Xác định nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư thanh long ở Hà Nội và vùng phụ cận

Chia sẻ: Kethamoi5 Kethamoi5 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết xác định các loài Colletotrichum spp. Gây bệnh thán thư trên thanh long được thu thập tại một số địa điểm thuộc miền Bắc của Việt Nam dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự gene vùng rDNA-ITS, nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của Colletotrichum spp.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư thanh long ở Hà Nội và vùng phụ cận

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 XÁC ĐỊNH NẤM Colletotrichum spp. GÂY BỆNH THÁN THƢ THANH LONG Ở HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN Identification of Colletotrichum spp. Causing Anthracnose of Hylocereus undatus in Ha Noi and Surrounding Areas 1 1 2 Nguyễn Đức Huy *, Vƣơng Anh Phƣơng và Trần Thị Thanh Bình Ngày nhân bài: 20.07.2018 Ngày chấp nhận: 17.08.2018 Abstract In this study, five samples like anthracnose symptom were collected from stems and fruits of Hylocereus undatus in Hanoi and surrounding areas. Based on morphological and molecular characteristics, the pathogen was identified as Colletotrichum truncatum infected fruits and Colletotrichum spp. infected stems of H. undatus. Further studies were focused on C. truncatum and showed that the fungus was grown faster at to 3 °C than at o 15, 20, 35 and 40 C with average colony diameter of 70,7 mm after 8 days cultured on PDA. Pathogenicity test revealed that C. truncatum could infect several ripe fruits including banana, soybean, fruits and stems of H. undatus and chili. This research improves the comprehension of Colletotrichum species causing anthracnose of H. undatus and supports useful information for effective control of anthracnose. Keywords: Anthracnose, Hylocereus undatus, Colletotrichum, morphological and molecular characteristics, Ha Noi. * 1. ĐẶT VẤN ĐỀ sinh Nấm gây b nh ư c x c ịnh l do Colletotrichum truncatum c b o t phân sinh Thanh long (Hylocereus undatus ư c tr ng hình cong lưỡi li m, hai u nhọn, c giọt d u ph biến ở nhi u nước trên thế giới v ở c c trong ở giữa b o t Nấm C. truncatum tên nước Đông Nam Á như Th i Lan, Đ i Loan, ng nghĩa C. capcisi l m t trong những t c Malaysia v Vi t Nam Ngo i ra, thanh long c ng nhân gây b nh th c v t c ph ký ch r ng bao ư c tr ng nhi u ở Trung Quốc Ở Vi t Nam, g m cây h tiêu, c , dưa lê, u xanh, nho v thanh long l cây c gi trị xuất khẩu cao v nhi u lo i cây tr ng kh c Ngo i ra, nấm C. ư c tr ng ch yếu ở Bình Thu n, Long An v truncatum c ng ư c ph t hi n gây ra b nh Ti n Giang Hi n nay, thanh long ư c tr ng th n thư trên c chua Diao et al , với vết ở nhi u t nh mi n Bắc như H N i Ba Vì, Th ch b nh hình tr n, b mặt hơi lõm v xuất hi n Thất , Ph Thọ, Quảng Ninh, H a Bình v Ninh nhi u chấm en nhỏ trên b mặt v b nh th n Bình B nh h i l m t trong những mối lo ng i thư trên cây cải ngọt He el al , 6 B nh ối với sản xuất thanh long c a nhi u nước trên th n thư h i thanh long c ng ư c Vi n cây thế giới trong c Vi t Nam M t trong những ăn quả Mi n Nam x c ịnh l do nấm C. b nh nấm h i thanh long i n hình v kh ph ng gloeosporioides T i H N i v m t số t nh mi n tr l b nh ốm nâu hay nhi u t i li u gọi l b nh Bắc, thanh long ư c tr ng với di n t ch loét c nh v quả stem canker Chuang et al., tương ối lớn trong những năm g y ây Tuy 2012; Sanahuja et al., 2016). nhiên, chưa c ph t hi n v ghi nh n v b nh B nh th n thư gây h i trên c nh v quả thanh th n thư thanh long ư c công bố trên c c t p long ư c ghi nh n, công bố ở m t số nước như ch quốc gia hay quốc tế Trung Quốc Guo et al , 3 v Malaysia Vijiya T i Vi t Nam, c c nghiên cứu i sâu v o nấm et al., 2014). gây b nh th n thư c n t v chưa c ph t hi n v Vết b nh c hình elip, b mặt vết b nh hơi b nh t i mi n Bắc c a Vi t Nam Vì v y, mục tiêu lõm, xuất hi n nhi u ĩa c nh v b o t phân c a nghiên cứu n y nhằm i x c ịnh c c lo i Colletotrichum gây b nh th n thư thanh long 1. B môn B nh cây, Khoa Nông học, Học vi n Nông ư c thu th p t i m t số ịa i m thu c mi n nghi p Vi t Nam Bắc c a Vi t Nam d a v o ặc i m hình th i v 2. Đ i học Lâm nghi p trình t gene vùng rDNA-ITS v ii nghiên cứu Email: ndhuy@vnua.edu.vn 48
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 m t số ặc i m sinh học v t nh gây b nh c a 2.4 Đặc điểm hình thái và sinh học Colletotrichum sp. - Đặc điểm hình thái Ngu n nấm thu n ư c 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP cấy trên môi trường PDA ở nhi t o -27 C, quan 2.1 Mẫu bệnh s t s ph t tri n c a tản nấm, s hình th nh ĩa c nh v b o t phân sinh sau c c ng y nuôi cấy Mẫu thân v c nh thanh long c tri u chứng - Đặc điểm sinh học khảo s t s ảnh hưởng b nh th n thư ư c thu th p t i Ba Vì, Th ch c a nhi t ến s ph t tri n c a nấm trên môi Thất H N i v Quảng Ninh Hai mẫu th n thư quả thanh long ư c thu th p t i c a h ng b n trường PDA Theo , ngu n nấm thu n ư c thanh long ở Th i Bình v Gia Lâm H N i nuôi cấy trên môi trường PDA với 3 l n nhắc l i, mỗi l n nhắc l i l ĩa Petri ường k nh mm 2.2 Phân lập và xác định nấm gây bệnh Th nghi m ư c th c hi n ở , , , 3 , 3 o Nấm gây b nh th n thư thanh long ư c v C bằng t ịnh ôn BIOBASE Ngo i ra, s phân l p tr c tiếp t vết b nh bằng kỹ thu t cấy nảy m m v hình th nh ĩa p c a nấm gây ơn b o t v cấy tr c tiếp vết b nh lên môi b nh th n thư c ng ư c nghiên cứu trường PDA Sau cấy chuy n nh sinh trưởng c a s i nấm sang môi trường PDA v 2.5 Tính gây bệnh ư c x c ịnh sơ b d a trên ặc i m c a b o Đ nh gi t nh gây b nh c a nấm th n thư, t phân sinh, ĩa c nh trên môi trường PDA Sau c c lo i quả ch n như chuối, ớt, thanh long, c chua, , nguyên nhân gây b nh ư c x c ịnh d a u tương v c nh thanh long ư c s dụng mỗi trên trình t vùng gene rDNA-ITS. lo i quả ư c lặp l i t nhất ba quả hoặc 3 c nh ối 2.3 PCR và iải trìn tự ene vùn rDNA- với thanh long T o vết thương bằng c ch ục lỗ ITS nhỏ trên quả tùy lo i quả với k ch thức , – 0,3 mm 2 Mẫu nấm gây b nh th n thư trên trên c nh v nhỏ dịch b o t , tr quả u tương ư c lây s t quả thanh long sau phân l p thu n ư c nuôi thương bằng c ch châm kim Dịch b o t với m t 6 cấy trên môi trường nhân t o PDA trong ng y b o t /ml ư c ếm bằng bu ng ếm h ng o ở 8-30 C mg s i nấm ư c thu chiết c u ư c s dụng lây b nh Th nghi m ư c DNA theo phương ph p CTAB Cetyltrimethyl o th c hi n ở -27 C. Theo dõi thời kỳ ti m dục, s ammonium bromide c a Doyle Doyle 8 hình th nh c a b nh sau c c ng y lây nhiễm Tỷ l To n b vùng vùng ITS c a mẫu nấm ư c b nh ư c t nh theo công thức: khuếch i bằng cặp m i ITS v ITS White et Số quả bị b nh al., 1990) Phản ứng PCR ư c th c hi n với x TLB (%) = × PCR Master mix Solution (i-Taq c a INtRON, o Số quả lây b nh nhi t gắn m i ở C. Sản phẩm PCR ư c tinh chiết t agarose gel , % dùng k t tinh chiết 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU thương m i c a h ng NORGEN theo hướng dẫn c a nh sản xuất Sản phẩm PCR ư c 3.1 Thu thập, phân lập và xác định tác giải trình t tr c tiếp m t chi u dùng m i ITS nhân gây bệnh t i h ng Macrogen H n Quốc Trình t ITS Nghiên cứu n y thu th p ư c ba mẫu c a mẫu th nghi m ư c so với chuỗi sẵn c th n thư trên thân, c nh thanh long v hai mẫu trên GenBank bằng ph n m m tr c tuyến th n thư trên quả thanh long C c tri u chứng BLAST t i NCBI the National Center for c a b nh th n thư ư c quan s t thấy cả trên Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) x c thân/c nh v quả thanh long Tri u chứng trên ịnh tên nấm gây b nh Tiếp theo, cây phả h thân l c c ốm trong hoặc b u dục c m u nâu v mối quan h giữa c c chuỗi nucleotide ư c v ng, b mặt vết b nh hơi lõm v c nhi u chấm xây d ng bằng phương ph p Neighbor-Joining nhỏ m u cam hình a Vết b nh trên quả hình Saitou v Nei, 8 sẵn c trong ph n m m tr n, k ch thước , - , cm, b mặt vết b nh MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016). lõm v c nhi u chấm en nhỏ hình c 49
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 Hình 2. Phản ứng PCR khuếch đại vùng rDNA-ITS của hai mẫu nấm thán thƣ trên thân (phải) và trên quả (trái) thanh long. Kích thƣớc sản phẩm PCR khoảng 600 bp Hình 1. Triệu chứng bệnh thán thƣ thanh long a) tri u trứng trên c nh, c tri u chứng trên quả, Kết quả giải trình t m t chi u sản phẩm PCR b b o t phân sinh nấm Colletotrichum spp. vùng rDNA-ITS s dụng m i ITS cho thấy mẫu quan s t ư c khi t ch t tri u chứng trên c nh th n thư trên c nh thanh long TLBV-Thân thu c thanh long v d b o t phân sinh nấm phức h p lo i g m C. siamense, C. Colletotrichum spp trên quả thanh long gloeosporioides v Colletotrichum sp hình 3 Đ phân bi t t ng lo i trong phức h p n y D a v o ặc i m hình th i c a b o t phân c n d a trên vùng gene ApMat Sharma et al., sinh hình b u dục, c hai giọt d u hình b phân 2013). Ngo i ra, trình t gene mẫu th n thư trên l p t c nh thanh long t i Ba Vì v hình cong quả thanh long TLHN-Quả thu c cụm C. lưỡi li m, c m t giọt d u ở giữa hình d phân truncatum với mức tương ng l , % l p trên quả thanh long thu th p t i c a h ng b n Theo nghiên cứu c a Shivaprakash et al., (2011) thanh long ở Gia Lâm, H N i Bước u d a thì vùng rDNA-ITS phân bi t C. truncatum v o ặc i m hình th i c a b o t phân sinh, với c c Colletotrichum kh c Như v y, c c nấm gây b nh th n thư trên c nh thanh long c nghiên cứu tiếp theo t p trung v o C. truncatum th l do nấm Colletotrichum gloesporioides v gây b nh th n thư trên quả thanh long trên quả thanh long l do nấm C. truncatum gây ra Tuy nhiên, x c ịnh ch nh x c lo i Colletotrichum, kỹ thu t PCR v giải trình t gene ư c p dụng ối với hai mẫu nấm n y 3.2 Xác định nấm gây bệnh thán thƣ thanh long dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS DNA c a hai mẫu nấm Colletotrichum gây b nh th n thư trên c nh v quả thanh long ư c t ch chiết t s i nấm nuôi trên môi trường PDA sau ng y Sản phẩm PCR khuếch i vùng rDNA-ITS bằng cặp m i ITS v ITS c k ch thước khoảng 6 bp hình Băng sản phẩm Hìn 3. Câ p ả ệ đƣợc xâ dựn bằn p ƣơn p áp PCR rõ nét v không xuất hi n băng phụ Neighbor-Joining trong MEGA 7.0 50
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 Gi trị ở c c nốt c a cây phả h l gi trị thống Nấm C. truncatum ư c nuôi cấy trên môi kê bootstrap dưới d ng % l n lặp Thanh trường PDA v theo dõi s ph t tri n, ặc i m bar th hi n khoảng c ch di truy n tản nấm, b o t phân sinh v hình th nh ĩa 3.3 Đặc điểm hình thái và sinh học và tính c nh bảng , hình c-i). gây bệnh của nấm Colletotrichum truncatum Bảng 1. Đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum truncatum Ng y Đặc i m hình th i sau cấy Tản nấm B o t phân sinh, ĩa c nh Đường k nh tản nấm 3, mm, tản nấm 2 Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh x m, xốp Đường k nh tản nấm 3 , mm, tản nấm 4 trắng x m, d y, c c c chấm en nhỏ Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh mọc v ng tr n ng tâm hình f Đường k nh tản nấm 8, mm, tản nấm 6 x m, xốp, c c c chấm en nhỏ mọc Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh v ng tr n ng tâm Đường k nh tản nấm 6 ,6 mm, tản nấm 8 x m, xốp, nhi u chấm en mọc ki u Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh v ng tr n ng tâm Đường k nh tản nấm , mm, tản nấm Xuất hi n b o t phân sinh, m t b o t t, 10 x m, xốp, rất nhi u chấm en nhỏ mọc ơn b o, không m u, cong lưỡi li m, c m t v ng tr n ng tâm giọt d u ở giữa Đường k nh tản nấm 8 , mm, tản nấm Mất b o t phân sinh nhi u, không m u, 12 m u x m, xốp, nhi u chấm en mọc ơn b o, cong lưỡi li m, giọt d u ở giữa v ng tr n ng tâm hình g Xuất hi n ĩa c nh hình c , mọc ơn l hoặc t p Đường k nh tản nấm mm, tản nấm trung th nh m, c c c lông gai m u en, thưa, 14 m u x m, xốp, nhi u v ng tr n ng tâm phân ốt v d i, b o t phân sinh nhi u v k ch với c c chấm en nhỏ ư c hình th nh thước – µm x , -3, µm hình h-i). Nhi t l m t trong những yếu tố môi cứu n y th nghi m s ph t tri n c a nấm C. o trường c ảnh hưởng tr c tiếp ến s nảy m m truncatum ở c c nhi t – 40 C, th nghi m c a b o t phân sinh, xâm nh p, ph t tri n v ư c th c hi n trên môi trường PDA bảng gây b nh c a c c lo i nấm gây b nh cây Nghiên Hình 4. Triệu chứng và đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum truncatum gây bệnh trên thanh long Tri u chứng b nh th n thư trên thân a , trên quả b , ĩa c nh c , ĩa p d , tản nấm trên môi trường PDA f v b o t phân sinh g-i). 51
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 mm Nấm C. truncatum c ng ph t tri n ư c ở o 35-40 C nhưng rất ch m bảng Nấm ph t o tri n ch m ở c c nhi t 3 v C, sau 12 ng y nuôi cấy ường k nh ch t ,3 v , mm Như v y, trong qu trình bảo quản thanh long c n lưu ý giữ l nh tr nh s gây h i c a b nh th n thư thanh long c ng như chất lư ng c a quả thanh long Bảng 3. Đánh giá tính gây bệnh của nấm Colletotrichum truncatum Số Số c nh/quả Tỷ l Hình 5. Sự nảy mầm của bào tử phân sinh Lo i quả c nh/quả bị nhiễm (%) nấm Colletotrichum truncatum lây b nh C nh 9 9 100 Th nghi m s nảy m m c a b o t phân thanh long sinh nấm C. truncatum cho thấy b o t phân sinh Quả thanh nảy m m sau giờ trong giọt nước cất vô trùng 6 6 100 long v sau giờ ống m m bắt u ph t tri n d i ra Chuối 6 4 66,7 Tỷ l nảy m m c a b o t phân sinh t % ở o C chua 10 10 100 nhi t ph ng – 27 C Khi cấy ơn b o t trên môi trường WA, sau giờ ĩa p ư c Đ u tương 10 10 100 hình th nh trên s i nấm, ĩa p c hình ô van, Ớt 10 10 100 m u nâu hoặc nâu m hình d Kết quả lây b nh nhân t o trên c c quả ch n Bảng 2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát như chuối, u tương, c nh thanh long, quả triển của Colletotrichum truncatum thanh long, c chua v ớt cho thấy thời kỳ ti m dục c a nấm l ng y Vết b nh th hi n rõ nhất Nhi t Đường k nh tản nấm sau c c ng y trên quả thanh long, vết b nh tr n, b mặt lõm v nuôi cấy (mm) s i nấm trắng ph t tri n trên b mặt vết b nh o ( C) 2 4 6 8 10 12 hình 6b Vết b nh trên ớt v c chua c ng rất 15 8,7 17,7 23,3 29,3 35,7 44,3 i n hình, b mặt lõm v c nhi u chấm en ĩa 20 15,7 33,3 54,6 70,7 80,3 90,0 c nh hình th nh trên b mặt vết b nh hình 6c 25 22,3 35,7 56,3 75,0 90,0 90,0 Trên quả chuối v quả u tương vết b nh 30 15,7 36,0 58,3 78,0 90,0 90,0 nhỏ, không i n hình v chưa quan s t thấy ĩa 35 10,7 15,3 20,7 25,3 36,7 45,3 c nh c a nấm gây b nh Đĩa c nh v o b o t 40 7,7 13,7 19,7 24,7 32,3 40,7 phân sinh c a nấm C. truncatum ư c hình th nh rất nhi u khi lây trên thân/c nh thanh long Nhi t c ảnh hưởng lớn ến s ph t tri n c a nấm C. truncatum Ở nhi t o C, nấm nhưng tri u chứng b nh không i n hình như ph t tri n rất ch m Sau ng y nuôi cấy, tri u chứng b nh trên quả thanh long Như v y, ường k nh tản nấm l ,3 mm bảng Nấm thân thanh long c th ư c s dụng l m v t li u ph t tri n nhanh d n ở nhi t o C v ph t t o ra số lư ng lớn b o t phân sinh nấm C. tri n tốt nhất ở o -30 C Sau ng y nuôi cấy truncatum phục vụ cho c c nghiên cứu chuyên trên môi trường PDA, ường k nh tản nấm l sâu như t nh gây b nh, nảy m m c a b o t 52
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 Hình 6. Triệu chứng lây bệnh nhân tạo sử dung nấm Colletotrichum truncatum. a c nh thanh long, b quả thanh long, c ớt, d chuối, e c chua v f u tương 4. KẾT LUẬN 4. Guo, L.W., Wu, Y.X., Ho, H.H., Su, Y.Y., Mao, Z.C., He, P.F. and He, Y.Q. , 2014. First Report of Tri u chứng b nh th n thư trên quả thanh long Dragon Fruit (Hylocereus undatus) Anthracnose ư c x c ịnh l do nấm Colletotrichum truncatum Caused by Colletotrichum truncatum in China. Journal v trên c nh thanh long l Colletotrichum spp. Nấm of Phytopathology: 162 (4), pp. 272-275. C. truncatum ph t tri n, nảy m m v gây b nh tốt ở 5. He, Y., Chen, Q., Shu, C., Yang, M. and Zhou, o nhi t 5-30 C Những nghiên cứu tiếp theo E., 2016. Colletotrichum truncatum, a new cause of nhằm x c ịnh lo i Colletotrichum gây b nh th n anthracnose on Chinese flowering cabbage (Brassica thư trên thân thanh long trong phức h p lo i C. parachinensis) in China. Tropical Plant Pathology: siamense, C. gloeosporioides v Colletotrichum sp. 41(3), pp.183-192. Nghiên cứu n y cung cấp thông tin v th nh ph n 6. Kumar S., Stecher G., and Tamura K., 2016. lo i c a Colletotrichum gây b nh th n thư thanh MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and long v l cơ sở ưa ra chiến lư c ph ng tr Evolution 33: pp.1870-1874. b nh c hi u quả 7. Sanahuja, G., Lopez, P., and Palmateer, A.J., 2016. First Report of Neoscytalidium dimidiatum TÀI LIỆU THAM KHẢO Causing Stem and Fruit Canker of Hylocereus undatus in Florida. Plant Disease: 100 (7), p.1499. 1. Chuang, M.F., Ni, H.F., Yang, H.R., Shu, S.L., 8. Saitou N. and Nei M., 1987. The neighbor-joining Lai, S.Y. and Jiang, Y.L. 2012. First Report of Stem method: A new method for reconstructing phylogenetic Canker Disease of Pitaya (Hylocereus undatus and H. trees. Molecular Biology and Evolution: 4, pp.406-425. polyrhizus) Caused by Neoscytalidium dimidiatum in 9. Vijaya, S.I., Anuar, I.S.M. and Zakaria, L., 2015. Taiwan. Plant Disease: 96 (6), p.906. Characterization and Pathogenicity of Colletotrichum 2. Diao, Y.Z., Zhang, C., Lin, D. and Liu, X.L. (2014). First truncatum Causing Stem Anthracnose of Red‐Fleshed Report of Colletotrichum truncatum Causing Anthracnose of Dragon Fruit (Hylocereus polyrhizus) in Malaysia. Tomato in China. Plant Disease: 98(5), p.687. Journal of Phytopathology: 163 (1), pp.67-71. 3. Doyle J.J. and Doyle J.L.,1990. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull.: 19, pp.11–15. Phản biện: TS. Hà Minh Thanh 53