Xây dựng qui trình multiplex pcr phát hiện một số vi khuẩn gây tiêu chảy cấp ở lợn

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 8-14<br /> <br /> XÂY DỰNG QUI TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN<br /> MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN<br /> Nguyễn Tuấn Anh1*, Nguyễn Thị Minh Tâm1, Trịnh Thị Thanh Huyền2,<br /> Ngô Quang Hưởng2, Phí Thị Thu Hiền2, Nguyễn Thị Hoàng2<br /> 1<br /> <br /> Công Ty TNHH Công nghệ sinh học Khoa Thương, *ntanhbio@gmail.com<br /> 2<br /> Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai<br /> <br /> TÓM TẮT: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình phát hiện ba loài vi khuẩn có khả năng gây tiêu<br /> chảy cấp ở lợn bao gồm Salmonella spp., Clostridium perfringens và E. coli ETEC trong bệnh phẩm, phân<br /> và mô ruột, dựa trên kỹ thuật multiplex PCR. Các thông số tối ưu cho quy trình bao gồm: nồng độ mồi cho<br /> từng đối tượng tương ứng là 350 nM (Salmonella spp.), 200 nM (C. perfringens), 200 nM<br /> (E. coli ETEC), 50 nM mồi chứng nội (Porcine β-actin), nhiệt độ lai là 61oC. Ngưỡng phát hiện của quy<br /> trình là 2,5103 bản sao/phản ứng cho cả ba đối tượng. Quy trình được kiểm tra trên một số mẫu sinh thiết<br /> ruột và phân lợn bị bệnh tiêu chảy, kết hợp so sánh với kit thương mại cho thấy có khả năng phát hiện<br /> chính xác ba loài vi khuẩn tương đương với kit thương mại với hệ số Kappa tương ứng được xác định là<br /> 1,0; 0,45 và 0,56. Quy trình có khả năng phát triển thành một phương pháp chẩn đoán tiện lợi, nhanh<br /> chóng, đặc hiệu và chính xác; hơn nữa, có thể được sử dụng như một công cụ nghiên cứu dịch tễ học sự<br /> nhiễm những vi khuẩn này trong các quần thể lợn nuôi.<br /> Từ khóa: Clostridium perfringens, E. coli, Salmonella, multiplex PCR, bệnh tiêu chảy.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Bệnh tiêu chảy là một trong những vấn đề<br /> quan trọng nhất trong chăn nuôi lợn, gây nhiều<br /> tổn thất kinh tế, bệnh đe dọa nhóm lợn sơ sinh<br /> dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ chết có thể lên tới<br /> 100%. Ở lợn trưởng thành, bệnh thường tự khỏi<br /> nếu được chăm sóc tốt nhưng trong trường hợp<br /> lợn mẹ mang mầm bệnh, đàn con có thể bị lây<br /> nhiễm, tiêu chảy và tử vong trong thời gian<br /> ngắn do không có sức kháng bệnh.<br /> Bệnh có thể do vi khuẩn, virus, ký sinh trùng<br /> gây ra với triệu chứng tương tự nhau. Trong số<br /> các vi khuẩn có khả năng gây tiêu chảy cấp,<br /> Clostridium perfringens, Escherichia coli<br /> (ETEC) và Salmonella spp. là những đối tượng<br /> được quan tâm, chúng được tìm thấy trong<br /> những trường hợp lợn bị các bệnh về dạ dày,<br /> ruột. Clostridium perfringens là vi khuẩn Gram<br /> (+), hình thành bào tử, kị khí, thường có trong<br /> đất, nước thải và đường ruột của người và động<br /> vật. Clostridium perfringens được chia thành<br /> năm typ, từ A đến E, dựa trên khả năng sản xuất<br /> bốn loại độc tố là độc tố α (CPA), độc tố β<br /> (CPB), độc tố epsilon (ETX) và độc tố iota (IA)<br /> [6]. E. coli ETEC (Enterotoxigenic E. coli) là<br /> một tác nhân đáng lưu ý bởi tạo ra cả hai loại độc<br /> tố ổn nhiệt và nhạy nhiệt, được mã hóa bởi gene<br /> 8<br /> <br /> ST và LT [10], gây triệu chứng tiêu chảy nghiêm<br /> trọng ở lợn mới sinh và lợn cai sữa [2, 3]. Các<br /> chủng E. coli không gây bệnh vẫn hiện diện<br /> trong đường ruột của động vật khỏe mạnh nên<br /> cần phân biệt giữa E. coli và E. coli ETEC [1, 5].<br /> Salmonella spp. là một trong những tác nhân gây<br /> tiêu chảy phổ biến ở lợn trưởng thành, trong đó,<br /> hai chủng Salmonella chủ yếu gây bệnh là S.<br /> choleraesuis và S. typhimurium, chiếm hơn 65%<br /> tình trạng nhiễm Salmonella ở lợn. Có khoảng<br /> 200 gene độc tồn tại ở Salmonella, trong đó gene<br /> invA có vai trò quan trọng trong quá trình xâm<br /> nhiễm của Salmonella vào thể chủ [8, 12].<br /> Một số công trình nghiên cứu ở Việt Nam<br /> và trên thế giới nhằm vào những vi khuẩn này<br /> với nhiều mục đích khác nhau. Nguyễn Tuyên<br /> Quang (2007) [14] nghiên cứu xác định các yếu<br /> tố gây bệnh của E. coli với tiêu chảy ở lợn con,<br /> cho thấy, chủng E. coli ETEC phân lập được có<br /> tỷ lệ khác nhau về năm tổ hợp yếu tố gây bệnh<br /> là LT+STa+K88+Hly+ (52,2%), LT+STa+STb<br /> +K88+Hly-(11,1%), STa+K99+(17,2%), STa+<br /> STb+(3,3%) và STb (15,7%). Kim et al. (2010)<br /> [7] đã nghiên cứu 122 mẫu phân lợn tiêu chảy<br /> từ 55 trang trại ở Hàn Quốc cho thấy có đến 114<br /> mẫu E. coli thuộc nhóm ETEC, chứa gene K88,<br /> K99, K987P, LT, STa và STb. Kết quả khẳng<br /> <br /> Nguyen Tuan Anh et al.<br /> <br /> định E. coli ETEC liên quan chặt chẽ đến tiêu<br /> chảy ở lợn con. Lin et al. (2004) [9] nghiên cứu<br /> tần số xuất hiện các gene độc tố ở<br /> C. perfringens bằng kỹ thuật multiplex PCR với<br /> kết quả cpa (98,2%), cpb (31,0%), cpb2<br /> (46,0%), cpe (18,6%). Nguyễn Cảnh Tự và nnk.<br /> (2010) [15] cho thấy số lượng và tỷ lệ các<br /> chủng Salmonella có các yếu tố gây bệnh và<br /> độc lực mạnh phân lập được từ lợn bị tiêu chảy<br /> cao hơn rất nhiều so với ở lợn không bị tiêu<br /> chảy. Mtshali et al. (2012) [11] đã phát hiện<br /> E. coli, C. perfringens và Salmonella spp. từ<br /> phân động vật tại vườn thú quốc gia Nam Phi<br /> bằng kỹ thuật multiplex PCR.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng<br /> quy trình phát hiện đồng thời ba tác nhân gây<br /> bệnh là C. perfringens, E. coli ETEC và<br /> Salmonella spp. trong các mẫu bệnh thu từ lợn<br /> nghi nhiễm dựa trên phương pháp multiplex<br /> PCR. Đối tượng nhân bản của multiplex PCR là<br /> <br /> các gene độc lực Cpa đối với C. perfringens, STa<br /> cho E. coli ETEC và inv cho Salmonella spp.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Mẫu phân, mô ruột non của lợn con sơ sinh<br /> nghi nhiễm vi khuẩn gây tiêu chảy cấp ở khu<br /> vực Đồng Nai được thu thập trong khoảng thời<br /> gian từ 06/2010 đến 11/2012.<br /> Các chủng vi khuẩn sử dụng bao gồm<br /> Salmonella typhimurium (ATCC 29946),<br /> Escherichia coli ETEC (ATCC 35401). Đối với<br /> Clostridium perfringens, gene Cpa của mẫu vi<br /> khuẩn thu thập từ thực địa được tạo dòng vào<br /> plasmid pBluescript II SK (+) (Stratagene) và<br /> plasmid tái tổ hợp được đặt tên là pBlueC. perfringens.<br /> Mồi sử dụng trong nghiên cứu do công ty<br /> IDT (Integrated DNA Technologies, Hoa kỳ)<br /> cung cấp.<br /> <br /> Bảng 1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu<br /> Tên<br /> <br /> Gene/Chủng<br /> <br /> SA-F<br /> Inv, Salmonella spp.<br /> SA-R<br /> EC-F<br /> STa, E. coli ETEC<br /> EC-R<br /> CL-F<br /> Cpa, C. perfringens<br /> CL-R<br /> IC-F<br /> Porcine β-actin<br /> IC-R<br /> <br /> Trình tự (5’→3’)<br /> ATAAACTTCATCGCACCGTCA<br /> TACTTAACAGTGCTCGTTTAC<br /> CAACTGAATCACTTGACTCTT<br /> TTAATAACATCCAGCACAGG<br /> GCTAATGTTACTGCCGTTGA<br /> ACCCTCTGATACATCGTGTAAG<br /> ATCCTCACGGAGCGGGGCTAC<br /> TGCCCGACACCTACCCAGGAAG<br /> <br /> Xử lý bệnh phẩm: Mẫu phân, 1-2 g (rắn)<br /> hoặc 1-2 ml (lỏng) được hòa trong 5-7 ml PBS<br /> 1X, gạt phần dịch nổi vào falcon 15 ml. Ly tâm<br /> 2.800 x g trong 2 phút, thu 1,5 ml dịch nổi và li<br /> tâm tiếp ở 12.000 x g trong 20 phút, thu cặn.<br /> Hòa cặn trong 100 µl SDS 3%. Mẫu sinh thiết<br /> ruột lợn, 50 mg, được cắt nhỏ trong dung dịch<br /> SDS 3%, vortex mạnh trong 10-15 giây và ủ ở<br /> nhiệt độ 65oC trong 20 phút. Mẫu xử lý có thể<br /> được sử dụng để tách chiết DNA hoặc bảo quản<br /> ở -20oC.<br /> Tách chiết DNA: DNA bộ gene của vi khuẩn<br /> từ mẫu phân và mẫu sinh thiết đã xử lý được tách<br /> chiết theo phương pháp phenol: chloroform:<br /> isoamylalcohol (PCA) hoặc Boom [5].<br /> <br /> Sản phẩm<br /> (bp)<br /> <br /> Nguồn gốc<br /> <br /> 570<br /> <br /> Lei et al., 2008<br /> <br /> 158<br /> <br /> Bosworth et al.,<br /> 1997<br /> <br /> 327<br /> <br /> Das et al., 2009<br /> <br /> 243<br /> <br /> Nghiên cứu này<br /> <br /> Multiplex PCR: DNA sau khi tách chiết<br /> được nhân bản trong phản ứng multiplex PCR.<br /> Hỗn hợp phản ứng multiplex PCR bao gồm 1U<br /> h-Taq DNA polymerase (Solgent), 200 µM<br /> dNTPs, 2 mM MgCl2, 1X PCR buffer, 200 nM<br /> mồi CL-F/R, 200 nM mồi EC-F/R, 350 nM mồi<br /> SA-F/R, 50 nM mồi chứng nội IC (Porcine<br /> β-actin) và 5 µl DNA tách chiết trong tổng thể<br /> tích phản ứng là 25 µl. Chu trình nhiệt cho phản<br /> ứng PCR: 15 phút ở 95oC, 40 chu kỳ lặp lại<br /> gồm 30 giây ở 94oC, 30 giây ở 61oC và 30 giây<br /> ở 72oC, và 6 phút ở 72oC. Sản phẩm nhân bản<br /> được phân tích qua điện di trên gel agarose 2%<br /> với thang phân tử 100 bp (Solgent).<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 8-14<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Xây dựng qui trình multiplex PCR<br /> Vật liệu sinh học là DNA bộ gene và<br /> plasmid tái tổ hợp từ 3 chủng vi khuẩn C.<br /> perfringens, E. coli ETEC và S. typhimurium.<br /> Số lượng bản sao vi khuẩn/µl được tính toán<br /> dựa trên công thức: Số lượng bản sao = (lượng<br /> DNA (ng)  6.022.1023)/(kích thước  1.109 <br /> 650) [13]. Chúng tôi sử dụng ba tổ hợp với tỷ lệ<br /> 1:1:1 của ba vi khuẩn tương ứng với ba nồng độ<br /> (bản sao/µl ) là 5102 bản sao/µl, 5104 bản<br /> sao/µl và 5106 bản sao/µl. Chứng nội trong<br /> phản ứng multiplex PCR là một trình tự gene<br /> β-actin lợn được nhân bản với cặp mồi IC-F/R.<br /> Kết quả ở hình 1 cho thấy, các sản phẩm<br /> nhân bản trong phản ứng monoplex PCR với<br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> từng vi khuẩn có kích thước phù hợp với kích<br /> thước dự kiến, 570 bp đối với S. typhimurium,<br /> 158 bp đối với E. coli (ETEC), 327 bp cho<br /> C. perfringens và 243 bp cho chứng nội. Các<br /> sản phẩm nhân bản, kiểm tra bằng giải trình tự,<br /> phù hợp với các trình tự gene tương ứng đã<br /> công bố (kết quả không trình bày ở đây).<br /> Tuy nhiên, phản ứng multiplex PCR có hiệu<br /> quả nhân bản không đồng đều trên bốn gene<br /> mục tiêu ở các nồng độ vi khuẩn trung bình và<br /> thấp, 5102 và 5104 bản sao/µl, trong đó sản<br /> phẩm nhân bản gene chứng nội luôn chiếm ưu<br /> thế (hình 1A).<br /> Từ đây, chúng tôi tối ưu hóa hai thông số là<br /> nồng độ các cặp mồi và nhiệt độ lai của phản<br /> ứng PCR.<br /> C<br /> <br /> Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm monoplex PCR và multiplex PCR<br /> từ 3 tổ hợp DNA 3 vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau<br /> 1. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5102 bản sao/µl; 2. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5104 bản<br /> sao/µl; 3. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5106 bản sao/µl; 4. DNA tách chiết từ mẫu phân âm tính với<br /> 3 vi khuẩn đang khảo sát; A. Phản ứng PCR multiplex; B và C là phản ứng PCR monoplex cho từng vi khuẩn.<br /> <br /> Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với các nồng độ mồi SA-F/R (Salmonella spp.) khác nhau<br /> 1. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5102 bản sao/µl; 2. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5104 bản<br /> sao/µl; 3. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5106 bản sao/µl; 4. DNA tách chiết từ mẫu phân âm tính với<br /> 3 vi khuẩn khảo sát.<br /> <br /> Nồng độ mồi chứng nội IC-F/R được khảo<br /> sát theo xu hướng giảm, 200, 150, 100, và 50<br /> nM/phản ứng. Trong khi đó, nồng độ mồi đặc<br /> hiệu cho C. perfringens và Salmonella spp., CL10<br /> <br /> F/R và SA-F/R, được khảo sát theo theo hướng<br /> tăng dần, 200, 250, 300 và 350 nM. Kết quả ở<br /> hình 2 cho thấy, ở nồng độ mồi SA-F/R (350<br /> nM) là tốt nhất, kết quả nồng độ mồi CL-F/R<br /> <br /> Nguyen Tuan Anh et al.<br /> <br /> được chọn là 200 nM (không thể hiện ở đây).<br /> <br /> vi khuẩn với nồng độ khác nhau. Kết quả ở hình<br /> 3 cho thấy, nhiệt độ 61,4oC cho hiệu quả nhân<br /> bản tốt nhất, thể hiện rõ nhất ở mẫu có nồng độ<br /> vi khuẩn thấp, chúng tôi chọn nhiệt độ lai là 61oC<br /> cho quy trình multiplex PCR.<br /> <br /> Nhiệt độ lai cho phản ứng multiplex PCR<br /> được khảo sát trong khoảng từ 55-65oC bao gồm:<br /> 55,0; 55,8; 57,1; 58,9; 61,4; 63,3; 64,5 và 65,0<br /> o<br /> C. Khảo sát được lập lại ba lần với ba hỗn hợp<br /> <br /> Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với các nhiệt độ lai khác nhau<br /> Lần 1: Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5102 bản sao/µl; lần 2: Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ<br /> 5104 bản sao/µl; lần 3: Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5106 bản sao/µl.<br /> <br /> Ngưỡng phát hiện của quy trình multiplex<br /> PCR được xác định bằng cách sử dụng hỗn hợp<br /> 3 vi khuẩn có nồng độ 5105 bản sao/µl, pha<br /> loãng bậc 10 đến nồng độ thấp nhất là 5100<br /> bản sao/µl, bổ sung vào dịch phân và dịch mô<br /> âm tính. DNA tách chiết từ 2 lô chất nền này<br /> được nhân bản với phản ứng multiplex PCR đã<br /> tối ưu hóa. Kết quả ở hình 4 cho thấy, tín hiệu<br /> dương tính ổn định ở nồng độ 5102 bản sao/µl<br /> (giếng 4 và 10) ở hai lần thí nghiệm trên dịch<br /> phân (mẫu 1-6) và dịch mô (mẫu 7-12). Như<br /> vậy, ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex<br /> PCR được xác định là 5102 bản sao/µl.<br /> <br /> Ngưỡng phát hiện của quy trình multiplex<br /> PCR<br /> <br /> Hình 4. Kết quả PCR từ hỗn hợp DNA 3 vi<br /> khuẩn ở các nồng độ khác nhau<br /> Giếng 1, 7: 5105 bản sao/µl; giếng 2, 8: 5104 bản<br /> sao/µl; giếng 3, 9: 5103 bản sao/µl; giếng 4, 10:<br /> 5102 bản sao/µl; giếng 5, 11: 5101 bản sao/µl;<br /> giếng 6, 12: 5100 bản sao/µl.<br /> <br /> Kiểm tra quy trình multiplex PCR phát hiện<br /> đồng<br /> thời<br /> Clostridium<br /> perfringens,<br /> Escherichia coli (ETEC) và Salmonella spp.<br /> với kit thương mại<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả so sánh qui trình multiplex PCR vi khuẩn với kit thương mại real-time PCR<br /> So sánh kit phát<br /> hiện vi khuẩn<br /> <br /> Kit C<br /> (+)<br /> (-)<br /> <br /> Kit<br /> multiplex<br /> PCR<br /> <br /> (+)<br /> <br /> 15<br /> <br /> 0<br /> <br /> (-)<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 17<br /> (94%)<br /> <br /> 1<br /> (6%)<br /> 0,45<br /> <br /> Tổng<br /> Hệ số kappa (κ)<br /> <br /> Tổng<br /> 15<br /> (83%)<br /> 3<br /> (17%)<br /> 18<br /> <br /> Kit E<br /> (+)<br /> <br /> (-)<br /> <br /> 9<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0<br /> <br /> 5<br /> <br /> 9<br /> (50%)<br /> <br /> 9<br /> (50%)<br /> 0,56<br /> <br /> Tổng<br /> 13<br /> (72%)<br /> 5<br /> (28%)<br /> 18<br /> <br /> Kit S<br /> (+)<br /> <br /> (-)<br /> <br /> 12<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 6<br /> <br /> 12<br /> (67%)<br /> <br /> 6<br /> (33%)<br /> 1,0<br /> <br /> Tổng<br /> 12<br /> (67%)<br /> 6<br /> (33%)<br /> 18<br /> <br /> C. Kit C. perfringens; E. Kit E. coli ETEC; S. Kit S. typhimurium (Labhoo).<br /> <br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 8-14<br /> <br /> Thử nghiệm được tiến hành trên một số mẫu<br /> chứng đại diện đã biết trước nồng độ và mẫu<br /> thực địa. Do không có kit thương mại tương<br /> đương nên chúng tôi sử dụng các kit real-time<br /> PCR (Labhoo) cho từng tác nhân vi khuẩn. Kết<br /> quả ở bảng 2 cho thấy, quy trình multiplex PCR<br /> vi khuẩn xây dựng trong nghiên cứu này có khả<br /> năng phát hiện C. perfringens, E. coli ETEC và<br /> <br /> Salmonella spp. tương đương với kit thương<br /> mại. Hệ số kappa nhận được cho thấy sự đồng<br /> thuận vừa phải đối với kit C (C. perfringens) và<br /> kit E (E. coli ETEC) và đồng thuận rất tốt đối<br /> với kit S (Salmonella spp.).<br /> Thử nghiệm quy trình multiplex PCR vi<br /> khuẩn trên mẫu thực địa<br /> <br /> Bảng 3. Kết quả thử nghiệm quy trình multiplex PCR vi khuẩn trên mẫu thực địa<br /> Tình trạng nhiễm/mẫu<br /> C. perfringens<br /> E. coli ETEC<br /> S. typhimurium<br /> C. perfringens và E. coli ETEC<br /> E. coli ETEC và S. typhimurium.<br /> C. perfringens và Salmonella spp.<br /> C. perfringens, E. coli ETEC và S. typhimurium<br /> Âm tính<br /> Kết quả thử nghiệm quy trình multiplex<br /> PCR vi khuẩn trên 100 mẫu chọn ngẫu nhiên từ<br /> lợn nghi nhiễm bao gồm cả phân và mô lợn sơ<br /> sinh và cai sữa cho thấy, tỷ lệ nhiễm<br /> C. perfringens rất cao (53%) (bảng 3). Kết quả<br /> giải trình tự một số mẫu đại diện (không thể<br /> hiện ở đây) cho thấy các mẫu này đều phù hợp<br /> với kết quả PCR.<br /> Tuy nhiên, do các mẫu sử dụng trong<br /> nghiên cứu này chỉ nhằm phục vụ việc xây<br /> dựng và đánh giá quy trình multiplex PCR nên<br /> mẫu chọn không đại diện cho tình hình dịch tễ<br /> học bệnh nhiễm này ở địa phương.<br /> <br /> Số mẫu<br /> 53% (53/100)<br /> 4% (4/100)<br /> 5% (5/100)<br /> 2% (2/100)<br /> 2% (2/100)<br /> 4% (4/100)<br /> 2% (2/100)<br /> 28% (28/100)<br /> cho chúng tôi nguồn mẫu thực địa dùng trong<br /> nghiên cứu.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> 1<br /> <br /> Abu S. M. R., El-Essawy A. K., Abu S. H.<br /> M., Ibrahim S. A., Roshdy R. A., 2006.<br /> Validity of multiplex PCR as an emerging<br /> technique for diagnosis of enterotoxigenic<br /> Escherichia coli. Egypt. J. Med. Lab. Sci,<br /> 15(1): 1-8.<br /> <br /> 2<br /> <br /> Ahsani M. R., Mohammadabadi M. R.,<br /> Shamsaddini M. B., 2010. Clostridium<br /> perfringens isolate typing by multiplex<br /> PCR. J. Ven. Anim. Toxins Trop. Dis.,<br /> 16(4): 573-578.<br /> <br /> 3<br /> <br /> Blanco M., Blanco J. E., Gonzales E. A.,<br /> Mora A., Jansen W., Gomes T. A., Zerbini<br /> L. F., Yano T., de Castro A. F., Blanco J.,<br /> 1997. Genes coding for enterotoxins and<br /> verotoxins in porcine Escherichia coli<br /> strains belonging to different O:K:H<br /> serotypes:<br /> relationship<br /> with<br /> toxic<br /> phenotypes. J. Clin. Microbiol., 35(11):<br /> 2958-2963.<br /> <br /> 4<br /> <br /> Boom R., Sol C. J., Salimans M. M., Jansen<br /> C. L., Wertheim-van Dillen P. M., van der<br /> Noordaa J., 1990. Rapid and simple method<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Quy trình multiplex PCR xây dựng trong<br /> nghiên cứu này có thể được sử dụng để phục vụ<br /> cho chẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ học bệnh<br /> tiêu chảy cấp trên lợn nuôi do vi khuẩn. Trong<br /> lĩnh vực thú y, quy trình có ưu điểm là thời gian<br /> xét nghiệm nhanh và cho kết quả chính xác.<br /> Lời cảm ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn<br /> Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Đồng Nai,<br /> Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học tỉnh<br /> Đồng Nai, Công ty TNHH CNSH Khoa Thương<br /> đã giúp đỡ chúng tôi về kinh phí và thiết bị để<br /> thực hiện nội dung này. Xin cảm ơn các hộ chăn<br /> nuôi trên địa bàn tỉnh Đồng Nai đã cung cấp<br /> 12<br /> <br />