Xác định sự hiện diện DNA thai tự do trong máu mẹ bằng kỹ thuật MSP kết hợp tạo dòng giải trình tự

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018<br /> <br /> <br /> XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ<br /> BẰNG KỸ THUẬT MSP KẾT HỢP TẠO DÒNG GIẢI TRÌNH TỰ<br /> Lương Bắc An*,***, Lê Thị Xuân Thảo*, Nguyễn Khắc Hân Hoan**, Lê Quang Thanh**,<br /> Đỗ Thị Thanh Thủy*.<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Phân tích DNA thai tự do (cffDNA) trong máu mẹ không chỉ hữu ích trong sàng lọc tiền sản<br /> không xâm lấn (NIPS) một số bất thường lệch bộ nhiễm sắc thể như T21, T18, T13 mà còn hữu ích trong<br /> tầm soát một số bất thường liên kết giới tính, nhóm máu rhesus D (RhD),  -thalassemia, tăng sản tuyến<br /> thượng thận bẩm sinh, loạn dưỡng cơ.... Tất cả những xét nghiệm này đều tập trung vào phát hiện những<br /> trình tự bất thường của thai nhi được di truyền từ bố mẹ. Thai nhi có thừa hưởng những trình tự bất<br /> thường hay không được xác định bằng cách phân tích cffDNA trong huyết tương thai phụ. Tuy nhiên, kết<br /> quả không phát hiện các trình tự bất thường có thể bị tác động bởi các yếu tố như hàm lượng cffDNA quá<br /> thấp hoặc cffDNA bị thoái hoá và thất thoát trong quá trình xử lí mẫu. Chính vì vậy, cần có một dấu ấn xác<br /> định sự hiện diện của cffDNA trong huyết tương thai phụ cho phép kiểm soát các trường hợp âm tính giả.<br /> Mục tiêu: Xác định sự hiện diện của cffDNA thông qua sự khác biệt trạng thái methyl hoá vùng<br /> promoter gen RASSF1A<br /> Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tách chiết cfDNA (DNA tự do) từ mẫu huyết tương của<br /> thai phụ. Mẫu cfDNA được xử lí bisulfite trước khi thực hiện phản ứng methylation specific PCR (MSP)<br /> để phát hiện cffDNA trong máu mẹ. Tạo dòng trình tự DNA của thai và DNA của mẹ vào vector. Giải<br /> trình tự xác định các vị trí C-methyl hoá trong DNA thai.<br /> Kết quả: Phát hiện được sự hiện diện cffDNA trong máu mẹ thông qua sự methyl hoá promoter gen<br /> RASSF1A. Tạo dòng thành công vector chứa trình tự DNA của thai và vector chứa trình tự DNA của mẹ.<br /> Kết quả giải trình tự cho thấy toàn bộ 14 vị trí C-methyl hoá trên vùng trình tự DNA của thai đều ở trạng<br /> thái methyl hoá.<br /> Kết luận: Methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A được xem là một dấu ấn để phát hiện sự tồn tại<br /> của cffDNA. Dấu ấn này cho phép phát hiện được những kết quả âm tính giả trong các sàng lọc không xâm<br /> lấn sử dụng cffDNA để phân tích.<br /> Từ khóa: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, cffDNA.<br /> ABTRACTS.<br /> IDENTIFICATION THE CIRCULATING FREE FETUS DNA IN MATERNAL BLOOD BY USING<br /> MSP COMBINES CLONING AND SEQUENCING TECHINIQUES.<br /> Luong Bac An, Le Thi Xuan Thao, Nguyen Khac Han Hoan, Le Quang Thanh, Do Thi Thanh Thuy.<br /> Ho Chi Minh City Journal of Medicine *Vol. 22 - No 4- 2018: 367 – 374.<br /> Introduction: Circulating fetal DNA analysis in maternal plasma is useful in the non-invasive prenatal<br /> screening (NIPS) not only the detection of aneuplodies but also identification of sex-linked disorders, fetal rhesus<br /> D (RhD), B-thalassemia and aneuplodies. Many of these applications focus on the detection of paternally inherited<br /> disease-causing sequences in maternal plasma. Whether the fetus has inherited such a sequence is inferred by the<br /> <br /> * Đại học Y Dược TP. HCM, ** Bệnh viện Từ Dũ Tp. HCM, *** Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Tp.HCM.<br /> Tác giả liên lạc: CN. Lương Bắc An ĐT: 0933.908.241 Email: luongbacan1991@gmail.com.<br /> <br /> 368<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> presence or absence of the target sequence in maternal plasma, but the absence of such a sequence in maternal<br /> plasma could alternatively be a result of low cffDNA concentrations or cffDNA loss during samples processing.<br /> Thus, the availability of a positive control confirming the presence of fetal DNA in the sample would be avoided<br /> false-negative results.<br /> Objectives: Identification of cffDNa in maternal blood through differently methylation status of RASSF1A<br /> promoter.<br /> Methods: A cross-sectional study. CfDNA were extracted, then were treated bisulfate. MSP was carried out<br /> to detect cffDNA in maternal plasma. Cloning and sequencing the MSP products to identify the C-methylation<br /> bases.<br /> Results: we identified the presentation of fetal DNA in maternal blood through methylation of RASSF1A<br /> promoter. We have successfully cloned the fetal DNA and maternal DNA into vector. All 14 CpG sites was<br /> absolute methylation in fetal DNA sequence.<br /> Conclusions: Hypermethylation RASSF1A is a universal marker for fetal DNA and is readily detectable in<br /> maternal plasma. This marker allows the detection of false-negative results when applied to NIPS.<br /> Key words: Methylation, RASSF1A, methylation specific PCR (MSP), cfDNA, NIPS.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ. huyết tương của mẹ(6).<br /> Trong hơn một thập kỷ qua, tiềm năng ứng<br /> Sự hiện diện của DNA thai tự do (cffDNA)<br /> dụng trong lâm sàng của cffDNA đã được thể<br /> trong máu mẹ đã mở ra cuộc cách mạng trong<br /> hiện trong các kỹ thuật sàng lọc tiền sản không<br /> sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS). DNA tự xâm lấn (NIPS) một số bất thường lệch bội<br /> do (cfDNA) là những đoạn DNA nhỏ, tồn tại nhiễm sắc thể như T21, T18, T1, ngoài ra cffDNA<br /> trong máu của thai phụ. CfDNA có nguồn gốc từ còn được sử dụng để xác định nhóm máu rhesus<br /> các tế bào chết, bị vỡ và giải phóng cfDNA vào D (RHD) của thai nhi, bệnh lí liên kết với giới<br /> hệ tuần hoàn. Các cfDNA này bắt nguồn từ máu tính, - thalassemia, rối loạn dưỡng cơ, tăng sản<br /> tuyến thượng thận bẩm sinh,…Ngoài ra, hàm<br /> thai phụ (tế bào mô mỡ hoặc tế bào máu) và từ<br /> lượng cffDNA cũng có thể sử dụng xác định một<br /> thai nhi (tế bào nhau thai). Năm 1997, Lo và cộng<br /> số bất thường tiền sản khác như tiền sản giật,<br /> sự đã chứng minh cffDNA tồn tại trong suốt thai hay một số bất thường nhau thai(8).<br /> kỳ(5). Các nghiên cứu chỉ ra rằng cffDNA có thể Một thách thức lớn nhất khi phát triển các xét<br /> được tìm thấy vào tuần thứ 7 của thai kỳ và hàm nghiệm NIPS đó là hàm lượng cffDNA trong<br /> lượng cffDNA tăng dần theo sự phát triển của máu mẹ chỉ dao động trong khoảng 3-13% tuỳ<br /> thai, dao động từ 3-13% trong tổng số cfDNA thuộc vào tuổi thai(2). Để phân biệt được cffDNA<br /> huyết tương thai phụ tùy theo tuổi thai(8). và cfDNA thai phụ, ngưới ta thường dựa trên<br /> những đặc điểm di truyền học hoàn toàn khác<br /> CffDNA giảm nhanh chóng sau khi sinh và biến<br /> biệt giữa mẹ và thai, như sự hiện diện của các gen<br /> mất hoàn toàn khoảng 2 giờ sau sinh(6). Đâặc tính<br /> trên nhiễm sắc thể (NST) Y hoặc các điểm đa<br /> rất hữu ích trong chẩn đoán thai kỳ hiện tại vì hình trên cffDNA được thừa hưởng từ người bố<br /> tránh được nhầm lẫn với các thai kỳ trước. Năm có sự khác biệt so với bộ gen của người mẹ(4,9). Rất<br /> 1998, Lo và cộng sự công bố đã tách chiết được nhiều phương pháp sàng lọc được phát triển từ<br /> lượng cffDNA khá cao trong máu thai phụ: 3,4 rất sớm dựa vào các đặc điểm này của cffDNA,<br /> đến 6,2%, cao hơn khoảng 25 lần so với sử dụng tuy nhiên kèm theo đó là những hạn chế nhất<br /> định. Đầu tiên, các xét nghiệm sàng lọc phát triển<br /> tế bào thai nhi nguyên vẹn trên cùng một lượng<br /> <br /> <br /> 369<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018<br /> <br /> dựa trên sự hiện diện của NST Y chỉ có thể áp tháng 5/2018. Nghiên cứu của chúng tôi sẽ sử<br /> dụng trong trường hợp thai nam. Ngoài ra, khi dụng ống Streck BCT để thu nhận mẫu máu. Thai<br /> kết quả âm tính cần được kiểm tra lại để loại trừ phụ được lấy 10ml máu chứa trong ống Streck<br /> các khả năng là do mang thai nữ hoặc hàm lượng BCT, lập tức đảo ống 180o khoảng 10 lần để máu<br /> cffDNA quá thấp dưới ngưỡng phát hiện của thiết trộn đều với các chất bảo quản bên trong ống.<br /> bị, thậm chí do sự thất thoát cffDNA trong quá Nếu chưa xử lý kịp thời, có thể lưu mẫu ở nhiệt độ<br /> trình thu nhận và xử lí. Thứ hai, phát hiện dựa phòng (18oC-25oC) trong vòng 14 ngày. Li tâm<br /> vào đặc điểm đa hình thừa hưởng từ bố yêu cầu ống máu với tốc độ 1.600 rpm trong 10 phút ở<br /> phải có thêm thông tin dữ liệu di truyền từ cha và nhiệt độ phòng. Sau đó nhẹ nhàng hút lớp huyết<br /> chỉ có thể áp dụng với số lượng nhỏ đối tượng đã tương phía trên, chú ý không chạm phần buffy<br /> có các điểm đa hình đặc trưng. coat. Li tâm lần 2 huyết tương vừa thu được với<br /> Vì vậy, điều cần thiết cần phải nghiên cứu tốc độ 13.000 rpm trong 10 phút, ở 4oC, thu dịch<br /> những marker có thể phản ánh sự khác biệt giữa nổi. Mẫu huyết tương được trữ trong tủ -80oC.<br /> DNA thai và DNA mẹ. Các marker này không Mẫu huyết tương sau đó được tách chiết bằng<br /> phụ thuộc vào giới tính thai nhi hay dữ liệu di bộ kít QIAamp Circulating Nucleic acid<br /> truyền từ bố. Trong đó, sự khác biệt ngoại di (QIAgen). CfDNA thu được trữ -30oC sẵn sàng để<br /> truyền giữa DNA thai và DNA mẹ đang là lĩnh tiến hành các bước phân tích tiếp theo.<br /> vực thu hút được nhiều sự chú ý. Trong đó, một Nghiên cứu thực hiện tại Trung tâm Y Sinh<br /> số gen được methyl hoá hoàn toàn ở DNA mẹ học Phân tử - Đại học Y Dược TP. HCM.<br /> nhưng không methyl hoá ở tế bào nhau thai như<br /> Kiểm tra mồi<br /> gen PDE9A, SERPINB5(7). Tuy nhiên, cũng có<br /> Cặp mồi cho phản ứng MSP tham khảo theo<br /> những gen có trạng thái methyl hoá hoàn toàn<br /> nghiên cứu của Dennis Lo và cộng sự(1). Mồi<br /> ngược lại. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử<br /> RASSF1A-qMF/R có đầu 3’ được thiết kế bắt cặp<br /> dụng sự methyl hoá vùng promoter của gen<br /> bổ sung đặc hiệu tại vị trí C-methyl hoá, giúp<br /> RASSF1A để chứng minh sự tồn tại của cffDNA<br /> khuếch đại chính xác những đoạn DNA bị<br /> trong huyết tương thai phụ.<br /> methyl hoá. Mồi RASSF1A-qUF/R có đầu 3’ được<br /> ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU. thiết kế bắt cặp bổ sung đặc hiệu tại các vị trí C-<br /> Thiết kế nghiên cứu không methyl hoá. Các cặp mồi được chúng tôi<br /> Mô tả cắt ngang. kiểm tra về khả năng bắt cặp bằng phần mềm<br /> CLC MainWorkbench (QIA). Nhiệt độ nóng chảy<br /> Phương pháp nghiên cứu.<br /> (Tm) được kiểm tra bằng Tm Tool<br /> Đối tượng nghiên cứu (https://www.dna.utah.edu/tm/tool.html).<br /> Đối tượng nghiên cứu là các thai phụ tại Bệnh<br /> viện Từ Dũ trong thời gian từ tháng 10/2017 đến<br /> Bảng 1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu.<br /> o<br /> Tên primer Trình tự (5’-3’) Tm ( C) Kích thước PCR (bp)<br /> RASSF1A-qMF CGTGTTAACGCGTTGCGTATC 66,36<br /> 104<br /> RASSF1A-qMF TACGTAACAAACCCCACGAAGTAAAAACG 68,78<br /> RASSF1A-qUF GGTTGGAGTGTGTTAATGTGTTGTGTATT 67,18<br /> 112<br /> RASSF1A-qUR TACATAACAAACCCCACAAACTAAAAACA 65,18<br /> SP6 TAAATCCACTGTGATATCTT 54,79<br /> Tuỳ thuộc đoạn chèn<br /> T7 ATTATGCTGAGTGATATCCC 57,97<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 370<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> Biến đổi các gốc CpG của cfDNA giây, 58 oC trong 20 giây, 72oC trong 20 giây; tiếp<br /> CfDNA được tiến hành xử lí với sodium theo với bước nhiệt 72oC trong 3 phút. Sản phẩm<br /> bisulfite để biến đổi toàn bộ các vị trí Cytosine được giữ ở 4oC sau khi chương trình PCR kết<br /> (C-) không methyl hoá. Dưới tác dụng của thúc. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên<br /> sodium bisulfite tất cả các vị trí C- không methyl thạch agarose 2% có thuốc nhuộm GelRed và<br /> hoá sẽ chuyển hoá thành uracil trong khi đó các quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di GelDoc-<br /> C-methyl hoá sẽ không bị biến đổi. Kết thúc qui ItTM (UVP, Mỹ).<br /> trình, trình tự DNA có sự thay đổi, điều này phụ Tạo dòng sản phẩm PCR<br /> thuộc vào tình trạng methyl hoá tại các vị trí Chúng tôi sử dụng hệ thống pGEM®T Easy<br /> cystosine. Chúng tôi tiến hành chuyển đổi trình vector với quy trình theo hướng dẫn của nhà sản<br /> tự các cfDNA thu được bằng bộ kít EZ DNA xuất. Vector pGEM®T Easy có chứa vùng trình tự<br /> Methylation-Direct TM kit (Zymo Research). Bộ promoter T7 và SP6 RNA polymerase ở hai bên<br /> kít EZ DNA Methylation-Direct TM có chứa vùng gắn chèn DNA đích. Quy trình tóm tắt với<br /> sodium bisulfite có tác dụng chuyển đổi gốc các bước:<br /> cytosine chưa methyl hóa thành gốc uracil, còn Bước 1: Nối sản phẩm PCR với hệ thống vector<br /> các gốc cytosine đã methyl hóa được giữ nguyên.<br /> Phản ứng nối được thiết lập trong phản ứng<br /> Vì vậy, có thể phân biệt được cffDNA trong<br /> gồm: 5µl 2X Rapid ligation buffer; 1µl pGEM T<br /> huyết tương mẹ. Quy trình tiến hành theo hướng<br /> Vector (50ng); 1µl T4 DNA ligase (3 Weiss<br /> dẫn của nhà sản xuất.<br /> units/µl) và 2 µl sản phẩm PCR. Phản ứng được<br /> Phản ứng MSP (Methylation Specific PCR) ủ 4oC qua đêm.<br /> Phản ứng MSP được thiết lập để khuếch đại<br /> Bước 2: Biến nạp vector vào E. coli.<br /> những đoạn DNA chứa các gốc CpG được methyl<br /> Rã đông tế bào JM109 High Efficiency<br /> hoá (DNA thai) bằng cặp mồi RASSF1A-qMF/R.<br /> Competent trên đá trong 5 phút; trộn đều 2µl<br /> Tương tự, phản ứng MSP được thiết lập để<br /> sản phẩm vector đã được nối với 50 µl tế bào đã<br /> khuếch đại những đoạn DNA chứa các gốc CpG<br /> rã đông; nhẹ nhàng trộn đều hỗn hợp và đặt trên<br /> không methyl hoá (DNA mẹ) bằng cặp mồi<br /> đá 20 phút; shock nhiệt tế bào trong 45-50 giây<br /> RASSF1A-qUF/R. Ngoài ra, để chứng minh độ<br /> tại chính xác 42oC, không lắc; ủ trên đá trong 2<br /> đặc hiệu của cặp mồi RASSF1A-qMF/R, chúng tôi<br /> phút; bổ sung 900µl môi trường LB đã chuẩn bị<br /> thực hiện phản ứng MSP với mẫu DNA nam giới.<br /> sẵn ở nhiệt độ phòng; ủ tiếp trong 1,5 giờ tại<br /> Thành phần của phản ứng MSP (bảng 2).<br /> 37oC có lắc nhẹ (~150rpm); hút 100µl dung dịch<br /> Bảng 2. Thành phần phản ứng MSP được sử dụng trải lên bề mặt thạch LB chuẩn bị<br /> Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ phản ứng sẵn có chứa ampicillin 100µg/ml, 0,5mM IPTG và<br /> 10X Maxima Buffer 1,5 1X<br /> 80µg/ml X-Gal; trải đều mặt đĩa và nuôi ủ 37oC<br /> dNTPs 250nm 1,2 20 nM<br /> qua đêm.<br /> Primer F (10µM) 0,75 500 nM<br /> Primer R (10µM) 0,75 500 nM Bước 3: Chọn lọc khuẩn lạc quan tâm<br /> 2+<br /> Mg 1,5 Đĩa cấy sau khi được ủ qua đêm sẽ hình<br /> Maxima Taq 0,12<br /> thành các khuẩn lạc có màu xanh và trắng. Sử<br /> DNA 4 10-30 ng<br /> dụng que cấy cẩn thận thu những khuẩn lạc<br /> H2O 5,18 Vừa đủ 15 µl<br /> trắng đơn lẻ cho vào 600µl môi trường LB có<br /> Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện<br /> chứa ampicillin 100µg/ml. Tiếp tục tăng sinh<br /> trên máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức).<br /> Chu kì nhiệt: khởi đầu tại 95oC trong 4 phút; tiếp trong 3 giờ tại 37oC. Ly tâm, thu sinh khối.<br /> theo với 45 chu kì lặp lại các bước 95oC trong 20<br /> <br /> <br /> 371<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018<br /> <br /> Bước 4: PCR kiểm tra vùng chứa đoạn chèn. được methyl hoá, trong đó vị trí đầu 3’ có chứa 1<br /> Sử dụng cặp mồi SP6 và T7 có trình tự nằm nucleotide C-methyl. Trình tự mồi RASF1A-qMR<br /> trên vùng promotor RNA polymerase của vector. có chứa 3 vị trí CpG-methyl hoá, trong đó vị trí<br /> đầu 3’ có chứa 1 nucleotide C-methyl hoá, kích<br /> Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc<br /> Thành phần Thể tích Nồng độ<br /> thước sản phẩm khuếch đại 104bp. Các vị trí CpG<br /> (µl) phản ứng nằm phân bố đều trong trình tự mồi, giúp mồi bắt<br /> 10X Maxima Buffer 1,5 1X đặc hiệu hơn (hình 3). Ngoài ra, trình tự mồi<br /> dNTPs 250nm 1,2 20 nM RASSF1A-qUF/R không có chứa các vị trí CpG<br /> Primer RASSF1A-Qmf (10µM) 0,75 500 nM<br /> methyl hoá được xem là chứng nội kiểm soát quá<br /> Primer RASSF1A-qMR (10µM) 0,75 500 nM<br /> Mg<br /> 2+<br /> 1,5<br /> trình xử lí bisulfite và đại diện cho sự hiện diện<br /> Maxima Taq 0,12 của cfDNA mẹ với kích thước sản phẩm khuếch<br /> DNA plasmid 1 50-100 ng đại 112bp. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) giữa mồi<br /> H2O 8,18 Vừa đủ 15 µl xuôi và ngược tương đương nhau (bảng1).<br /> Tiến hành phản ứng PCR bằng các cặp mồi Kết quả phản ứng MSP<br /> SP6/T7 (bảng 1). Chương trình PCR như sau: 1<br /> Các phản ứng MSP được thiết lập với từng<br /> chu kỳ 95oC trong 4 phút, 40 chu kỳ với mỗi chu<br /> cặp mồi chuyên biệt. Từ hình 1 cho thấy, các<br /> kỳ gồm 3 bước: 95oC/20 giây, 48oC/20 giây,<br /> giếng chứng âm (giếng 3 cho cặp mồi RASSF1A-<br /> 72oC/20 giây và 1 chu kỳ 72oC trong 2 phút. Sau<br /> qUF/R và giếng 6 cho cặp mồi RASSF1A-qMF/R)<br /> đó, điện di trên gel 2% tại 100V trong 30 phút để<br /> không xuất hiện vạch sản phẩm PCR, chứng tỏ<br /> kiểm tra sản phẩm khuếch đại.<br /> phản ứng PCR không xảy ra nhiễm. Giếng 4 xuất<br /> Giải trình tự hiện vạch chứa sản phẩm khuếch đại của cặp mồi<br /> Nếu kết quả điện di cho 1 vạch sáng rõ, RASSF1A-qUF/R có kích thước 112bp, chứng<br /> đúng kích thước thì sản phẩm PCR được tinh minh quá trình bisulfite xảy ra, ngoài ra đây là<br /> sạch bằng bộ kít ExoSAP IT express PCR cặp mồi làm chứng nội để kiểm soát phản ứng<br /> product cleanup (AB, USA). Sản phẩm được MSP. Giếng 5 xuất hiện vạch chứa sản phẩm<br /> giải trình tự 2 chiều (xuôi và ngược) lần lượt với khuếch đại của cặp mồi RASSF1A-qMF/R đúng<br /> mồi SP6 và T7. Sản phẩm giải trình tự được đọc kích thước 104bp, chứng tỏ phản ứng MSP đã<br /> bằng hệ thống điện di mao quản ABI 3500 với khuếch đại thành công được các đoạn DNA có<br /> thuốc thử ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 chứa gốc C-methyl hoá. Bước đầu phát hiện được<br /> Cycle Sequencing Ready reaction (AB, USA). sự hiện diện của DNA thai. Để khẳng định đây là<br /> Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần DNA thai, chúng tôi tiến hành bước tạo dòng và<br /> mềm CLC Main Workbench với trình tự tham giải trình tự sản phẩm PCR của giếng 5.<br /> chiếu của gen RASSF1A tham khảo Để chứng minh sản phẩm ở giếng 5 xuất<br /> (NM_007182.4). Xác định sự tồn tại của các phát từ DNA thai, không phải từ mẹ hay nói<br /> nucleotide C bị methyl hoá không thay đổi cách khác là chứng minh tình trạng methyl hoá<br /> trong quá trình chuyển đổi gốc CpG. vùng promoter gen RASSF1A chỉ xảy ra ở DNA<br /> KẾT QUẢ thai. Chúng tôi sẽ tiến hành thực hiện phản ứng<br /> MSP trên mẫu DNA nam giới bình thường. Kết<br /> Đánh giá hiệu quả cặp mồi<br /> quả cho thấy không xuất hiện vạch sản phẩm khi<br /> Các cặp mồi tham khảo được kiểm tra bằng khuếch đại bằng cặp mồi RASSF1A-qMF/R<br /> phần mềm CLC MainWorkbench. Trình tự của (giếng 1), do đó không có sự methyl hoá xảy ra.<br /> các cặp mồi được thay đổi nhằm bắt cặp bổ sung Chứng nội sử dụng cặp mồi RASSF1A-qUF/R<br /> được với trình tự DNA đã được xử lí bisulfite. cho sản phẩm có kích thước mong muốn 112bp<br /> Trình tự mồi RASSF1A-qMF có chứa 5 vị trí CpG (giếng 2).<br /> <br /> <br /> 372<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Kết quả tạo dòng sản phẩm MSP Ngược lại, chuỗi trình tự DNA mẹ (màu đỏ) cho<br /> Do kích thước sản phẩm PCR nhỏ (104bp và thấy tất cả các vị trí này đều bị biến đổi hoàn<br /> 112bp) nên chúng tôi chèn sản phẩm MSP vào toàn. Từ đó, chúng tôi kết luận đã phát hiện được<br /> vector pGEM®T Easy, sử dụng cặp mồi có trình tự thành công sự hiện diện của DNA thai tự do<br /> trên vector để đọc được toàn bộ đoạn trình tự trong máu mẹ (hình 3).<br /> được chèn quan tâm. Vector có chứa trình tự mã<br /> hoá gen kháng kháng sinh ampicillin cùng trình<br /> tự promoter T7 và SP6 RNA polymerase ở hai<br /> bên vùng gắn chèn DNA đích, nơi có trình tự mã<br /> hoá của chuỗi -peptide của enzyme -<br /> galactosidase. Khuẩn E. coli được nuôi trong môi<br /> trường chứa kháng sinh ampicillin, nếu vi khuẩn<br /> có chứa vector biến nạp vào sẽ được chọn lọc lại.<br /> Ngoài ra, quá trình chèn vào khiến bất hoạt sự<br /> hình thành chuỗi -peptide, dẫn đến enzyme -<br /> galactosidase không còn hoạt tính phân cắt X-Gal<br /> (tạo màu xanh). Do đó, khuẩn lạc màu trắng (mũi<br /> tên đỏ) đại diện cho nhóm có trình tự được gắn<br /> chèn vào vector (hình 2). Khuẩn lạc trắng được sử<br /> dụng trong phản ứng PCR khuẩn lạc. Kết quả Hình 1: - Giếng 1: mồi RASSF1A-qMF/R + DNA<br /> điện di sản phẩm gắn chèn DNA thai (giếng 7) nam; - Giếng 2: mồi RASSF1A-qUF/R và DNA<br /> cho kích thước 281bp và sản phẩm gắn chèn nam; - Giếng 3 và 6: chứng âm của cặp mồi<br /> DNA mẹ (giếng 8) cho kích thước 289bp (hình 1). RASSF1A-qUF/R và RASSF1A-qMF/R; - Giếng<br /> Kết quả giải trình tự 4: mồi RASSF1A-qUF/R; - Giếng 5: mồi<br /> Sản phẩm chèn vào vector được tiến hành RASSF1A-qMF/R, - Giếng 7 và 8 lần lượt là sản<br /> giải trình tự 2 chiều với mồi SP6 và T7 nằm trên phẩm tạo dòng của DNA thai và DNA mẹ.<br /> trình tự vector. Dựa vào sóng trình tự thu nhận<br /> được, chân sóng không nhiễu, sóng chỉ chứa duy<br /> nhất một đỉnh duy nhất, chứng tỏ chuyển đổi<br /> bisulfite đạt hiệu suất cao. Dựa vào chuỗi trình tự<br /> DNA thai (màu xanh) cho thấy tất cả vị trí C-<br /> methyl hoá (14 vị trí) đều không bị biến đổi sau<br /> quá trình bisulfite. Ngoài ra, tất cả vị trí C-methyl<br /> hoá này đều không bị biến đổi, cho thấy có sự<br /> methyl hoá hoàn toàn của vùng gen RASSF1A.<br /> Tuy nhiên, kết quả giải trình tự mới đại diện cho<br /> một vùng nhỏ (104bp) của promoter gen<br /> RASSF1A nên chưa khẳng định được chỉ số<br /> methyl hoá của vùng promoter gen RASSF1A. Hình 2: Kết quả khuẩn lạc chứa vector được chèn<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 373<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3: Kết quả giải trình tự<br /> BÀN LUẬN nghiệm sàng lọc hay kiểm tra sự hiện diện và số<br /> lượng cffDNA.<br /> Sự hiện diện của DNA thai tự do trong huyết<br /> Những hướng tiếp cận hiện nay tập trung vào<br /> tương thai phụ đặc biệt hữu ích trong sàng lọc<br /> các trình tự DNA tự do của thai mang đặc điểm<br /> tiền sản như một số hội chứng di truyền liên quan<br /> ngoại di truyền khác biệt so với DNA mẹ. Trong<br /> tới NST giới tính, nhóm máu RhD và -<br /> đó, sự methyl hoá các gốc CpG tại vùng<br /> thalassemia. Hầu hết các ứng dụng này đều tập<br /> promoter kiểm soát quá trình sự điều hoá biểu<br /> trung vào phát hiện các trình tự gây bệnh di<br /> hiện gen đặc biệt đuợc quan tâm. Một số vùng<br /> truyền từ bố mẹ trong huyết tương thai phụ. Liệu<br /> promoter của gen SERPINB5, PDE9A không<br /> thai nhi có thừa hưởng những trình tự gây bệnh<br /> được methyl hoá trong tế bào nhau thai nhưng lại<br /> hay không sẽ được chứng minh rằng có sự tồn tại<br /> methyl hoá nhiều trong các tế bào máu mẹ. Sự<br /> của các trình tự bất thường trong huyết tương thai<br /> khác biệt này được xem là đối tượng để xác định<br /> phụ, nhưng sự vắng mặt của các trình tự này đôi<br /> sự tồn tại cffDNA. Tuy nhiên, quá trình xử lí<br /> lúc có thể bị thay đổi do hàm lượng cffDNA quá<br /> bisulfite sẽ khiến cho các DNA không methyl<br /> thấp hoặc cffDNA bị thất thoát trong quá trình xử<br /> hoá sẽ bị thái hoá tới 96%(3), trong khi đó hàm<br /> lí mẫu. Do vậy, cần phải có một bước xác định sự<br /> lượng cffDNA thai trong huyết tương thai phụ<br /> hiện diện của DNA tự do của thai trước khi trả kết<br /> chỉ chiếm 8-20% tuỳ tuổi thai(8). Chính vì vậy, sử<br /> quả cho bệnh nhân là âm tính với bệnh lý khảo<br /> dụng các marker không methyl hóa của DNA<br /> sát. Một số trình tự đặc trưng trên NST Y, như là<br /> nhau thai trở thành vấn đề nan giải.<br /> gen SRY hay DYS14, có thể được sử dụng để xác<br /> nhận sự hiện diện của cffDNA. Tuy nhiên, các Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn<br /> marker này chỉ áp dụng trong trường hợp thai marker RASSF1A để phát hiện sự hiện diện<br /> nam. Một số yếu tố khác có thể áp dụng như sử cffDNA. Marker RASSF1A này thể hiện sự<br /> dụng điểm đa hình được di truyền từ bố và mẹ, methyl hoá hoàn toàn trong tế bào nhau thai, còn<br /> nhưng các bất lợi có thế xảy ra như dữ liệu di trong tế bào máu mẹ thì kết quả nghiên cứu<br /> truyền từ người bố có thể không sẵn có; dữ liệu di không thấy có sự methyl hoá (hình 3).<br /> truyền của người mẹ cần phải thực hiện thêm Sự methyl hoá vùng promoter gen RASSF1A<br /> những xét nghiệm khác để có được. Những được cho làm ức chế sự biểu hiện của gen này.<br /> marker DNA thai, với đặc trưng độc lập với giới Đây là một gen ức chế khối u, trong nghiên cứu<br /> tính thai và không phụ thuộc vào các đa hình di ung thư, nhiều nghiên cứu đều cho thấy gen<br /> truyền từ bố mẹ, có thể được sử dụng trong xét RASSF1A bị methyl hoá, ngăn sự kiểm soát phát<br /> <br /> <br /> 374<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 4 * 2018 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> triển của khối u(1). Sự xâm lấn thành tử cung của 2. Dar P, Curnow KJ., Gross SJ. et al. (2014). Clinical experience<br /> and follow-up with large scale single-nucleotide<br /> lớp nuôi phôi và lớp hợp bào có nhiều sự tương polymorphismebased noninvasive prenatal aneuploidy testing.<br /> quan với quá trình xâm lấn mạch và di căn trong Am J Obstet Gynecol, 211(5):527.e1-527.e17.<br /> 3. Grunau C., Clark SJ., and Rosenthal A. (2001). Bisulfite genomic<br /> ung thư, quá trình chuyển dạng tế bào EMT<br /> sequencing: systematic investigation of critical experimental<br /> (epithelial mesenchymal transition). parameters. Nucleic Acids Res, 29(13), e65–e65.<br /> 4. Lo YD., Chan KA., Sun H. et al. (2010). Maternal plasma DNA<br /> Nghiên cứu xác định được sự hiện diện của<br /> sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational<br /> DNA thai tự do trong huyết tương máu mẹ thông profile of the fetus. Sci Transl Med, 2(61), 61ra91–61ra91.<br /> quá sự methyl hoá của gen RASSF1A bằng 5. Lo YD., Corbetta N., Chamberlain PF et al. (1997). Presence of<br /> fetal DNA in maternal plasma and serum. The lancet, 350(9076),<br /> phương pháp MSP kết hợp tạo dòng và giải trình 485–487.<br /> tự. Ngoài ra, trong tương lai ứng dụng marker 6. Lo YD., Zhang J., Leung TN et al (1999). Rapid clearance of fetal<br /> RASSF1A trong sàng lọc nhóm máu RhD và các DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet, 64(1), 218–224.<br /> 7. Poon LL., Leung TN., Lau TK. et al (2002). Differential DNA<br /> bất thường di truyền cho phép phát hiện được các methylation between fetus and mother as a strategy for<br /> kết quả âm tính giả gây ra bởi hàm lượng cffDNA detecting fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem, 48(1), 35–41.<br /> 8. Suzumori N, Ebara T, Yamada T et al (2016). Fetal cell-free DNA<br /> thấp hoặc thất thoát trong quá trình xử lí mẫu.<br /> fraction in maternal plasma is affected by fetal trisomy. J Hum<br /> KẾT LUẬN Genet, 61(7), 647.<br /> 9. Zimmermann B, El-Sheikhah A, Nicolaides K. et al. (2005).<br /> Nghiên cứu đã khuếch đại thành công Optimized real-time quantitative PCR measurement of male<br /> fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem, 51(9), 1598–1604.<br /> cffDNA trong máu mẹ, tạo dòng được đoạn<br /> DNA thai và DNA mẹ vào trong vector và chứng<br /> Ngày nhận bài báo: 21/06/2018<br /> minh được sự hiện diện của cffDNA trong máu<br /> mẹ bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21/06/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/06/2018<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO.<br /> 1. Chiu RW., Chim SS., Wong IH. et al. (2007). Hypermethylation<br /> of RASSF1A in human and rhesus placentas. Am J Pathol, 170(3),<br /> 941–950.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 375<br />