Xây dựng cơ sở dữ liệu để phân biệt các loại sâm bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU ĐỂ PHÂN BIỆT CÁC LOẠI SÂM<br /> BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Hoàng Hải Anh*, Nguyễn Minh Cang*, Nguyễn Minh Đức*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Phân biệt các loại sâm thuộc chi Panax gồm Nhân sâm, Tam thất, Sâm Mỹ và Sâm Việt Nam<br /> dựa vào sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).<br /> Phương pháp: So sánh sự khác nhau trong thành phần saponin chính của các dược liệu nghiên cứu bằng<br /> sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> Kết quả: Có sự khác biệt trong thành phần các saponin chính của các loại sâm khi tiến hành SKLM và<br /> HPLC cả về mặt định tính và định lượng. Từ đó có cơ sở để phân biệt các dược liệu trên: Sâm Việt Nam phân<br /> biệt với các dược liệu Panax khác do có chứa M-R2; Tam thất phân biệt với các dược liệu Panax khác do có chứa<br /> nhiều N-R1 (nhiều hơn Sâm Việt Nam), nhưng không chứa MR2; Nhân sâm và Sâm Mỹ có thành phần saponin<br /> khá giống nhau, khác nhau chủ yếu ở thành phần các saponin hàm lượng thấp.<br /> Kết luận: Bằng phương pháp SKLM và HPLC có thể phân biệt được một số loại sâm thuộc chi Panax một<br /> cách nhanh chóng và chính xác.<br /> Từ khóa: Nhân Sâm, Tam thất, Sâm Mỹ, Sâm Việt Nam, Sắc ký lớp mỏng, Sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON TLC AND HPLC DATA FOR PANAX SPP. DIFFERENTIATION<br /> Hoang Hai Anh, Nguyen Minh Cang, Nguyen Minh Duc<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 574 - 578<br /> Objectives: To distinguish Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium and Panax<br /> vietnamensis by Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC).<br /> Methods: Analysis of the difference in the saponin composition of Panax ginseng, Panax notoginseng,<br /> Panax quinquefolium and Panax vietnamensis by TLC and HPLC.<br /> Results: There are differences in the saponin composition of Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax<br /> quinquefolium, Panax vietnamensis and Panax vietnamensis. Panax vietnamensis is distinct from the others<br /> because it contains the major saponin M-R2; Panax notoginseng differs from the others due the major saponin NR1 in high contents; the saponin composition of Panax ginseng and Panax quinquefolium are different in the<br /> minor saponins.<br /> Conclusions: Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium and Panax vietnamensis can be<br /> differentiated by using the TLC and HPLC.<br /> Keywords: Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium, Panax vietnamensis, TLC, HPLC.<br /> nhiều trong việc bảo vệ, chăm sóc sức khỏe và<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> điều trị bệnh(4). Ngày nay, các loại Sâm không<br /> Các loại sâm, gồm các loài thuộc chi Panax là<br /> những được sử dụng ở dạng kinh điển mà còn<br /> những dược liệu kinh điển và nổi tiếng của y<br /> được bào chế dưới dạng tân dược. Sâm Triều<br /> học cổ truyền Đông phương, được sử dụng<br /> tiên (P. ginseng CA. Mayer), Tam thất (P.<br /> *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM<br /> Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức<br /> <br /> 574<br /> <br /> ĐT: 0908989865<br /> <br /> Email: ducng@hcm.vn.vnn<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> notoginseng (Burk.) F.H. Chen), Sâm Mỹ (P.<br /> quinquefolium L.) và Sâm Việt Nam (P.<br /> vietnamensis Ha et Grushv.) là các loại sâm có giá<br /> trị kinh tế cao và phổ biến nhất.<br /> Các nguyên liệu và các chế phẩm từ các loài<br /> sâm xâm nhập vào thị trường nước ta từ rất<br /> nhiều nguồn như: Trung Quốc, Hàn Quốc, các<br /> nước châu Âu,… chính thức cũng như không<br /> chính thức, có thành phần và hàm lượng của<br /> saponin, một hoạt chất quan trọng của các mẫu<br /> dược liệu Panax thay đổi rất nhiều. Đặc biệt, thị<br /> trường dược liệu nước ta hiện nay đang tràn<br /> ngập các loại sâm không rõ nguồn gốc gây ra<br /> nhiều khó khăn cho sử dụng các dược liệu Panax<br /> này.Vì những lý do trên, việc xác định và phân<br /> biệt rõ ràng các dược liệu Panax là hết sức cần<br /> thiết và thực tế.<br /> Đề tài này nhằm nghiên cứu phân biệt Sâm<br /> Triều tiên, Tam thất, Sâm Mỹ và Sâm Việt Nam<br /> bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký lỏng<br /> hiệu năng cao (HPLC)(1,3).<br /> <br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Nguyên liệu<br /> Cao khô Nhân sâm, cao khô Tam thất, rễ củ<br /> Sâm Mỹ, rễ củ Sâm Việt Nam được lấy mẫu, thu<br /> mua từ các nguồn tin cậy. Các mẫu sâm được<br /> lưu mẫu tại Ban NCKH-TV Khoa Dược<br /> Các saponin chuẩn G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, GRe, N-R1, M-R2 do Ban NCKH-TV sản xuất theo<br /> TCCS từ các nghiên cứu công trình trước đây<br /> với độ tinh khiết sắc ký > 97%.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Chiết xuất saponin<br /> Các mẫu sâm được chiết kiệt hoạt chất bằng<br /> thiết bị Soxhlet với dung môi chiết là methanol.<br /> Dịch chiết được đem bốc hơi dung môi để thu<br /> cắn MeOH.<br /> Tinh chế saponin<br /> Quá trình tinh chế được thực hiện bằng<br /> phương pháp rửa giải qua cột Diaion HP-20 với<br /> các dung môi là nước, MeOH, và CHCl3. Gom<br /> dịch chiết MeOH, bốc hơi, thu được cắn saponin<br /> toàn phần tinh chế.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Định tính bằng SKLM<br /> Điều kiện sắc ký<br /> Bản mỏng tráng sẵn silicagel F254.<br /> Dung dịch sắc ký: các chất chuẩn G-Rb1, GRg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 và các saponin<br /> toàn phần pha trong MeOH.<br /> Hệ dung môi: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10,<br /> lớp dưới).<br /> Thuốc thử hiện màu: H2SO4 20%/EtOH 50%,<br /> sấy 105oC đến khi hiện màu.<br /> <br /> Phân tích thành phần các mẫu dược liệu<br /> Panax bằng HPLC<br /> Chuẩn bị dung dịch chuẩn<br /> Cân chính xác một lượng chất chuẩn mỗi<br /> loại G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 hòa tan<br /> trong một lượng chính xác methanol, riêng MR2 hòa tan trong pha động sắc ký.<br /> Pha dung dịch thử<br /> Cân chính xác gần đúng một lượng cắn<br /> saponin của các mẫu sâm, hòa tan trong một<br /> lượng chính xác methanol. Lọc qua lọc 0,45 µm,<br /> dùng dung dịch này tiến hành phân tích trên<br /> HPLC.<br /> Điều kiện sắc ký<br /> - Máy LC-10 AD – Shimadzu, Nhật Bản, cột<br /> Supelcosil RP-18 (150 x 4,6 mm, 5,0 µm) kèm<br /> theo cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm)<br /> - Detector: photodiode array (SPD-M10A VP<br /> – Shimadzu, Nhật Bản) đặt ở bước sóng 203 nm<br /> đối với hệ dung môi (i) và (ii); RI đối với hệ<br /> dung môi (iii) để phát hiện M-R2.<br /> - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.<br /> Tiến hành HPLC với 3 hệ dung môi: (i)<br /> CH3CN-H2O (30: 70); (ii) CH3CN-H2O (20: 80); và<br /> (iii) CH3CN-H2O (24: 76). Hệ dung môi (iii) chỉ áp<br /> dụng để phân tích và xác định M-R2 trong Sâm<br /> Việt Nam. Xác định các đỉnh dựa vào thời gian lưu<br /> so với đỉnh các saponin chuẩn chạy trong cùng<br /> điều kiện. Xác định hàm lượng của từng thành<br /> phần các saponin chính trong dung dịch thử dựa<br /> vào các phương trình đường chuẩn.<br /> <br /> 575<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Kết quả phân tích bằng HPLC<br /> <br /> Kết quả phân tích bằng SKLM<br /> <br /> Kết quả định tính<br /> Hệ dung môi (i): CH3CN-H2O (30: 70)<br /> <br /> Hình 2. Sắc ký đồ HPLC của Sâm Việt Nam với hệ<br /> dung môi CH3CN-H2O (30:70) (Detector PDA; thời<br /> gian lưu Rt của G-Rb1 và G-Rd lần lượt là 20,3 và<br /> 48,4 phút)<br /> Bảng 2. Kết quả HPLC phát hiện G-Rb1 và G-Rd<br /> Mẫu<br /> <br /> Hình 1. Sắc đồ SKLM saponin các mẫu sâm so sánh<br /> với các chất chuẩn<br /> NS: Nhân sâm; TT: Tam thất; SM: Sâm Mỹ; SVN: Sâm<br /> Việt Nam<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả SKLM saponin các mẫu sâm<br /> Rf<br /> G-Rb1<br /> G-Re<br /> N-R1<br /> G-Rd<br /> G-Rg1<br /> M-R2<br /> <br /> 0,22<br /> 0,30<br /> 0,32<br /> 0,35<br /> 0,44<br /> 4,48<br /> <br /> Nhân<br /> Sâm<br /> x<br /> x<br /> o<br /> x<br /> x<br /> o<br /> <br /> Sâm Mỹ Tam thất Sâm Việt Nam<br /> x<br /> x<br /> o<br /> x<br /> x<br /> o<br /> <br /> x<br /> x<br /> x<br /> x<br /> x<br /> o<br /> <br /> x<br /> x<br /> x<br /> x<br /> x<br /> x<br /> <br /> Thời gian lưu (phút)<br /> G-Rb1<br /> <br /> G-Rd<br /> <br /> Chất chuẩn<br /> <br /> 20,1<br /> <br /> 48,2<br /> <br /> Nhân Sâm<br /> <br /> 20,4<br /> <br /> 48,5<br /> <br /> Sâm Mỹ<br /> <br /> 20,5<br /> <br /> 48,2<br /> <br /> Tam thất<br /> <br /> 20,2<br /> <br /> 48,1<br /> <br /> Sâm Việt Nam<br /> <br /> 20,3<br /> <br /> 48,4<br /> <br /> Nhận xét: 4 mẫu sâm khảo sát đều chứa GRb1 và G-Rd.<br /> Hệ dung môi (ii): CH3CN-H2O (20: 80)<br /> <br /> x: có xuất hiện vết; o: không xuất hiện vết.<br /> <br /> Các mẫu sâm khảo sát cho các vết sắc ký đặc<br /> trưng của mỗi loại, phù hợp về màu sắc cũng<br /> như kích thước vết, có giá trị Rf bằng với Rf của<br /> vết chuẩn tương ứng trên bản mỏng, thể hiện<br /> trong Hình 1 và Bảng 1.<br /> <br /> Nhận xét<br /> Trong các mẫu khảo sát, chỉ có Sâm Việt<br /> Nam có M-R2. N-R1 chỉ quan sát được trên sắc<br /> ký đồ Tam thất và Sâm Việt Nam.<br /> <br /> 576<br /> <br /> Hình 3. Sắc ký đồ HPLC của Sâm Việt Nam với hệ<br /> dung môi CH3CN-H2O (20:80) (Dtector PDA; thời<br /> gian lưu Rt của G-Rg1 và G-Re lần lượt là 30,5 và<br /> 33,1 phút)<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> Bảng 3. Kết quả HPLC phát hiện G-Rg1 và G-Re<br /> Mẫu<br /> Chất chuẩn<br /> Nhân Sâm<br /> Sâm Mỹ<br /> Tam thất<br /> Sâm Việt Nam<br /> <br /> Thời gian lưu (phút)<br /> G-Re<br /> G-Rg1<br /> 30,0<br /> 33,0<br /> 30,0<br /> 32,9<br /> 30,0<br /> 33,0<br /> 30,1<br /> 33,1<br /> 30,5<br /> 33,1<br /> <br /> Hình 4. Sắc ký đồ HPLC của Sâm Việt Nam với hệ<br /> dung môi CH3CN-H2O (24:76) (Detector RI; thời<br /> gian lưu Rt của M-R2 là 15,0 phút)<br /> Bảng 5. Thời gian lưu của M-R2<br /> Mẫu<br /> Chuẩn M-R2<br /> Sâm Việt Nam<br /> <br /> Nhận xét: 4 mẫu sâm khảo sát đều chứa GRb1 và G-Re.<br /> Bảng 4. Thời gian lưu của N-R1<br /> Mẫu<br /> Chuẩn NR1<br /> Tam thất<br /> Sâm Việt Nam<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Thời gian lưu (phút)<br /> 22,3<br /> 22,4<br /> 22,8<br /> <br /> Nhận xét: Chỉ phát hiện được N-R1 trong<br /> Tam thất và Sâm Việt Nam<br /> Hệ dung môi (iii): CH3CN-H2O (24: 76)<br /> <br /> Thời gian lưu (phút)<br /> 15,0<br /> 15,0<br /> <br /> Nhận xét: Chỉ phát hiện được M-R2 trong<br /> Sâm Việt Nam.<br /> Qua kết quả phân tích cho thấy, với 3 hệ<br /> dung môi cùng điều kiện sắc ký phù hợp, các<br /> mẫu sâm đều cho các đỉnh đặc trưng của mỗi<br /> loài, các đỉnh này có thời gian lưu phù hợp<br /> với thời gian lưu của chất chuẩn tương ứng.<br /> Dựa vào sự khác nhau trong sắc ký đồ của<br /> mỗi loại sâm có thể phân biệt được chúng<br /> một cách rõ ràng:<br /> - Sâm Việt Nam cho đỉnh của M-R2 đặc<br /> trưng trên sắc ký đồ khi tiến hành HPLC với<br /> detector RI, trong khi các mẫu sâm khác khác<br /> không có.<br /> - Tam thất cho đỉnh N-R1 đặc trưng trong<br /> khi Nhân Sâm và Sâm Mỹ không có.<br /> - Nhân Sâm và Sâm Mỹ cho các đỉnh đặc<br /> trưng khá giống nhau, nhưng có sự khác nhau<br /> về cường độ đỉnh.<br /> <br /> Kết quả định lượng<br /> Bảng 6. Kết quả định lượng các saponin chính trong các dược liệu Panax khảo sát<br /> Mẫu<br /> Nhân Sâm<br /> Tam thất<br /> Sâm Mỹ<br /> Sâm VN<br /> <br /> G-Rb1<br /> 0,27<br /> 3,14<br /> 1,85<br /> 2,51<br /> <br /> G-Rg1<br /> 0,11<br /> 2,06<br /> 0,11<br /> 2,57<br /> <br /> Hàm lượng saponin chính (%)<br /> G-Rd<br /> G-Re<br /> N-R1<br /> 0,06<br /> 0,07<br /> o<br /> 0,52<br /> 0,26<br /> 1,03<br /> 0,57<br /> 0,80<br /> o<br /> 1,22<br /> 0,16<br /> 0,53<br /> <br /> M-R2<br /> o<br /> o<br /> o<br /> 5,97<br /> <br /> Tổng cộng<br /> 0,51<br /> 6,53<br /> 3,34<br /> 12,96<br /> <br /> o: không phát hiện pic<br /> <br /> Kết quả phân tích cho thấy:<br /> - Nhân Sâm có chứa các ginsenosid đặc<br /> trưng G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, trong đó G-Rb1<br /> và G-Rg1 chiếm tỷ lệ cao trong thành phần<br /> saponin. Tuy nhiên, tổng hàm lượng ginsenosid<br /> chính thấp (0,51%), có thể do chất lượng mẫu<br /> sâm khảo sát. Không phát hiện được N-R1 và<br /> M-R2 trong mẫu Nhân sâm khảo sát.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> - Tam thất có chứa các saponin đặc trưng GRb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, trong đó G-Rb1,<br /> G-Rg1 và N-R1 chiếm tỷ lệ cao trong thành phần<br /> saponin. N-R1 là saponin đặc trưng của Tam<br /> thất so với các dược liệu Panax khác. N-R1 cũng<br /> phát hiện trong Sâm Việt Nam tỷ lệ khá cao,<br /> nhưng có thể phân biệt với Tam thất vì Tam thất<br /> <br /> 577<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> không chứa M-R2. Tổng hàm lượng saponin<br /> chính khá cao (6,53%).<br /> - Sâm Mỹ có chứa các ginsenosid đặc trưng<br /> G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re với tỷ lệ cao trong<br /> thành phần saponin. Đặc biệt, Sâm Mỹ có tỷ lệ<br /> G-Re cao hơn hẳn các mẫu sâm khác.<br /> - Sâm Việt Nam có chứa các saponin đặc<br /> trưng G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 với<br /> tỷ lệ cao trong thành phần saponin. Đặc biệt, MR2 là saponin đặc trưng của Sâm Việt Nam,<br /> không có trong các mẫu sâm đã khảo sát khác.<br /> Tổng hàm lượng saponin chính trong Sâm Việt<br /> Nam cao nhất trong các mẫu sâm khảo sát (~<br /> 13%), trong đó hàm lượng M-R2 chiếm hơn<br /> phân nửa (~ 7%), phù hợp với các công trình<br /> nghiên cứu trước đây(1).<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> gồm Sâm Triều tiên, Tam thất, Sâm Mỹ và Sâm<br /> Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở<br /> dữ liệu giúp phân biệt các loài sâm nói trên và<br /> các chế phẩm của chúng.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> N. M. Duc, N. T. Nham, R. Kasai, A. Ito, K. Yamasaki and O.<br /> Tanaka (1993), Saponins from Vietnamese ginseng, Panax<br /> vietnamensis Ha et Grushv., Chem. Pharm. Bull., 41, 2010.<br /> Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một<br /> số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược<br /> liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y học, Chi nhánh Tp. HCM,<br /> tr.49-126, tr.218-232.<br /> Nguyen Minh Duc, Nguyen Minh Cang, Nguyen Duc Dieu<br /> Trang (2001), “Quantitative determination of major saponin<br /> contents of cultivated vietnamese ginseng – Panax<br /> vietnamensis Ha et Grushv.-Araliaceae- by HPLC”, Proceedings<br /> of Pharma Indochina II,20-23 November, 2001, Hanoi, Vietnam,<br /> 247-251.<br /> Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt<br /> Nam, Tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.446-455,<br /> tr.704-710, tr.775-779.<br /> <br /> Phương pháp SKLM và HPLC giúp phân<br /> biệt được các mẫu sâm có giá trị và phổ biến<br /> <br /> 578<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br />