroform. Lọc qua màng<br /> lọc kích thước 0,45 µm, thu được dung dịch<br /> thử để định lượng lycopen trong màng gấc.<br /> Mẫu thử cà chua được chuẩn bị như<br /> sau: xay 1 kg cà chua tươi với cồn tuyệt đối<br /> (1:4, m/m) được thêm 0,1% BHA. Lọc lấy<br /> phần bã cà chua qua phễu lọc, sau đó làm<br /> khô phần bã cà chua dưới áp suất giảm.<br /> Lấy 10 g cà chua khô chiết siêu âm với 50 ml<br /> chloroform trong 2 giờ. Lọc lấy dịch chiết và<br /> lặp lại quá trình chiết như vậy thêm một lần<br /> nữa. Gộp dịch chiết, lọc qua màng lọc kích<br /> thước 0,45 µm và đem phân tích sắc ký.<br /> 2. Chọn điều kiện sắc ký và thẩm định<br /> phƣơng pháp.<br /> Trên cơ sở tham khảo các tài liệu, chọn<br /> những điều kiện sắc ký tương đối phù hợp<br /> như sau:<br /> Cột sắc ký Phenomenex Develosil C30,<br /> 5 µm, 10 mm x 250 mm.<br /> Detector PDA, λ = 470 nm.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử.<br /> * Dung dịch chuẩn:<br /> Hòa tan hoàn toàn 1,0 mg lycopen chuẩn<br /> vào 5 ml chloroform trong bình định mức<br /> 10 ml. Thêm chloroform vừa đủ đến vạch,<br /> lắc đều. Tiến hành pha loãng bằng chloroform<br /> để thu được những nồng độ khác nhau. Lắc<br /> đều và lọc qua màng lọc 0,45 µm, được dung<br /> dịch chuẩn để phân tích sắc ký.<br /> * Chuẩn bị mẫu thử từ dược liệu:<br /> <br /> 8<br /> <br /> Pha động: methyl-tert butyl ether (MtBE):<br /> ethyl acetate:methanol (45:45:10, v/v/v).<br /> Tốc độ dòng: 1 ml/phút.<br /> Thể tích tiêm: 10 µl.<br /> Tiến hành thẩm định phương pháp định<br /> lượng lycopen với những nội dung sau:<br /> khoảng tuyến tính, xác định giới hạn định<br /> lượng dưới (LLOQ), độ lặp lại và độ đúng.<br /> * Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng<br /> đường chuẩn:<br /> Pha dung dịch lycopen chuẩn có nồng<br /> độ trong khoảng 1 - 100 mg/ml. Tiến hành<br /> sắc ký như điều kiện đã chọn.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> Bảng 1: Khảo sát độ lặp lại khi định lượng<br /> lycopen trong màng gấc khô.<br /> NỒNG ĐỘ<br /> (àg/ml)<br /> <br /> ĐỘ HẤP THỤ<br /> (mAU.s)<br /> <br /> ĐỘ ĐÚNG<br /> (%)<br /> <br /> 100<br /> <br /> 15359795<br /> <br /> 104,5<br /> <br /> 50<br /> <br /> 7448965<br /> <br /> 101,6<br /> <br /> 20<br /> <br /> 2880797<br /> <br /> 98,8<br /> <br /> 10<br /> <br /> 1409123<br /> <br /> 97,7<br /> <br /> 5<br /> <br /> 697482<br /> <br /> 98,6<br /> <br /> 2<br /> <br /> 255347<br /> <br /> 96,4<br /> <br /> 1<br /> <br /> 122029<br /> <br /> 102,3<br /> <br /> Kết quả khảo sát cho thấy diện tích píc (S)<br /> và nồng độ (C) tương quan chặt chẽ với hệ số<br /> tương quan R là 0,9998. Phương trình đường<br /> chuẩn được xây dựng là: S = 147187, 6C 28502.<br /> * Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ):<br /> <br /> * Định tính lycopen trong màng gấc và<br /> kiểm tra sự phù hợp:<br /> Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn (nồng<br /> độ 10 µg/ml) và các dung dịch thử theo điều<br /> kiện sắc ký đã chọn.<br /> Kết quả cho thấy các dung dịch thử đều<br /> cho píc có thời gian lưu ứng với lycopen<br /> (ở khoảng 21 phút) và tách riêng khỏi các<br /> píc khác nhau trong sắc ký đồ.<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ dung dịch lycopen chuẩn<br /> 10 µg/ml.<br /> <br /> Giới hạn định lượng dưới của phương<br /> pháp phân tích là nồng độ nhỏ nhất của<br /> chất phân tích trong mẫu có thể được định<br /> lượng với độ đúng và độ chính xác theo<br /> yêu cầu. Đáp ứng chất phân tích tại nồng<br /> độ giới hạn định lượng dưới phải không nhỏ<br /> hơn 5 lần đáp ứng tại cùng thời gian lưu ở<br /> mẫu trắng. Xác định LLOQ trong phương<br /> pháp định lượng là 0,1 µg/ml.<br /> Hình 3: Sắc ký đồ dịch chiết màng gấc.<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn<br /> tương ứng với LLOQ.<br /> <br /> Hình 4: Sắc ký đồ dịch chiết cà chua sấy khô.<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> Độ đúng của phương pháp được xác định<br /> bằng cách thêm chuẩn vào mẫu thử sao<br /> cho nồng độ của lycopen vẫn nằm trong<br /> khoảng tuyến tính đã khảo sát. Sau đó, xử<br /> lý các mẫu thử theo quy trình đã xây dựng.<br /> Tiến hành sắc ký và tính toán kết quả.<br /> Bảng 3: Kiểm tra độ đúng phương pháp<br /> định lượng lycopen trong màng gấc.<br /> <br /> 471.4<br /> <br /> 0.035<br /> <br /> 503.0<br /> 0.030<br /> <br /> 0.025<br /> <br /> 444.8<br /> <br /> AU<br /> <br /> 0.020<br /> <br /> 0.015<br /> <br /> 0.010<br /> <br /> 0.005<br /> <br /> 359.8<br /> <br /> MẪU<br /> <br /> KHỐI LƯỢNG<br /> DƯỢC LIỆU (g)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,1984<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 93,23<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0,2092<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 96,48<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,2075<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 96,71<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,2112<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 94,02<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0,2018<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 93,98<br /> <br /> 6<br /> <br /> 0,2105<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 93,67<br /> <br /> 0.000<br /> 340.00<br /> <br /> 360.00<br /> <br /> 380.00<br /> <br /> 400.00<br /> <br /> 420.00<br /> <br /> 440.00<br /> <br /> 460.00<br /> <br /> 480.00<br /> <br /> 500.00<br /> <br /> 520.00<br /> <br /> LƯỢNG<br /> TỶ LỆ<br /> CHUẨN THÊM TÌM LẠI (%)<br /> (mg)<br /> <br /> 540.00<br /> <br /> nm<br /> <br /> Hình 5: Phổ hấp thụ của lycopen xác định<br /> bằng detector PDA<br /> * Độ lặp lại:<br /> Xác định độ lặp lại trên 6 mẫu thử chuẩn<br /> bị theo quy trình xử lý mẫu. Tiến hành sắc<br /> ký theo điều kiện đã chọn, sau đó tính hàm<br /> lượng lycopen có trong dược liệu.<br /> Bảng 2: Khảo sát độ lặp lại khi định lượng<br /> lycopen trong màng gấc khô.<br /> MẪU<br /> <br /> KHỐI LƯỢNG<br /> MÀNG GẤC (g)<br /> <br /> LƯỢNG<br /> LYCOPENE<br /> TÌM THẤY (mg)<br /> <br /> HÀM<br /> LƯỢNG<br /> (%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,0022<br /> <br /> 2,71<br /> <br /> 0,270<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0,9982<br /> <br /> 2,73<br /> <br /> 0,273<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,9989<br /> <br /> 2,77<br /> <br /> 0,277<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,9946<br /> <br /> 2,68<br /> <br /> 0,269<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,0061<br /> <br /> 2,73<br /> <br /> 0,271<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,0007<br /> <br /> 2,66<br /> <br /> 0,266<br /> <br /> 94,68<br /> <br /> Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng<br /> tương đối tốt trong khoảng khảo sát với khả<br /> năng tìm lại trung bình đạt được là 94,68%<br /> (93,23 - 96,71%).<br /> 3. Định lƣợng lycopen trong màng gấc<br /> và cà chua sấy khô.<br /> Bảng 4: Kết quả định lượng lycopen trong<br /> cà chua sấy khô.<br /> MẪU<br /> <br /> KHỐI LƯỢNG<br /> DƯỢC LIỆU<br /> <br /> LƯỢNG<br /> LYCOPENE<br /> TÌM THẤY (mg)<br /> <br /> HÀM<br /> LƯỢNG<br /> (%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 10,0122<br /> <br /> 7,61<br /> <br /> 0,076<br /> <br /> 2<br /> <br /> 10,1021<br /> <br /> 7,17<br /> <br /> 0,071<br /> <br /> Hàm lượng trung bình (%)<br /> <br /> 0,271<br /> <br /> 3<br /> <br /> 10,0823<br /> <br /> 7,26<br /> <br /> 0,072<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 1,4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 10,0642<br /> <br /> 7,04<br /> <br /> 0,070<br /> <br /> 5<br /> <br /> 10,0072<br /> <br /> 6,90<br /> <br /> 0,069<br /> <br /> 6<br /> <br /> 10,0724<br /> <br /> 7,76<br /> <br /> 0,077<br /> <br /> Kết quả thử độ lặp lại của phương pháp<br /> cho thấy trong các điều kiện sắc ký đã<br /> chọn, độ lệch chuẩn tương đối thu được là<br /> 1,4%. Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu<br /> về độ lặp lại của quy trình phân tích mẫu.<br /> * Độ đúng:<br /> <br /> 10<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> Hàm lượng trung bình (%)<br /> <br /> 0,072<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 4,5<br /> <br /> Chuẩn bị 6 dung dịch thử cho mỗi mẫu<br /> thử theo quy trình xử lý mẫu. Tiến hành sắc<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> ký như điều kiện đã chọn và ghi kết quả<br /> diện tích píc tương ứng với mỗi mẫu thử.<br /> Tính kết quả và suy ra nồng độ của lycopen<br /> trong mẫu thử đem ra định lượng.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Betty K. Ishida et al. A simple, rapid<br /> method for HPLC analysis of lycopene isomers.<br /> Phytochemical Analysis. 2001, pp.194-198.<br /> <br /> Kết quả định lượng cho thấy lycopen có<br /> trong màng gấc khô với hàm lượng khoảng<br /> 0,271%, còn trong cà chua sấy khô, hàm<br /> lượng này 0,072%.<br /> <br /> 2. Betty K. Ishida et al. Fatty acid and carotenoid<br /> composition of Gac (Momordica cochinchinensis<br /> Spreng) fruit. Journal of Agricultural and Food<br /> Chemistry. 2004, pp.274-279.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> 3. Hiromitsu AOKI et al. Carotenoid pigments<br /> in GAC fruit (Momordica cochinchinensis<br /> SPRENG). Bioscience, Biotechnology, and<br /> Biochemistry. 2002, pp.2479-2482.<br /> <br /> Phương pháp HPLC xây dựng được có<br /> thể áp dụng để định lượng lycopen trong một<br /> số dược liệu với cách xử lý mẫu thích hợp.<br /> Ứng dụng phương pháp đã xác định được<br /> hàm lượng lycopen trong màng gấc khô và<br /> cà chua sấy khô đã khảo sát tương ứng là<br /> 0,271% và 0,072%.<br /> <br /> 4. Le Thuy Vuong et al. Momordica cochinchinensis<br /> Spreng (Gac) fruit carotenoids reevaluated.<br /> Journal of Food Composition and Analysis.<br /> 2006, pp.664-668.<br /> 6. Lan Cao-Hoang et al. Stability of carotenoid<br /> extracts of Gac (Momordica cochinchinensis)<br /> towards cooxidation - Protective effect of lycopene<br /> on β-carotene. Food Research International. 2011,<br /> pp.2252-2257.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 3/4/2013<br /> Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/5/2013<br /> Ngày bài báo được đăng: 23/5/2013<br /> <br /> 11<br /> <br />