Xây dựng qui trình evagreen real‐time PCR phát hiện các gen blaoxa ở acinetobacter baumannii

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG QUI TRÌNH EVAGREEN REAL‐TIME PCR  <br /> PHÁT HIỆN CÁC GEN blaOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII <br /> Nguyễn Tuấn Anh*, Huỳnh Minh Tuấn**, Nguyễn Văn Vĩnh Châu***, Hồ Huỳnh Thùy Dương*,**** <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Đặt vấn đề: Acinetobacter baumannii là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu vì tính <br /> đa kháng thuốc của chúng. Đặc biệt, A. baumannii sở hữu gene  blaOXA có khả năng tạo carbapenemase, giúp <br /> chúng kháng carbapenem.  <br /> Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng qui trình real‐time PCR phát hiện các gene blaOXA‐23/‐51/‐58 ở A. <br /> baumannii. <br /> Phương  pháp: Qui trình được xây dựng từ khâu thiết kế và kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi, xác định <br /> thành phần và chương trình real‐time PCR tối ưu cho phản ứng nhân bản các gene blaOXA‐23/‐51/‐58. <br /> Kết quả: Kết quả cho thấy qui trình có khả năng phát hiện chính xác các gene blaOXA‐23/‐51/‐58 đặc trưng <br /> của A. baumannii với độ nhạy (1,42x100‐1,42x101 bản sao/μl) và độ đặc hiệu cao.  <br /> Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình EvaGreen real‐time PCR phát hiện các nhóm gene <br /> OXA‐23/‐51/‐58 ở A. baumannii. Qui trình có thể được sử dụng để phát hiện nhanh các chủng A. baumannii <br /> mang các gene này và tiềm năng trở thành công cụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện diện các gene <br /> blaOXA ở A. baumannii trong môi trường bệnh viện. <br /> bla<br /> <br /> Từ khóa: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen <br /> <br /> ABSTRACT <br /> DEVELOPMENT OF AN EVAGREEN REAL‐TIME PCR PROTOCOL  <br /> FOR THE DETECTION OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII <br /> Nguyen Tuan Anh, Huynh Minh Tuan, Nguyen Van Vinh Chau, Ho Huynh Thuy Duong <br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 197 ‐ 201 <br /> Backgrounds:  Acinetobacter  baumannii  currently  is  the  most  leading  and  dangerous  factor  causing <br /> nosocomial infections for their multidrug resistant traits. Aspecially, A. baumannii harbours  blaOXA genes with <br /> ability of producing carbapenemase, helping them resist to carbapenem, the so‐called present strongest antibiotic, <br /> commonly used in multidrug resistant bacterial infections. <br /> Objectives: To set up and optimize an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of blaOXA‐23, ‐51, <br /> ‐58 genes in A. baumannii  <br /> Methods: The process was constructed through basic steps: specific primer design and experimental check, <br /> optimization of real‐time PCR components and temperature program using the intercalating dye, EvaGreen, and <br /> finally evaluating the specificity and sensitivity of the system. <br /> Results:  The  results  showed  that  the  protocol  could  be  used  to  detect  correctly  blaOXA‐23/‐51/‐58  genes <br /> specific to A. baumannii with high specificity and sensitivity. <br /> Conclusions: We built up successfully an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of blaOXA‐23/‐<br /> 51/‐58  genes  in  A.  baumannii.  The  protocol  can  also  be  used  to  identify  rapidly  strains  of  A.  baumannii <br /> possessing  these  genes  and  potentially  becomes  a  tool  to  study  blaOXA‐owning  A.  baumannii  infection <br /> * Công ty TNHH CNSH Khoa Thương      <br /> *** Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp.HCM. <br /> Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Tuấn Anh <br /> <br /> ** Khoa Kiểm soát Nhiễm khuẩn, BV ĐH Y Dược Tp.HCM <br /> <br /> **** Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh <br /> , ĐT: 091 7 429 336 <br /> , Email: ntanhbio@gmail.com <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> <br /> 197<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014<br /> <br /> epidemiology in different hospitals or geographical areas. <br /> Keywords: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen <br /> một  số  enzyme  trong  nhóm  này  có  hoạt  tính <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> thủy  phân  carbapenem(10).  Các  enzyme  OXA  có <br /> Acinetobacter baumannii (A. baumannii), trực <br /> khả  năng  thủy  phân  carbapenem  được  chia <br /> khuẩn  Gram  (‐)  không  lên  men  glucose,  đang <br /> thành 8 nhóm phụ, trong đó có 4 nhóm đã được <br /> trở  thành  tác  nhân  nhiễm  trùng  bệnh  viện <br /> phát  hiện  ở  A.  baumaniii  là  OXA‐23(9),  OXA‐<br /> nguy  hiểm  nhất,  đặc  biệt  ở  những  bệnh  viện <br /> 24(2), OXA‐51(11), OXA‐58(13).  <br /> đông bệnh nhân(2,1). Vì sự xuất hiện và gia tăng <br /> Dịch  tễ  phân  tử  cho  thấy  các  nhóm  gen <br /> những  chủng  A.  baumannii  đa  kháng  thuốc, <br /> blaOXA hiện diện trên khắp thế giới(7). Chủng A. <br /> carbapenem  được  lựa  chọn  để  điều  trị  khi <br /> baumannii mang nhóm gene  blaOXA‐23 phổ biến <br /> nhiễm  những  chủng  này.  Carbapenem,  điển <br /> ở  United  Kingdom,  Brazil,  Argentina,  China, <br /> hình là imipenem và meropenem, có phổ hoạt <br /> Korea,  Singapore,  Vietnam,  USA,  Libya, <br /> tính rất rộng, kháng lại vi sinh vật Gram (+) và <br /> Pakistan,  Australia  và  Columbia(7,15).  Các  chủng <br /> Gram  (‐),  bao  gồm  cả  vi  khuẩn  yếm  khí.  Đặc <br /> A.  baumannii  với  nhóm  gene  blaOXA‐58  được <br /> biệt, carbapenem là lựa chọn để điều trị những <br /> phát  hiện  đầu  tiên  ở  Pháp  và  hiện  nay  đã  xuất <br /> trường  hợp  nhiễm  khuẩn  nặng,  có  biểu  hiện <br /> hiện  ở  Argentina,  Colombia,  Bolivia,  Chile, <br /> kháng β‐lactamase phổ rộng (ESBL) và AmpC <br /> Venezuela, <br /> Spain,  Turkey,  Romania,  United <br /> β‐lactamase(4,9).  <br /> Kingdom,  Italy,  Poland,  Switzerland,  Germany, <br /> Carbapenem  thuộc  nhóm  kháng  sinh  β‐<br /> Ireland,  Portugal,  Hungary,  Bulgaria,  Greece, <br /> lactam,  bao  gồm  penicillin,  cephalosporin  và <br /> USA, Oceania và Asia(7,12). Nhóm gene blaOXA‐24 <br /> carbapenem,  là  nhóm  kháng  sinh  quan  trọng, <br /> ban đầu là nhóm ít phổ biến hơn các nhóm còn <br /> được sử dụng để điều trị nhiễm trùng gây ra bởi <br /> lại,  nhưng  hiện  đã  xuất  hiện  ở  Brazil,  Taiwan, <br /> nhiều loại vi khuẩn, trong đó có A. baumannii, vì <br /> France,  Croatia,  Chile,  Spain,  Belgium,  Czech <br /> tính hiệu quả và an toàn; ngoài ra hoạt tính của <br /> Republic,  USA  và  Iran(17).  Một  số  chủng  A. <br /> nhóm  kháng  sinh  này  dễ  dàng  được  tăng  lên <br /> baumannii kháng với carbepenem với vai trò chủ <br /> nhờ  những  cải  biến  trong  cấu  trúc  phân  tử(10,9). <br /> yếu  là  của  nhóm  gene  blaOXA‐51.  Nhóm  gene <br /> Nhóm kháng sinh này hoạt động kìm hãm sinh <br /> này được cho là tồn tại tự nhiên gần như ở tất cả <br /> trưởng và phân chia tế bào vi khuẩn bằng cách <br /> các chủng A. baumannii(2,16).  <br /> bất hoạt peptidoglycan transpeptidase(1), enzyme <br /> Carbapenemase  phổ  biến  nhất  ở  A. <br /> có  vai  trò  quan  trọng  trong  hình  thành  mạng <br /> baumannii  là  β‐lactamase  mã  hóa  bởi  blaOXA(17). <br /> lưới peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn. Sự <br /> Nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình phát <br /> bất hoạt enzyme này dẫn đến làm chết tế bào vi <br /> hiện  các  gene  blaOXA‐23,  ‐51,  ‐58  phục  vụ  cho <br /> khuẩn.  Tuy  nhiên,  enzyme  β‐lactamase  là <br /> mục đích nghiên cứu dịch tễ học phân tử và cơ <br /> enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn, với hoạt tính <br /> chế biểu hiện của những gene này. Từ đó, có cơ <br /> phân hủy kháng sinh β‐lactam, có vai trò bảo vệ <br /> sở để xác định những chủng nguy hiểm, nguy cơ <br /> vi  khuẩn  khỏi  kháng  sinh  và  cũng  là  nguyên <br /> cao gây nhiễm trùng bệnh viện. <br /> nhân  chính  dẫn  đến  tính  kháng  đối  với  nhóm <br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> kháng sinh này.  <br /> Enzyme  β‐lactamase  được  phân  chia  thành <br /> bốn nhóm phân tử riêng biệt, gồm lớp A, B, C và <br /> D,  dựa  trên  tính  tương  đồng  về  trình  tự  amino <br /> acid. Oxacillinase (OXA) là β‐lactamase lớp D, có <br /> đặc  tính  thủy  phân  oxacillin  nhanh  hơn  hơn <br /> penicillin  hoặc  benzylpenicillin(3).  Điều  đặc  biệt, <br /> <br /> 198<br /> <br /> Vật liệu <br /> Vi  khuẩn  A. baumannii chuẩn (ATCC 19606) <br /> mang  gene  OXA‐51  và  các  mẫu  vi  khuẩn  A. <br /> baumannii  được  phân  lập  từ  bệnh  phẩm  của <br /> bệnh nhân điều trị ở bệnh viện Đại học Y Dược <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 <br /> TP.  Hồ  Chí  Minh  trong  thời  gian  từ  tháng <br /> 01/2012 đến tháng 12/2013. <br /> <br /> Thiết kế mồi <br /> Các  cặp  mồi  đặc  hiệu  cho  từng  nhóm  gene <br /> OXA‐23, ‐51, ‐58 và một cặp mồi đặc hiệu cho <br /> gene  16S  rRNA  của  A.  baumannii  (Bảng  1)  làm <br /> Bảng 1. Trình tự các mồi được thiết kế <br /> <br /> bla<br /> <br /> Mồi<br /> OXA23-F<br /> OXA23-R<br /> OXA51-F<br /> OXA51-R<br /> OXA58-F<br /> OXA58-R<br /> IC-F<br /> IC-R<br /> <br /> Trình tự mồi (5’ 3’)<br /> CACTAGGAGAAGCCATGAAGC<br /> CAGCATTACCGAAACCAATACG<br /> GAAGTGAAGCGTGTTGGTTATG<br /> GCCTCTTGCTGAGGAGTAAT<br /> ATATTTAAGTGGGATGGAAAGCC<br /> CGTGCCAATTCTTGATATACAGG<br /> CCAGTGACAAACTGGAGGAAG<br /> GCTGTGTAGCAACCCTTTGTA<br /> <br /> Khuẩn lạc đặc trưng của A. baumannii được <br /> thu  nhận  và  tăng  sinh  trong  môi  trường  LB  ở <br /> điều  kiện  370C  trong  24  giờ.  Sau  khi  kết  thúc <br /> tăng sinh, DNA bộ gene của A. baumannii được <br /> tách  chiết  theo  nguyên  tắc  hấp  phụ  đặc  hiệu <br /> lên pha rắn (màng silica) bằng bộ kit tách chiết <br /> “DNA  column‐based  extraction  kit”  (Khoa <br /> Thương).  Tất  cả  mọi  thao  tác  đều  được  thực <br /> hiện  theo  đúng  hướng  dẫn  trong  bộ  kit  của <br /> nhà sản xuất. <br /> <br /> Thành phần phản ứng EvaGreen real‐time <br /> PCR <br /> Hỗn hợp phản ứng EvaGreen real‐time PCR <br /> có  thành  phần  gồm  1X  AptaTaq  Fast  DNA <br /> polymerase  (Roche),  200  nM  cho  từng  cặp  mồi <br /> xuôi  và  ngược  (IDT)  OXA23‐F/R,  OXA51‐F/R, <br /> <br /> OXA23-F/R<br /> <br /> đối chứng nội phản ứng được thiết kế và đánh <br /> giá  bằng  một  số  phần  mềm  sinh  học  phân  tử <br /> chuyên dụng như PrimerQuest, Oligo Analyzer, <br /> Annhyb,  và  Blast  (NCBI).  Mồi  được  đặt  tổng <br /> hợp  tại  công  ty  IDT  (Integrated  DNA <br /> Technologies, USA). <br /> <br /> Kích thước (bp)<br /> 21<br /> 22<br /> 22<br /> 20<br /> 23<br /> 23<br /> 21<br /> 21<br /> <br /> Phương  pháp  tách  chiết  DNA  của  A. <br /> baumannii <br /> <br /> OXA51-F/R<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Tmmồi (oC)<br /> 54.9<br /> 54.8<br /> 54.4<br /> 54.3<br /> 53.4<br /> 54.6<br /> 55.5<br /> 55.2<br /> <br /> Sản phẩm (bp)<br /> 114<br /> <br /> Tmsản phẩm (oC)<br /> 72.7<br /> <br /> 148<br /> <br /> 71.7<br /> <br /> 110<br /> <br /> 70.5<br /> <br /> 199<br /> <br /> 70.0<br /> <br /> OXA58‐F/R hoặc IC‐F/R, 1X EvaGreen (Biotium), <br /> 5μl  DNA  trong  tổng  thể  tích  là  25μl.  Chu  trình <br /> nhiệt cho phản ứng EvaGreen real‐time PCR: 40 <br /> chu  kỳ  gồm  15  giây  ‐  95oC  và  15  giây  ‐  60oC. <br /> Chương trình phân tích nhiệt độ nóng chảy của <br /> sản phẩm tương ứng với quá trình tăng nhiệt độ <br /> từ  65oC  lên  95oC,  mỗi  bước  tăng  0,5oC  và  lưu <br /> trong 20 giây. <br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN <br /> Hiệu quả nhân bản của mồi <br /> Chúng  tôi  kiểm  tra  hiệu  quả  nhân  bản  của <br /> từng cặp mồi thiết kế bằng phản ứng EvaGreen <br /> real‐time  PCR  trên  mẫu  DNA  tách  chiết  từ  vi <br /> khuẩn  A.  baumannii  sau  tăng  sinh.  Các  mẫu  vi <br /> khuẩn  này  đã  được  xác  định  sở  hữu  các  gene <br /> blaOXA tương ứng bằng phương pháp giải trình <br /> tự gene. <br /> <br /> OXA58-F/R<br /> <br /> IC-F/R<br /> <br />  Hình 1. Hiệu quả nhân bản của mồi <br /> Kết quả (Hình 1) cho thấy chỉ một đỉnh chảy <br /> đặc  trưng  tương  ứng  với  mỗi  cặp  mồi,  không <br /> hiện diện các đỉnh chảy (sản phẩm) ký sinh. Như <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> <br /> vậy,  bộ  mồi  thiết  kế  hoạt  động  nhân  bản  hiệu <br /> quả  trong  phản  ứng  PCR.  Nhiệt  độ  nóng  chảy <br /> (Tm)  của  các  sản  phẩm  nhân  bản  trình  tự  gen <br /> <br /> 199<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> OXA23  (114  bp),  OXA51  (148  bp),  OXA58  (110 <br /> bp)  và IC  (199  bp) tương  ứng  được xác  định  là <br /> 80,0oC; 78,5oC; 78,5oC và 84,0oC. Như vậy, căn cứ <br /> vào  nhiệt  độ  nóng  chảy  đặc  trưng  có  thể  nhận <br /> diện  được  các  sản  phẩm  nhân  bản  của  các  cặp <br /> mồi tương ứng.  <br /> <br /> Tính đặc hiệu của mồi <br /> Tính  đặc  hiệu  của  các  cặp  mồi  được  kiểm <br /> tra với DNA đặc trưng của A. baumannii và của <br /> <br /> OXA23-F/R<br /> <br /> OXA51-F/R<br /> <br /> các  vi  khuẩn  khác  như  E.  coli  (ATCC  25922, <br /> 35218,  35401),  Pseudomonas  aeruginosa  (ATCC <br /> 27853),  Klebsiella  pneumoniae  (ATCC  700603), <br /> Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Salmonella <br /> typhimurium  (ATCC  29946),  Staphylococcus <br /> aureus  (ATCC  12600),  Vibrio  parahaemolyticus <br /> (ATCC  17802),  Shigella  sonnei  (ATCC  29030), <br /> Shigella  flexneri  (ATCC  15391),  Shigella  boydii <br /> (ATCC 8700). <br /> <br /> OXA58-F/R<br /> <br /> IC-F/R<br /> <br /> Hình 2. Tính đặc hiệu của mồi <br /> Kết  quả  cho  thấy  các  cặp  mồi  OXA23‐F/R, <br /> OXA51‐F/R  và  OXA58‐F/R  đặc  hiệu  với  những <br /> đỉnh chảy đặc trưng, không nhân bản DNA của <br /> các vi khuẩn không phải là A. baumanniii (Hình <br /> 2).  Riêng  với  cặp  mồi  OXA58‐F/R,  đỉnh  chảy  ở <br /> nhiệt độ 71oC được xác định là của nhị phân mồi <br /> (primer‐dimer).  Cặp  mồi  IC‐F/R  được  thiết  kế <br /> đặc hiệu với 16S rRNA của A. baumannii, không <br /> đặc hiệu với 16S rRNA của các vi khuẩn khác. Vì <br /> thế, phản ứng kém với DNA của vi khuẩn khác, <br /> thể hiện qua tín hiệu định lượng thấp (không thể <br /> hiện  ở  đây)  và  những  đỉnh  chảy  với  nhiệt  độ <br /> không đặc trưng. <br /> <br /> Tối ưu hóa nhiệt độ lai (Ta) <br /> <br /> Bảng 2. Giá trị Ct tối ưu hóa nhiệt độ lai của mồi <br /> <br /> 200<br /> <br /> 50,0<br /> 28,8<br /> 30,3<br /> 33,8<br /> 31,8<br /> <br /> 51,0<br /> 28,7<br /> 29,7<br /> 33,4<br /> 31,6<br /> <br /> 53,0<br /> 28,2<br /> 29,6<br /> 32,1<br /> 31,1<br /> <br /> 55,9<br /> 27,4<br /> 29,3<br /> 31,9<br /> 29,2<br /> <br /> 59,5<br /> 26,6<br /> 28,5<br /> 30,4<br /> 28,8<br /> <br /> Tối ưu hóa nồng độ mồi  <br /> Thí  nghiệm  được  tiến  hành  với  3  nghiệm <br /> thức  1,  2  và  3  với  nồng  độ  mồi  lần  lượt  là  100, <br /> 200  và  300  nM.  Bốn  loại  mồi  được  tối  ưu  riêng <br /> rẽ.  Nhiệt  độ  lai  sử  dụng  như  đã  tối  ưu  ở  trên. <br /> Mẫu DNA A. baumannii sử dụng có nồng độ như <br /> trên. Mỗi mẫu được lập lại 3 lần chạy. <br /> Bảng 3: Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ mồi <br /> <br /> Chúng  tôi  khảo  sát  các  nhiệt  độ  lai  từ <br /> 50,0oC  đến  65,0oC,  bao  gồm  các  nhiệt  độ  sau: <br /> 50,0oC;  51,0oC;  53,0oC;  55,9  oC;  59,5oC;  62,5oC; <br /> 64,1oC;  65,0oC.  Mẫu  DNA  A.  baumannii  sử <br /> dụng có nồng độ 1,42x101 bản sao/μl. Tiêu chí <br /> tối ưu là giá trị Ct của phản ứng real‐time PCR <br /> càng nhỏ càng tốt. <br /> Ta (oC)<br /> OXA23-F/R<br /> OXA51-F/R<br /> OXA58-F/R<br /> IC-F/R<br /> <br /> Kết  quả  cho  thấy  khoảng  nhiệt  độ  lai  phù <br /> hợp cho cả bốn cặp mồi là từ 59,5oC đến 65,0oC. <br /> Với  khoảng  nhiệt  độ  này,  phản  ứng  nhân  bản <br /> trên cả bốn cặp mồi cho hiệu quả ổn định, giá trị <br /> Ct  thấp  và  các  đỉnh  chảy  phân  tách  rõ  ràng. <br /> Nhiệt độ lai tối ưu được chọn là 62,5oC. <br /> <br /> 62,5<br /> 26,9<br /> 28,1<br /> 30,1<br /> 28,6<br /> <br /> 64,1<br /> 26,8<br /> 27,3<br /> 30,2<br /> 28,5<br /> <br /> 65,0<br /> 27,1<br /> 28,5<br /> 30,3<br /> 28,1<br /> <br /> Nghiệm thức OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R<br /> 1<br /> 31,4±0,7 34,7±0,2 36,6±0,6 32,6±0,4<br /> 2<br /> 29,2±0,1 30,3±0,1 33,2±0,5 29,6±0,3<br /> 3<br /> 28,9±0,1 30,1±0,1 32,2±0,6 28,8±0,1<br /> <br /> Kết quả (Bảng 3) cho thấy với mỗi mẫu thử, <br /> giá  trị  Ct  ở  nồng  độ  mồi  200  và  300  nM  tương <br /> đương nhau và luôn tốt hơn giá trị Ct của nồng <br /> độ  mồi  100nM.  Vì  vậy,  nồng  độ  mồi  200  nM <br /> được chọn tối ưu cho mỗi loại mồi khảo sát, do <br /> lượng cần dùng trong phản ứng ít hơn. <br /> <br /> Độ nhạy của phản ứng <br /> Để  kiểm  tra  độ  nhạy  của  phản  ứng <br /> EvaGreen  real‐time  PCR,  thí  nghiệm  được  tiến <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 <br /> hành với DNA tách chiết từ mẫu tế bào vi khuẩn <br /> A. baumannii sau tăng sinh (1.42x106 bản sao/μl), <br /> được pha loãng theo bậc 10. Điều kiện phản ứng <br /> sử dụng như đã tối ưu ở trên. Mỗi mẫu được lập <br /> lại 3 lần chạy. <br /> Bảng 4: Giá trị Ct khảo sát độ nhạy của phản ứng <br /> EvaGreen real‐time PCR <br /> Mẫu Nồng độ* OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R<br /> 1 1.42x105 15,2±0,4 16,2±0,5 19,2±0,4 16,0±0,5<br /> 4<br /> 2 1.42x10 18,2±0,1 19,5±0,3 22,4±0,2 19,2±1,0<br /> 3 1.42x103 21,7±0,1 23,2±0,1 26,7±0,8 23,6±0,6<br /> 4 1.42x102 24,7±0,3 26,5±0,0 29,5±0,5 26,8±0,9<br /> 5 1.42x101 28,9±0,2 31,0±0,1 33,8±0,8 31,5±0,3<br /> 6 1.42x100 33,4±0,7 35,2±0,3<br /> N/A<br /> 36,0±0,6<br /> <br /> (*) đơn vị nồng độ: bản sao/μl <br /> <br /> 3.<br /> <br /> Bush  K,  Jacoby  GA,  and  Medeiros  AA  (1995).  A  functional <br /> classification  scheme  for  beta‐lactamases  and  its  correlation <br /> with  molecular  structure.  Antimicrob  Agents  Chemother <br /> 39(6), p. 1211‐33. <br /> Donald HM, et al. (2000). Sequence analysis of ARI‐1, a novel <br /> OXA  beta‐lactamase,  responsible  for  imipenem  resistance  in <br /> Acinetobacter  baumannii  6B92.  Antimicrob  Agents <br /> Chemother 44(1), p. 196‐9. <br /> Green  DW  (2002).  The  bacterial  cell  wall  as  a  source  of <br /> antibacterial targets. Expert Opin Ther Targets 6(1), p. 1‐19. <br /> Heritier  C,  et  al.  (2005).  Characterization  of  the  naturally <br /> occurring  oxacillinase  of  Acinetobacter  baumannii. <br /> Antimicrob Agents Chemother 49(10), p. 4174‐9. <br /> Higgins  PG,  et  al.  (2010).  Global  spread  of  carbapenem‐<br /> resistant  Acinetobacter  baumannii.  J  Antimicrob  Chemother <br /> 65(2), p. 233‐8. <br /> Livermore  DM  and  Woodford  N  (2006).  The  beta‐lactamase <br /> threat <br /> in <br /> Enterobacteriaceae, <br /> Pseudomonas <br /> and <br /> Acinetobacter. Trends Microbiol 14(9), p. 413‐20. <br /> Nicolau DP (2008). Carbapenems: a potent class of antibiotics. <br /> Expert Opin Pharmacother 9(1), p. 23‐37. <br /> Nordmann P and Poirel L (2002). Emerging carbapenemases <br /> in  Gram‐negative  aerobes.  Clin  Microbiol  Infect  8(6),  p.  321‐<br /> 31. <br /> Peleg  AY,  Seifert  H,  and  Paterson  DL  (2008).  Acinetobacter <br /> baumannii:  emergence  of  a  successful  pathogen.  Clin <br /> Microbiol Rev 21(3), p. 538‐82. <br /> Poirel  L  and  Nordmann  P  (2006).  Carbapenem  resistance  in <br /> Acinetobacter  baumannii:  mechanisms  and  epidemiology. <br /> Clin Microbiol Infect 12(9), p. 826‐36. <br /> Poirel L, et al. (2005). OXA‐58, a novel class D {beta}‐lactamase <br /> involved  in  resistance  to  carbapenems  in  Acinetobacter <br /> baumannii. Antimicrob Agents Chemother 49(1), p. 202‐8. <br /> Theaker  C,  Azadian  B,  and  Soni  N  (2003).  The  impact  of <br /> Acinetobacter  baumannii  in  the  intensive  care  unit. <br /> Anaesthesia 58 (3), p. 271‐4. <br /> Turton  JF,  et  al.  (2005).  Detection  and  typing  of  integrons  in <br /> epidemic  strains  of  Acinetobacter  baumannii  found  in  the <br /> United Kingdom. J Clin Microbiol 43(7), p. 3074‐82. <br /> Turton  JF,  et  al.  (2006).  Identification  of  Acinetobacter <br /> baumannii by detection of the blaOXA‐51‐like carbapenemase <br /> gene intrinsic to this species. J Clin Microbiol 44(8), p. 2974‐6. <br /> Zarrilli  R,  et  al.  (2009).  Carbapenem  resistance  in <br /> Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of <br /> an  emerging  problem  in  health  care  facilities.  J  Infect  Dev <br /> Ctries 3(5), p. 335‐41. <br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> Kết  quả  (Bảng  4)  cho  thấy  phản  ứng <br /> EvaGreen  real‐time  PCR  đối  với  mồi  OXA23‐<br /> F/R,  OXA51‐F/R  và  IC‐F/R  cho  tín  hiệu  dương <br /> tính ổn định với mẫu DNA có nồng độ 1.42x100 <br /> bản  sao/μl;  Trong  khi  đó,  tín  hiệu  dương  tính <br /> của mồi OXA58‐F/R ổn định ở mẫu DNA nồng <br /> độ 1.42x101 bản sao/μl. <br /> <br /> KẾT LUẬN <br /> <br /> 10.<br /> <br /> 11.<br /> <br /> 12.<br /> <br /> 13.<br /> <br /> Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình <br /> EvaGreen real‐time PCR để phát hiện các nhóm <br /> gene  blaOXA‐23,  blaOXA‐51  và  blaOXA‐58  của  vi <br /> khuẩn A. baumannii. Quy trình có thể được ứng <br /> dụng  để  khảo  sát  dịch  tễ  học  phân  tử  các  gene <br /> này  ở  các  chủng  A. baumannii  khác  nhau  trong <br /> lâm  sàng  và  hỗ  trợ  trong  chẩn  đoán  nhiễm  A. <br /> baumannii ở người bệnh như là một chọn lựa bổ <br /> sung bên cạnh quy trình nuôi cấy truyền thống.  <br /> <br /> 14.<br /> <br /> 15.<br /> <br /> 16.<br /> <br /> 17.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO <br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> Bonfiglio  G,  Russo  G,  and  Nicoletti  G  (2002).  Recent <br /> developments  in  carbapenems.  Expert  Opin  Investig  Drugs <br /> 11(4), p. 529‐44. <br /> Bou  G,  Oliver  A,  and  Martinez‐Beltran  J  (2000).  OXA‐24,  a <br /> novel  class  D  beta‐lactamase with carbapenemase  activity in <br /> an  Acinetobacter  baumannii  clinical  strain.  Antimicrob <br /> Agents Chemother 44(6), p. 1556‐61. <br />  <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br />  <br /> Ngày nhận bài báo: <br /> <br />  <br /> <br />  <br /> <br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: <br /> Ngày bài báo được đăng: <br /> <br />  <br /> <br /> 05/9/2014 <br /> <br />  <br /> <br /> 29/9/2014 <br /> 20/10/2014 <br /> <br />  <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> <br /> 201<br /> <br />