Xác định tình trạng alen HLA-B5801 ở bệnh nhân gút (thống phong) bằng real-time PCR

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> XÁC ĐỊNH TÌNH TRẠNG ALEN HLA-B5801<br /> Ở BỆNH NHÂN GÚT (THỐNG PHONG)BẰNG REAL-TIME PCR<br /> Bùi Nguyễn Nhật Minh*, Nguyễn Thị Hà Giang*, Đỗ Thị Thanh Thủy*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Bệnh gút (thống phong) là bệnh lý viêm khớp xảy ra khi acid uric tích tụ quá nhiều trong máu, dẫn<br /> đến sự lắng đọng các tinh thể muối của acid uric là urate trong một số tổ chức, đặc biệt là màng hoạt dịch khớp,<br /> sụn xương, gân, tổ chức dưới da, nhu mô thận và đài bể thận khớp. Các tinh thể urate này còn có thể gây ra sỏi<br /> thận. Allopurinol là thuốc điều trị gút phổ biến hiện nay nhằm làm giảm acid uric trong máu. Tuy nhiên,<br /> allopurinol cũng là một trong các nguyên nhân gây ra các phản ứng quá mẫn nguy hiểm như phát ban tróc vảy,<br /> hội chứng Stevens-Johnson (SJS), và hoại tử da nhiễm độc (TEN). Các phản ứng này có thể dẫn đến tử vong và<br /> thường gặp ở các bệnh nhân mang alen HLA-B5801. Nghiên cứu này xác định tình trạng alen HLA-B5801 ở các<br /> bệnh nhân gút trước khi sử dụng allopurinol nhằm giảm thiểu nguy cơ gặp phải phản ứng quá mẫn và SJS/TEN.<br /> Mục tiêu: Hoàn thiện phản ứng real-time PCR và ứng dụng trong việc xác định tình trạng HLA-B5801 ở<br /> các bệnh nhân gút trước khi điều trị allopurinol.<br /> Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên các bệnh nhân nghi ngờ bị bệnh gút được chẩn đoán dựa vào<br /> triệu chứng lâm sàng. Thu nhận mẫu máu chứa EDTA, tách chiết DNA từ máu bệnh nhân, thực hiện kỹ thuật<br /> real-time PCR, và phân tích kết quả xác định tình trạng HLA-B5801.<br /> Kết quả: Trong tổng số 36 mẫu bệnh nhân, 2 bệnh nhân dương tính với HLA-B5801 (5,6%), 34 bệnh nhân<br /> còn lại âm tính (94,4%).<br /> Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện phản ứng real-time PCR và ứng dụng để xác định tình trạng HLA-B5801.<br /> Từ khoá: Thống phong, Allopurinol, HLA-B5801, real-time PCR.<br /> ABSTRACT<br /> DETERMINATION OF THE HLA-B5801 STATUS IN GOUT PATIENTS BY REAL-TIME PCR<br /> Bui Nguyen Nhat Minh, Nguyen Thi Ha Giang, Do Thị Thanh Thuy<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 287 - 290<br /> <br /> Introduction: Gout is a monosodium urate crustal deposistion disease. Allopurinol is the most common<br /> drug used to treat gout. However, it might cause the potentially fatal allopurinol hypersensitivity syndrome,<br /> which presents with SJS and TEN, to name a few. Allopurinol-users with HLA-B5801 tend to have a higher risk<br /> of developing SJS/TEN. This study focuses on determining HLA-B5801 status in gout patients, which plays an<br /> important role in the treatment of gout.<br /> Objective: To evaluate the determination of HLA-B5801 status in gout patients before treatment with<br /> allopurinol using real-time PCR.<br /> Method: Use Ct values and melting curve analysis of real-time PCR to determine HLA-B5801 status in<br /> gout patients.<br /> Results: Out of the 36 patients tested for HLA-B5801, 2 were positive for HLA-B5801 (5.6%), and 34 were<br /> negative (94.4%).<br /> <br /> <br /> * Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Tp. HCM<br /> Tác giả liên lạc: CN. Bùi Nguyễn Nhật Minh ĐT: 01228254201; Email: minhnnbui@gmail.com<br /> <br /> Tim Mạch 287<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> Conclusion: Our research has successfully applied real-time PCR in determining HLA-B5801 status.<br /> Key words: Gout, Allopurinol, HLA-B5801, real-time PCR.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Y<br /> Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM.<br /> Kháng nguyên bạch cầu người – Human<br /> Leukocyte Antigen (HLA) đóng một vai trò Tách chiết genomic DNA từ mẫu máu: Mẫu<br /> quan trọng trong khả năng nhận diện các chất lạ máu được xử lý trong vòng 24 giờ. Genomic<br /> trong cơ thể của hệ miễn dịch(2). Một số HLA đã DNA được tách chiết bằng bộ Illustra blood<br /> được nhận dạng là có liên quan tới một số dạng genomicPrep Mini Spin kit (GE Healthcare, Anh)<br /> bệnh hoặc phản ứng cụ thể. Một trong số đó là theo hướng dẫn của nhà sản xuất.<br /> HLA-B5801 và phản ứng quá mẫn nguy hiểm ở Quy trình real-time PCR: Thực hiện 2 phản<br /> các bệnh nhân sử dụng thuốc allopurinol để điều ứng real-time PCR bằng bộ PG5801 Detection Kit<br /> trị bệnh gút(3). (Pharmigene, Inc., Đài Loan) cho mỗi mẫu thí<br /> Allopurinol là một loại thuốc ức chế xanthin- nghiệm. Một phản ứng sẽ khuếch đại alen HLA-<br /> oxydase, là một enzyme thoái hóa hypoxanthin B5801, phản ứng còn lại sẽ khuếch đại một gene<br /> thành xanthin và xanthin thành acid uric và làm chứng nội.<br /> giảm cả sinh tổng hợp purine, thuốc được sử Phân tích kết quả real-time PCR<br /> dụng trong điều trị tăng acid uric máu một cách Bảng 1. Cách phân tích kết quả real-time PCR (dựa<br /> rộng rãi(3). Tuy nhiên, allopurinol cũng là một trên bộ PG5801 Detection Kit của Pharmigene, Inc.)<br /> trong các nguyên nhân gây phản ứng quá mẫn Mẫu Ct ≤ 7 Dương tính<br /> Chứng nội<br /> nguy hiểm như phát ban tróc vảy, hội chứng Ct ≤ 35 Ct > 7 Âm tính<br /> Ct ≤ 27<br /> Stevens-Johnson (SJS), và hoại tử da nhiễm độc Mẫu Ct > 35 Âm tính<br /> (TEN)(9). Nguy cơ tử vong khi gặp phải các phản Chứng nội Phản ứng PCR bị ức chế<br /> Chạy lại mẫu<br /> Ct > 27 Không đủ lượng DNA<br /> ứng này có thể cao tới 27%(1, 7).<br /> Kết quả real-time PCR được phân tích sử<br /> Nhiều nghiên cứu đã cho thấy nguy cơ gặp<br /> dụng chương trìnhEppendorf Mastercycler ep<br /> phải các phản ứng quá mẫn nguy hiểm này tăng<br /> realplex (Eppendorf, Đức) và dựa vào hai giá trị,<br /> lên gấp 80-97 lần ở những bệnh nhân mang alen<br /> chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) và nhiệt độ<br /> HLA-B5801 so với những bệnh nhân không có<br /> nóng chảy (Tm, melting point). Ct thể hiện số chu<br /> alen này(3, 10). Tần số xuất hiện của alen này cao<br /> kỳ mà tại đó sản phẩm khuếch đại được phát<br /> nhất ở các nước trong khu vực Đông Nam Á (6-<br /> hiện nhờ sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang.<br /> 8%)(8). Thống kê tại Đài Loan, Thái Lan, Nhật<br /> Melting point là nhiệt độ nóng chảy của một<br /> Bản, và Hàn Quốc đã cho thấy mối liên kết mạnh<br /> đoạn DNA khi 50% lượng DNA đã bị biến tính.<br /> mẽ giữa các bệnh nhân có alen HLA-B5801 và<br /> Melting point thể hiện độ đặc hiệu của phản ứng<br /> tình trạng phản ứng quá mẫn, SJS/TEN(3, 5, 6, 11).<br /> khuyếch đại dựa vào nhiệt độ nóng chảy đặc<br /> ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU hiệu của từng sản phẩm PCR.Mỗi mẫu thí<br /> Đối tượng nghiên cứu nghiệm sẽ cho 2 giá trị Ct, một từ alen HLA-<br /> B5801 và một từ chứng nội, từ hai giá trị trên, giá<br /> Bệnh nhân nghi ngờ bị bệnh gút tại bệnh<br /> trị delta Ct (Ct = CtB5801 – CtChứng nội). Phương<br /> viện Đại học Y dược từ 1/2015 cho đến 9/2015.<br /> pháp phân tích dựa trên giá trị Ct được nêu<br /> Phương pháp nghiên cứu trong bảng 1.<br /> Thu nhận 2 ml máu chứa chất chống đông<br /> EDTA của các bệnh nhân bị bệnh gút.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 288 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Đặc điểm của nhóm nghiên cứu:<br /> Bảng 2. Đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu.<br /> Đặc điểm Tổng (n=36)<br /> Tuổi trung bình (phạm vi giao động) 45,5(23-78)<br /> Giới Nam/nữ (% nam) 35/1 (97,2%)<br /> HLA-B5801 (+) 2 (nam)<br /> <br /> Kết quả real-time PCR<br /> Để xác định tình trạng HLA-B5801 ở bệnh<br /> nhân, chúng tôi đã tiến hành real-time PCR sử<br /> dụng thuốc nhuộm SYBR Green I. Hình 1 cho Hình 2. Kết quả melting curve mẫu HLA-B5801 (+).<br /> thấy kết quả real-time PCR của một bệnh nhân Ngày nay, khoa học đã thừa nhận HLA-<br /> dương tính HLA-B5801. Hình 2 cho thấy kết quả B5801 chính là một trong những dấu ấn di<br /> melting curve của chứng nội và mẫu HLA-B5801 truyền dự báo các tác hại nghiêm trọng trên da<br /> dương tính. khi sử dụng allopurinol và đưa ra khuyến cáo về<br /> việc xác định tình trạng alen HLA-B5801 trước<br /> khi tiến hành điều trị với allopurinol (4). Chính vì<br /> vậy, xét nghiệm HLA-B5801 cần phải được thực<br /> hiện trước khi dùng allopurinol, đặc biệt ở các<br /> bệnh nhân Đông Nam Á(3). Nếu bệnh nhân có<br /> alen HLA-B5801 thì sẽ được các bác sĩ tư vấn sử<br /> dụng thuốc thay thế hoặc theo dõi chặt chẽ và<br /> thay đổi liều lượng thuốc allopurinol phù hợp<br /> nhằm giảm thiểu nguy cơ xảy ra phản ứng quá<br /> mẫn nguy hiểm.<br /> Phương pháp real-time PCR để xác định<br /> Hình 1. Real-time PCR của mẫu HLA-B5801 (+). HLA-B5801 sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green I<br /> BÀN LUẬN và phân tích melting curve là một phương pháp<br /> đơn giản và không cần sử dụng đoạn dò đặc<br /> Bệnh gút là bệnh lý viêm khớp xảy ra khi<br /> hiệu. Melting curve sử dụng melting point, là<br /> acid uric tích tụ quá nhiều trong máu. Việc này<br /> nhiệt độ nóng chảy của một đoạn DNAkhi 50%<br /> dẫn đến sự lắng đọng các tinh thể urat natri<br /> lượng DNA đã bị biến tính. Nhiệt độ nóng chảy<br /> trong một số tổ chức, đặc biệt là màng hoạt dịch<br /> thể hiện độ đặc hiệu của phản ứng khuếch đại<br /> khớp, sụn xương, gân, tổ chức dưới da, nhu mô<br /> dựa vào nhiệt độ nóng chảy đặc hiệu của từng<br /> thận và đài bể thận khớp. Bệnh thường xuất hiện<br /> sản phẩm PCR. Vì thế, việc phân tích melting<br /> nhiều ở nam hơn so với nữ(12). Phương pháp<br /> curve là một bước để khẳng định kết quả real-<br /> chữa trị gút chủ yếu tập trung vào việc làm giảm<br /> time PCR của HLA-B5801 vì nó thể hiện nhiệt độ<br /> và duy trì lượng acid uric ở dưới mức nguy<br /> nóng chảy đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại<br /> hiểm, giúp cho các tinh thể muối urat phân huỷ.<br /> HLA-B5801 và nhiệt độ nóng chảy của chứng<br /> Ngoài việc dùng thuốc làm tăng đào thải acid<br /> nội, giúp cho việc khẳng định kết quả dương<br /> uric niệu, người ta dùng allopurinol để ức chế<br /> tính và âm tính chắc chắn hơn. Ngoài ra, đây là<br /> sinh tổng hợp acid uric.<br /> phương pháp hữu dụng trong việc phòng ngừa<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tim Mạch 289<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> khả năng ngoại nhiễm sản phẩm PCR được 3. Hershfield MS, Callaghan JT, Tassaneeyakul W, Mushiroda T,<br /> Thorn CF, Klein TE, Lee MTM (2012). Clinical pharmacogenetics<br /> khuếch đại. implementation consortium guidelines for human leucocyte<br /> Dựa vào giá trị Ct và phân tích đường cong antigen-B genotype and Allopurinol dosing. Clin Phaarmacol<br /> Ther, 93: 153-158.<br /> nóng chảy cho sản phẩm PCR đặc hiệu với gen 4. Hung SI, Chung WH, Liou LB, Chu CC, et. al (2005). HLA-<br /> HLA-B5801 và sản phẩm khuếch đại của chứng B*5801 allele as a genetic marker for severe cutaneous adverse<br /> reactions caused by allopurinol. Proc Natl Acad Sci U.S.A, 102:<br /> nội, các mẫu HLA-B5801 dương tính có melting<br /> 4134-4139.<br /> point 88,85±0,35°C, trong khi các mẫu chứng nội 5. Kang HR, Jee YK, Kim YS, Lee CH, Jung JW, et al (2011).<br /> có melting point 81,60±0,34°C. Các kết quả này Positive and negative associations of HLA class I alleles with<br /> allopurinol-induced SCARS in Koreans. Pharmacogenet Genomics,<br /> cho thấy độ đặc hiệu của bộ kit với alen HLA- 21: 303-307.<br /> B5801 và chứng nội. Bộ kít này cho kết quả 2 6. Kaniwa N, Saito Y, Aihara M, Matsunaga K, et al (2008). HLA-B<br /> mẫu HLA-B5801 dương (5,6%), và 34 mẫu HLA- locus in Japanese patients with anti-epileptics and allopurinol-<br /> related Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal<br /> B5801 âm (94,4%). necrolysis. Pharmacogenomics, 9: 1617-1622.<br /> Thực hiện xét nghiệm HLA-B5801 sẽ giúp 7. McInnes GT, Lawson DH, Jick H (1981). Acute adverse reactions<br /> attributed to allopurinol in hospitalised patients. Ann Rheum Dis,<br /> bác sĩ đề ra phương hướng điều trị bệnh gút 40: 245-249.<br /> hiệu quả nhất cho bệnh nhân và tránh được các 8. Middleton D, Menchaca L, Rood H, Komerofsky R (2003). New<br /> allele frequency database. Tissue Antigens, 61: 403-407.<br /> phản ứng phụ của thuốc.<br /> 9. Mockenhaupt M, Viboud C, Dunant A, et al (2008). Stevens-<br /> KẾT LUẬN Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: assessment of<br /> medication risks with emphasis on recently marketed drugs.<br /> Nghiên cứu đã thành công trong việc sử The EuroSCAR-study. J Invest Dematol, 128: 35-44.<br /> 10. Somkrua R, Eickman EE< Saokaew S, Lohitnavy M,<br /> dụng phương pháp real-time PCR trong việc xác Chaiyakunapruk N (2011). Association of HLA-B*5801 allele<br /> định HLA-B5801 ở các bệnh nhân bịgút. Ứng and allopurinol induced stevens johnson syndrome and toxic<br /> dụng kỹ thuật này trước khi cho bệnh nhân sử epidermal necrolysis: a systematic review and metaanalysis.<br /> BMC Med Genet, 12: 118.<br /> dụng alluporinol sẽ tránh hoặc giảm nhẹ được 11. Tassaneeyakul W, Jantararoungtong T, Chen P, Lin PY, et al<br /> các phản ứng quá mẫn nguy hiểm, đồng thời (2009). Strong association between HLA-B*5801 and allopurinol-<br /> induced Stevens—Johnson syndrome and toxic epidermal<br /> giúp đưa ra phương pháp và liều lượng thuốc<br /> necrolysis in a Thai population. Pharmacogenet Genomics, 19: 704-<br /> điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân. 709.<br /> 12. Yeo SI (2013). HLA-B*5801: utility and cost-effectiveness in the<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO Asia-Pacific Region. Int J Rheum Dis, 16: 254-257.<br /> 1. Arellano F, Sacristan J (1993). Allopurinol hypersensitivity<br /> syndrome: a review. Ann Pharmacother, 27: 337-343.<br /> 2. Fan W, Huang L, Zhou Z, Zeng X, Li G, Deo P, Hu L, Li Y Ngày nhận bài báo: 20/11/2015<br /> (2012). Rapid and reliable genotyping of HLA-B*27 in the<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 27/11/2015<br /> Chinese Han population using a duplex real-time TaqMan PCR<br /> assay. Clin Biochem, 45: 106-111. Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 290 Chuyên Đề Nội Khoa I<br />