Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC

Chia sẻ: Giang Duong Y Khoa | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

178
lượt xem 37
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đặt vấn đề: Để có thể tiên đóan được hiệu quả điều trị đặc hiệu và quyết định được thời gian điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân viêm gan mạn tính do nhiễm HCV, các nhà điều trị cần phải có thông tin về kiểu gen của HCV trên bệnh nhân. Trước đây, xét nghiệm xác định kiểu gen HCV phải được gửi sang Singapore để thực hiện với giá thành khá cao: trên 180USD/mẫu thử.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC

Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự tr ực ti ếp s ản ph ẩm PCR thu nh ận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hi ệu vùng 5’ NC Phạm Hùng Vân*(1), Bành Vũ Điền(2), Võ Đức Xuyên An(3), Nguyễn Thị Minh Thư(3), Lê Thị Phi Yến(3), Đỗ Thị Thanh Thủy(1), Hòang Hiếu Ngọc(1) Tóm tắt Đặt vấn đề: Để có thể tiên đóan được hiệu quả điều trị đặc hiệu và quyết định được thời gian điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân viêm gan mạn tính do nhiễm HCV, các nhà điều trị cần phải có thông tin về kiểu gen của HCV trên bệnh nhân. Trước đây, xét nghiệm xác định kiểu gen HCV phải được gửi sang Singapore để thực hiện với giá thành khá cao: trên 180USD/mẫu thử. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của thử ngiệm RT real-time PCR sử dụng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC của virus để định genotype HCV. Phương pháp nghiên cứu: Từ đầu năm 2006, các tác giả đã xây dựng được phương pháp xác định kiểu gen c ủa HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận t ừ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC của HCV rồi sau đó so sánh với các trình tự c ủa trong một th ư vi ện các ki ểu gen HCV để xác định được kiểu gene của HCV. Kết quả nghiên cứu: Từ tháng cuối 5/2006 đến cuối tháng 9/2006, các tác giả đã áp dụng phương pháp này để xác định kiểu gen HCV cho 234 trường hợp co kết quả thử nghiệm RT real-time PCR dương tính HCV-RNA, kết quả ghi nhận được cho thấy có đến 55% các mẫu là thuộc genotype 1b, 20% thuộc genotype 6a, 9% genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, và
đang nhiễm[1]. Hiện nay, trên thế giới có 2 pha từ mẫu HCV cDNA chuẩn được cung cấp phương pháp xác định genotype viêm gan C dựa từ Khoa Sinh, trường Royal Holloway, Đại Học vào phân tích một vùng đặc trưng trên vùng Luân Đôn) với chu kỳ ngưỡng và sử dụng đường 5’NC của bộ gen HCV đã được nhiều nhà nghiên biểu diễn này để tính được nồng độ ban đầu cứu cũng như lâm sàng chấp nhận và được thực của HCV cDNA có trong mẫu thử. Các mẫu sản hiện tại các phòng thí nghiệm lâm sàng, đó là phẩm real-time PCR cho kết quả real-time PCR phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu genotype [+] được làm tinh sạch để thu nhận sản phẩm C (HCV-InoLIPA)[2] và phương pháp giải trình tự PCR với bộ thử nghiệm tinh sạch sản phẩm trên máy Trugene[3]. Tuy nhiên vì hai phương PCR (PCR clean-up kit) do Promega sản xuất pháp này có giá thành khá cao nên khó có thể (Cat. #A9281). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được chỉ định rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệ lưu được điện di và định lượng nồng độ DNA bằng hành HCV là khá cao trên thế giới (5-8% người máy Gentquant của Pharmacia. Sau đó, thực hiện bình thường có nhiễm HCV)[4,5] và dĩ nhiên đi phản ứng giải trình tự sản phẩm PCR đã tinh kèm theo đó là số lượng bệnh nhân bị viêm gan sạch và xác định nồng độ ở trên với PCR mạn tính cần phải được điều trị và theo dõi điều sequencing mix của Becman (DTCS: Dye trị khá cao do nhiễm HCV có thể dẫn đến một tỷ Terminator Cycle Sequencing) với primer một lệ khá cao bị xơ gan và ung thư gan (4%) [6]. Để chiều đặc hiệu tương thích do phòng R&D của có thể giúp các nhà lâm sàng có thể cho chỉ định công ty Nam Khoa thiết kế. Sản phẩm giải trình xác định genotype HCV dễ dàng hơn, việc tìm tự được làm tủa và tinh sạch bằng phương pháp kiếm một kỹ thuật xác định genotype HCV mà tủa với ethanol. Cuối cùng thực hiện giải trình không phải sử dụng kỹ thuật giải trình tự của tự trên máy sequencer CEQ8000 của Becman Trugene và kỹ thuật InoLIPA với giá thành thấp Coulter. Kết quả giải trình tự được phân tích hơn mà vẫn đạt độ chính xác và nhạy cảm cao là trên phần mềm phân tích giải trình tự của một việc làm rất cần thiết và đây cũng mục tiêu CEQ8000. Cuối cùng, đăng nhập trình tự giải chính của đề tài nghiên cứu này của chúng tôi. được lên NCBI blast qua internet để so sánh với gene bank và lên local blast của phân mềm miễn Vật liệu và phương pháp nghiên cứu phí bio-edit để so sánh với thư viện HCV genotype mà chúng tôi tự tạo để có được kết Các mẫu huyết thanh được đưa vào nghiên cứu quả genotype. là các mẫu đã xác định và định lượng được HCV-RNA bằng kỹ thuật real-time PCR thực Kết quả hiện tại phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa với kết quả [+]. Các mẫu này được Trong thời gian từ 24/05/06 đến 30/09/06, có nhiều phòng thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh gửi tất cả 234 mẫu huyết thanh dương tính HCV- đến phòng thí nghiệm R&D của công ty với yêu RNA qua xét nghiệm RT realtime PCR dùng mồi cầu phát hiện và định lượng HCV-RNA. Để và taqman probe đặc hiệu 5’NC được thực hiện phát hiện và định lượng được HCV-RNA, phòng với qui trình trên. Tất cả 234 mẫu HCV-RNA thí nghiệm sử dụng bộ thử nghiệm RT TQ real- dương tính này cũng đã được chúng tôi đồng thời xác định genotype của HCV. Kết quả định lượng time PCR (reverse transcriptase real-time PCR dùng taqman probe) do công ty Nam Khoa sản tương ứng với kết quả xác định genotype được xuất. Bộ thử nghiệm này bao gồm một bộ trình bày trong bảng 1. Phân tích các kết quả RNAPREP để trích biệt RNA từ các mẫu huyết trình bày trong bảng 1 chúng ta thấy 100% các thanh theo phương pháp Chomzynski và Sacchi mẫu cho kết quả phát hiện và định lượng dương (số đăng kí chất lượng: 03200/2001/CBTC- tính HCV-RNA đều cho được kết quả định được TĐC), bộ cDNA synthesis hai bước để tổng hợp genotype HCV dù kết quả định lượng có thấp cDNA từ RNA với mồi ngẫu nhiên, và bộ TQ đến mức tối thiểu (là 445copies/ml huyết thanh real-time PCR mix để phát hiện và định lượng trong nghiên cứu này). Kết quả này cho phép HCV cDNA bằng phương pháp real-time PCR nhận định là phương pháp định genotype HCV dùng taqman probe và mồi đặc hiệu một đọan bằng giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của đích 240-245bp nằm ở vùng 5’NC của bộ gen phản ứng real-time PCR dùng taqman probe mà HCV (số đăng kí chất lượng: 03201/2001/CBTC- chúng tôi xây dựng đạt được độ nhạy cao tương TĐC). Thử nghiệm real-time PCR được thực đương phương pháp RT TQ real-time PCR mà hiện trên máy IQ5 của Biorad. Phương pháp định công ty Nam Khoa đã phát triển và hiện đang lượng theo hướng dẫn của bộ thử nghiệm. Có được sử dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí thể tóm tắt như sau: là trước hết xây dựng nghiệm lâm sàng có trang bị real-time PCR. đường chuẩn về mối liên hệ tuyến tính giữa các Trong phương pháp RT TQ real-time PCR này, nồng độ ban đầu của HCV cDNA chuẩn (được nồng độ HCV RNA ban đầu có trong mẫu thử 2
Bảng 1: Kết quả định genotype so với kết quả định lượng Kết quả định lượng Số Genotype(số mẫu) mẫu copies/ml 1* 100 – 999 1b(1) 1.000 – 9.999 14 1a(1), 1b(10), 2a(1), 2a/2c(1), 6a(1) 10.000 – 99.999 57 1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1), 6a(11) 100.000 – 999.999 123 1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1), 2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30) 1.000.000 – 9.999.999 37 1a(1), 1b(27), 2(5), 6a(4) ** 10.000.000 – 99.999.999 2 1(1), 1b(1) Tổng cộng 234 1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2), 2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2), 2a/2c(2), 6a(46) (A) mẫu có kết quả định lượng thấp nhất là 445copies/ml huyết thanh. **mẫu cao nhất có kết quả định lượng là 13.792.596 copies/ml. * được định lượng nhờ qui chiếu chu kỳ ngưỡng của các mẫu thử lên trên đường biểu diễn chuẩn. Biểu đồ 1 trình bày tỷ lệ phần trăm các genotype HCV của 234 mẫu huyết thanh thử nghiệm. Kết quả cho thấy có đến 55% các mẫu (B) Biểu đồ 2: (A) trình bày đường biểu diễn khuếch đại và chu kỳ ngưỡng (Ct) của các nồng độ ban đầu của các HCV cDNA chuẩn. (B) trình bày đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa Ct với nồng độ ban đầu của HCV cDNA Biểu đồ 1: Biểu đồ cho thấy các tỷ lệ % các genotype HCV trong 234 mẫu huyết thanh thử nghiệm là thuộc genotype 1b, 20% thuộc genotype 6a, 9% genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, và
Trong kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, kết quả chỉ có thể tốt khi có sản phẩm PCR thuần nhất, không bị các sản phẩm phụ. Hình 1 minh họa các kết quả điện di của sản phẩm PCR sau khi tinh sạch rất là rõ nét, dù nồng độ HCV trong một số mẫu là khá thấp. Điều này chứng tỏ qui trình RT real-time PCR mà chúng tôi xây dựng trên nền tảng dùng bộ thử nghiệm RT TQ real-time PCR phát hiện và định lượng HCV-RNA do chúng tôi sản xuất là tối ưu và hòan chỉnh. Tất cả các mẫu mà chúng tôi giải trình tự được đều được phân tích trên phần mềm phân tích giải trình tự của CEQ8000. Đa số các trường hợp các trình tự giải được có Bảng 2: Trình bày Ct của 13 mẫu và nồng dộ HCV-RNA ban đầu có trong các mẫu. Nồng độ này được tính tóan dựa trên các thông số slope và Int của đường biểu diễn chuẩn ở trên Type Ident. Ct Type Ident. Ct Nồng độ HCV-RNA Nồng độ HCV-RNA (copies/ml) (copies/ml) Unkn 4492 25.38 409,173 Unkn 4483 30.75 13,027 Unkn 4488 N/A Unkn 4482 N/A Unkn 4487 31.82 6,554 Unkn 4490 27.61 97,773 Unkn 4486 30.2 18,542 Unkn 4480 N/A Unkn 4485 N/A Unkn 4494 30.79 12,696 Unkn 4484 26.95 149,353 Unkn 4491 29.91 22,336 Unkn 4493 27.18 128,853 chiều dài phù hợp với chiều dài mà chúng tôi dự đóan, là từ 190bp đến
với PCR mix cực kỳ nhạy cảm chỉ cần dùng trên thư viện này. Đây chính là một bất tiện mồi vòng trong của HCV-InoLIPA và có đặc biệt cho các nhà nghiên cứu khi muốn thêm khả năng chống được ngọai nhiễm sản nghiên cứu sâu thêm về HCV genotype trên phẩm khuếch đại nhờ có chứa dUTP và các kết quả có được từ các nguồn khác nhau. UNG; và chính nhờ cải tiến quan trọng, Phương pháp giải trình tự để định HCV-InoLIPA có khả năng áp dụng được genotype HCV do chúng tôi phát triển và rộng rãi tại Việt Nam[8]. Tuy vậy khả năng trình bày trong công trình nghiên cứu này triển khai sử dụng HCV-InoLIPA tại Việt được thực hiện trên một trình tự dài không Nam cũng còn khá xa vời vì giá thành hãy quá 200bp của một sản phẩm PCR dài còn khá cao (#100USD/mẫu) so với điều khỏang 240-250bp, kết quả từ thử nghiệm kiện kinh tế của nhiều bệnh nhân cũng như RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe khả năng tài chính củaa các bệnh viện hiện đặc hiệu một đọan đích tương tự của nay. Về phương pháp giải trình tự của Trugene và InoLIPA trên vùng 5’NC. Chính Trugene, các nhà sản xuất khuyến cáo nên điều này đảm bảo tính chính xác của kết thực hiện trên sản phẩm PCR của Roche quả định genotype HCV do chúng tôi phát Amplicor, và đây chính là một trở ngại khá triển không khác gì kết quả định genotype lớn vì giá thành của Roche Amplicor dành bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene vì cho HCV rất đắt (trên 120 USD/mẫu thử). đọan trình tự đích của phương pháp của Ngòai giá thành của Roche Amplicor, các vật chúng tôi và đọan trình tự đích của phương liệu tiêu hao khác đi kèm với thử nghiệm pháp Trugen gần như phù hợp nhau hòan giải trình tự cũng phải đến trên 60USD nữa, tòan. Sở dĩ chúng tôi nghiên cứu thành công do vậy giá thành của một thử nghiệm được công trình này là nhờ chúng tôi có genotype HCV bằng giải trình tự của được các thành công trong nghiên cứu thiết Trugene tại Việt Nam khó có thể thấp dưới kế được mồi để chế tạo bộ thử nghiệm RT- 180USD. Trong thời gian qua, chúng tôi đã PCR phát hiện HCV tương thích cho thử nghiên cứu thành công một bộ thử nghiệm nghiệm định genotype HCVbằng kỹ thuật RT-PCR với PCR mix dùng cặp mồi hòan giải trình tự của Trugene[8,9,10]. Ngòai ra, việc tòan tương thích với hệ thống Trugene nhờ nghiên cứu thành công bộ thử nghiệm RT vậy mà phòng thí nghiệm không nhất thiết real-time PCR dùng mồi và taqman probe để phải sử dụng Roche Amplicor làm RT- phát hiện và định lượng HCV-RNA trên một PCR[8,9]. Chính nhờ áp dụng thành công này đọan đích đến 240-250bp mà chúng tôi đã mà hiện nay giá xét nghiệm HCV genotype nghiên cứu và áp dụng tại khá nhiều phòng tại trung tâm Medic chỉ còn không qua thí nghiệm tại Việt Nam[11] là một bước đi 120USD/một mẫu thử. Tuy vậy, giá thành đột phá (phá vở qui luật là real-time PCR này cũng hãy còn khá cao để có thể được chỉ dùng taqman probe chỉ cho kết quả tối ưu định rộng rãi cho các bệnh nhân. Ngòai ra, khi sản phẩm khuếch đại không quá 150bp, Trugene là một hệ thống hòan tòan kín, chỉ chứng minh qua các kết quả trình bày trong được dùng để đáp ứng yêu cầu định biểu đồ 1-B) và chính nhờ vậy đã góp nên genotype HCV của lâm sàng do vậy kết quả một yếu tố rất quan trọng để giảm được giá chỉ có thể hiển thị được trên màn hình và in thành của xét nghiệm định genotype bằng kỹ ra giấy, do vậy nhà nghiên cứu không thể có thuật giải trình tự này vì không cần thiết được kết quả trên một tập tin vi tính để có phải thực hiện một RT-PCR để có sản thể làm blast search hay nghiên cứu phẩm PCR dành riêng cho giải trình tự. Giá phylogenetic. Thư viện HCV là một thư viện thành định genotype HCV bao gồm cả định được xây dựng sẵn và người dùng có thể lượng HCV-RNA hiện nay của chúng tôi có cập nhật thêm các kết quả của mình (thực khả năng sẽ không quá 50USD/mẫu. hiện trên chính máy giải trình tự của Kết quả của công trình nghiên cứu cho Trugene) vào thư viện này, nhưng không thể thấy đa số các mẫu huyết thanh được gửi lấy thư viện này ra bên ngòai cũng như đến xét nghiệm định lượng HCV-RNA là không thể đăng nhập được một trình tự có thuộc genotype 1b (55%) và 6a (20%), 25% được từ các máy giải trình tự khác để search còn lại phân phối vào các genotype khác như 5
mở ra được một khả năng ứng dụng rộng rãi genotype 2 (9%), genotype 1a (6%), genotype không chỉ nhờ giá thành xét nghiệm thấp 2a (5%), genotype 1 (2%), genotype 1a/1b giúp cho các bác sĩ điều trị không ngần ngại (1%), genotype 2a/2c (1%), và genotype 2b (
Clinical Specimens. Journal of clinical microbiology. generated with the Amplicor HCV test. J. Clin. 4855–4857 Microbiol. 37:2625– 2630. 16. Cantaloube, J., H. Venault, J. Zappitelli, P. Gallian, M. 18. Sandres-Saune, K., P. Deny, C. Pasquier, V. Thibaut, G. Touinssi, H. Attoui, P. Biagini, X. de Lamballerie, and Duverlie, and J. Izopet. 2003. Determining hepatitis C P. de Micco. 2000. Molecular analysis of HCV type 1 to genotype by analyzing the sequence of the NS5b region. 5 envelope gene: application to investigations of J. Virol. Methods 109:187–193. posttransfusion transmission of HCV. Transfusion 19. Tamalet, C., P. Colson, H. Tissot-Dupont, M. Henry, C. 40:712–717. Tourres, N. Tivoli, D. Botta, I. Ravaux, I. Poizot-Martin, 17. Germer, J. J., P. N. Rys, J. N. Thorvilson, and D. H. and N. Yahi. 2003. Genomic and phylogenetic analysis Persing. 1999. Determination of hepatitis C virus of hepatitis C virus isolates: a survey of 535 strains genotype by direct sequence analysis of products circulating in southern France. J. Med. Virol. 71:391– 398. 7