Xây dựng quy trình định lượng geniposid trong cao khô dành dành bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GENIPOSID<br /> TRONG CAO KHÔ DÀNH DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC<br /> Trần Thanh Tâm*, Nguyễn Đức Hạnh**, Huỳnh Trần Quốc Dũng***, Nguyễn Đức Tuấn**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu – Mục tiêu: Quả Dành dành (Gardenia Fructus) với thành phần hóa học đặc trưng là các<br /> iridoid glycosid (trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là geniposid và gardenosid) được sử dụng từ bao đời<br /> nay với tác dụng điều trị tăng huyết áp. Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh dấu<br /> để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình<br /> định lượng geniposid trong cao khô Dành dành. Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng geniposid<br /> trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC là cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng nguyên liệu<br /> cao khô Dành dành trước khi đưa vào sản xuất thành phẩm.<br /> Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Cao khô Dành dành do công ty cổ phần BV<br /> Pharma cung cấp. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện sắc ký như pha động, cột sắc ký để phân<br /> tách geniposid trong cao khô Dành dành; Khảo sát một số điều kiện chiết gineposid trong cao khô Dành dành như<br /> dung môi chiết, tỷ lệ cao và dung môi, thời gian chiết siêu âm; Thẩm định quy trình định lượng geniposid trong<br /> cao khô dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD theo hướng dẫn của ICH bao gồm tính phù hợp hệ thống,<br /> tính chọn lọc, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác, độ đúng và độ bền.<br /> Kết quả: Đã xác định được được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng geniposid trong cao khô<br /> Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD như sau: cột sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm),<br /> bước sóng phát hiện 240 nm, pha động acetonitril – nước (15:85), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng<br /> 1,0 ml/phút. Quy trình phân tích đã được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, tính<br /> tuyến tính (ŷ = 0,4761x, R 2 = 1,0000; 19,4 - 193,8 ppm) và miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại (RSD<br /> = 0,57%), độ chính xác trung gian (RSD = 0,49 %), độ đúng với tỷ lệ hồi phục trong khoảng 100,27 –<br /> 101,46% và độ bền với sự thay đổi cho phép thành phần acetonitril trong pha động là ± 4%.<br /> Kết luận: Quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC-DAD<br /> đã được xây dựng và thẩm định thành công. Quy trình này có thể được áp dụng để định lượng geniposid<br /> trong cao khô Dành dành, góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng từ khâu nguyên liệu ban đầu.<br /> Từ khóa: Gardenia Fructus, geniposid<br /> <br /> ABSTRACT<br /> DEVELOPMENT OF HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF GENIPOSIDE<br /> IN GARDENIA FRUCTUS DRY EXTRACT<br /> Tran Thanh Tam, Nguyen Duc Hanh, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Duc Tuan<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 132 – 142<br /> Background – Objectives: Gardenia Fructus has iridoid glycosides as the special chemical<br /> components in which geniposide and gardenoside have high content. Gardenia Fructus have been used for<br /> *<br /> <br /> Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Đồng Tháp<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> ***Bệnh viện Y học cổ truyền TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn<br /> ĐT: 0913799068<br /> **<br /> <br /> 132<br /> <br /> Email: ductuan@ump.edu.vn<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> treatment of hypertension for many years. In the Chinese Pharmacopoeia, the quality control index of<br /> Gardenia jasminoides is the content of geniposide. So far, there has been no publication for quantitative<br /> determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract. Therefore, this study was carried out with the<br /> aim of HPLC method development for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract that<br /> contribute to quality control of the input herbal materials.<br /> Method: The object of this study is Gardenia Fructus dry extract, which was supplied by BV Pharma<br /> joint-stock company. Method: Several chromatographic conditions such as mobile phase and C18 column<br /> with different suppliers for separation of geniposide in Gardenia Fructus dry extract, and several extraction<br /> conditions such as solvent, ratio of solvent and dry extract, and extraction time by ultrasonic, were<br /> investigated. Finally, the analytical procedure was validated according to ICH guidelines, including system<br /> suitability, selectivity, linearity and range, precision, accuracy and ruggedness.<br /> Results: The appropriate chromatographic conditions for quantification of geniposide in Gardenia<br /> Fructus dry extract were obtained on Gemini-NX C18 column (250 x 4.6 mm; 5 µm), DAD detector with<br /> detection wavelength at 240 nm, mixture of acetonitrile and water (15:85) as mobile phase, injection volume<br /> of 20 µL, flow rate of 1.0 ml/min. Validation results showed that the method was suitable for the HPLC<br /> system, selective, linear (ŷ = 0.4761x, R2 = 1.0000, 19.4 – 193.8 ppm) and range (61 – 92 ppm),<br /> repeatability (RSD = 0.57%), intermediate precision (RSD = 0,49%), accurate with the recoveries in the<br /> range of 100.27 – 101.46% of the expected values. The method was also ruggedness with the accepted<br /> fluctuation of acetonitrile within  4% in mobile phase.<br /> Conclusion: The RP-HPLC method for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract<br /> was successfully developed and validated. The method can be applied for quantification of geniposide in<br /> Gardenia Fructus dry extracts that contribute to quality control of the input herbal materials.<br /> Keywords: Gardenia Fructus, geniposide.<br /> <br /> ĐẶT VẤNĐỀ<br /> Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.,<br /> Rubiaceae), một loài cây được trồng và phát<br /> triển rất tốt ở các tỉnh miền Bắc nước ta, nổi<br /> bật bởi màu lá xanh bóng và hoa thơm trắng<br /> ngần. Đặc biệt, quả Dành dành với thành phần<br /> hóa học đặc trưng là các iridoid glycosid<br /> (trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là<br /> geniposid và gardenosid) đã được sử dụng từ<br /> lâu đời như một phương thuốc quý trong việc<br /> điều trị các bệnh như viêm gan, hạ huyết áp,<br /> đái tháo đường, lợi tiểu(4)…Dược điển Trung<br /> Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh<br /> dấu để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành.<br /> Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong<br /> nước công bố quy trình định lượng geniposid<br /> trong cao khô Dành dành. Vì vậy, việc xây<br /> dựng quy trình định lượng geniposid trong<br /> cao khô Dành dành bằng phương pháp HPLC<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> là cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng<br /> nguyên liệu cao khô Dành dành trước khi đưa<br /> vào sản xuất thành phẩm.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Cao khô Dành dành do công ty cổ phần BV<br /> Pharma cung cấp.<br /> Nguyên vật liệu<br /> <br /> Chất đối chiếu<br /> Geniposid (GP), hàm lượng 99,26%, do<br /> Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư Viện, Đại<br /> học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp.<br /> Trang thiết bị<br /> Hệ thống UHPLC Dionex Ultimate 3000,<br /> detector DAD – 3000 RS, cột sắc ký Gemini NX<br /> C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) và tiền cột Gemini<br /> NX C18 (4,0 x 3,0 mm; 5 µm), cột Zorbax XDB<br /> C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) và tiền cột Zorbax<br /> <br /> 133<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> XDB C18 (12,5 x 4,6 mm; 5 μm), cân phân tích<br /> A&D GH-202, bể siêu âm S60H – Elma.<br /> <br /> lệ và chiết bằng phương pháp siêu âm<br /> <br /> Hóa chất và dung mô<br /> Acetonitril và methanol đạt tiêu chuẩn<br /> dùng trong sắc ký lỏng (Merck) và nước cất 2<br /> lần đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng.<br /> <br /> Chọn tỷ lệ cao và dung môi chiết theo tiêu chí<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> Khảo sát điều kiện HPLC định lượng<br /> geniposid trong cao khô Dành dành:<br /> Dựa vào cấu trúc hóa học của GP và tham<br /> khảo một số tài liệu(3,5), kỹ thuật sắc ký lỏng<br /> hiệu năng cao pha đảo với đầu dò DAD đã<br /> được lựa chọn với điều kiện sắc ký ban đầu<br /> như sau: cột pha đảo C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm)<br /> và tiền cột tương ứng, thể tích tiêm 20 μl, bước<br /> sóng phát hiện là bước sóng hấp thụ cực đại<br /> của geniposid, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, pha<br /> động: acetonitril – nước. Tiến hành khảo sát<br /> pha động và cột sắc ký. Qua các khảo sát thực<br /> nghiệm, chọn được điều kiện sắc ký thích hợp<br /> sao cho pic geniposid đạt độ tinh khiết (theo<br /> phổ UV-Vis), tách hoàn toàn khỏi các pic tạp<br /> (nếu có) và có hệ số bất đối nằm trong khoảng<br /> 0,8 – 1,5.<br /> Khảo sát quy trình xử lý mẫu<br /> Khảo sát dung môi chiết GP<br /> Chiết cùng một lượng cao với các dung môi<br /> khác nhau như methanol, methanol 70%, 50%,<br /> 30% (tỷ lệ cao và dung môi chiết cố định) bằng<br /> siêu âm trong 10 phút, chuẩn bị 3 mẫu thử<br /> riêng biệt cho từng dung môi. Tiến hành sắc ký<br /> các dịch chiết. Chọn dung môi chiết GP theo các<br /> tiêu chí sau: diện tích pic và chiều cao pic lớn<br /> nhất, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5;<br /> độ phân giải lớn hơn 1,5; pic GP tinh khiết (theo<br /> phổ UV-Vis) và nồng độ methanol cao.<br /> Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP<br /> <br /> trong 10 phút. Tiến hành sắc ký dịch chiết.<br /> sau: hàm lượng GP chiết được cao nhất và<br /> chiều cao pic GP trong khoảng 0,2 – 0,8 AU.<br /> Khảo sát thời gian chiết<br /> Từ tỷ lệ cao và dung môi chiết đã được<br /> lựa chọn, tiến hành chiết siêu âm ở các thời<br /> điểm 3, 5, và 10 phút. Chuẩn bị 3 mẫu thử<br /> riêng biệt cho từng thời điểm. Tiến hành sắc<br /> ký các dịch chiết. Chọn thời gian chiết cho<br /> hàm lượng GP chiết được cao nhất.<br /> <br /> Thẩm định quy trình định lượng GP trong<br /> cao khô Dành dành<br /> Quy trình định lượng geniposid trong cao<br /> Dành dành được thẩm định theo hướng dẫn<br /> của ICH(2) về tính phù hợp hệ thống, tính chọn<br /> lọc, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính<br /> xác, độ đúng và độ bền.<br /> Chuẩn bị mẫu<br /> Mẫu đối chiếu GP gốc: Hòa tan một lượng<br /> chất đối chiếu GP trong methanol 50% để<br /> được dung dịch có nồng độ khoảng 2600 ppm.<br /> Mẫu đối chiếu GP: Pha loãng mẫu đối chiếu GP<br /> gốc với methanol 50% để thu được mẫu đối<br /> chiếu GP có nồng độ khoảng 77,5 ppm. Mẫu<br /> thử: Được chuẩn bị dựa vào các điều kiện khảo<br /> sát quy trình xử lý mẫu. Mẫu trắng: dung môi<br /> chiết và pha động.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Khảo sát điều kiện HPLC định lượng<br /> geniposid trong cao khô Dành dành<br /> Tiến hành khảo sát pha động acetonitril và<br /> nước với các tỷ lệ khác nhau. Hình 1 minh họa<br /> <br /> Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết đã<br /> <br /> sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và phổ UV<br /> <br /> được lựa chọn theo các tỷ lệ 1:1, 1:2 và 1:4.<br /> <br /> tại thời gian lưu của GP với tỷ lệ pha động<br /> <br /> Chuẩn bị 3 mẫu thử riêng biệt cho từng tỷ<br /> <br /> acetonitril – nước (15:85).<br /> <br /> 134<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và phổ UV tại thời gian lưu của GP.<br /> các pic tạp khác. Như vậy, pha động ACN –<br /> Nhận xét: Phổ UV tại thời gian lưu GP của<br /> H2O (15:85) được lựa chọn.<br /> mẫu đối chiếu có một cực đại hấp thụ tại 240<br /> nm nên được lựa chọn để định lượng GP. Pic<br /> GP đạt độ tinh khiết (peak purity match =<br /> 1000), có hệ số bất đối là 1,1 và tách hoàn toàn<br /> <br /> Hình 2 và Bảng 1 minh họa kết quả khảo<br /> sát cột sắc ký pha đảo C18 từ hai nguồn cung<br /> cấp khác nhau.<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thử khảo sát cột sắc ký<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br /> 135<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Bảng 1: Thông số sắc ký của GP tương ứng với cột sắc ký khảo sát (n=3)<br /> Cột<br /> Zorbax XDB C18<br /> Gemini NX C18<br /> <br /> tR<br /> (Phút)<br /> 7,047<br /> 7,389<br /> <br /> S<br /> (mAU*phút)<br /> 75,825<br /> 75,653<br /> <br /> H<br /> (mAU)<br /> 377,258<br /> 442,885<br /> <br /> As<br /> <br /> Rs1<br /> <br /> Rs2<br /> <br /> Nbk<br /> <br /> Độ tinh<br /> khiết<br /> <br /> 1,4<br /> 1,1<br /> <br /> 3,4<br /> 3,4<br /> <br /> 4,9<br /> 4,7<br /> <br /> 8765<br /> 12538<br /> <br /> 1000<br /> 1000<br /> <br /> Rs1: độ phân giải giữa GP và pic liền trước. Rs2: độ phân giải giửa GP và pic liền sau.<br /> <br /> Nhận xét: Pic GP đạt độ tinh khiết, có thời<br /> gian lưu (tR), diện tích pic (S) và độ phân giải<br /> không khác nhau nhiều giữa hai cột. Với cột<br /> Gemini NX C18, hệ số bất đối (As) pic GP là<br /> 1,1; số đĩa lý thuyết biểu kiến (Nbk) lớn hơn,<br /> chiều cao pic (H) GP gấp 1,2 lần so với cột<br /> Zorbax XDB C18. Như vậy, cột Gemini NX<br /> C18 được lựa chọn.<br /> <br /> Khảo sát quy trình xử lý mẫu<br /> <br /> Khảo sát dung môi chiết GP<br /> Hình 3 và Bảng 2 minh họa kết quả khảo<br /> sát dung môi chiết GP.<br /> Dung môi chiết<br /> Methanol<br /> Methanol 70%<br /> Methanol 50%<br /> Methanol 30%<br /> <br /> Hàm lượng GP (mg/g)<br /> 116,84<br /> 128,56<br /> 142,24<br /> 142,19<br /> <br /> Hình 3: Hàm lượng GP chiết được với các dung môi chiết khác nhau<br /> Bảng 2: Thông số sắc ký của GP tương ứng với dung môi chiết khảo sát (n=3)<br /> Dung môi<br /> Methanol<br /> Methanol 70%<br /> Methanol 50%<br /> Methanol 30%<br /> <br /> tR<br /> (phút)<br /> 7,328<br /> 7,343<br /> 7,354<br /> 7,355<br /> <br /> S<br /> (mAU*phút)<br /> 31,528<br /> 34,688<br /> 38,329<br /> 38,162<br /> <br /> Nhận xét: Cả 4 dung môi methanol,<br /> methanol 70%, 50%, 30% đều chiết được GP,<br /> tuy nhiên diện tích và chiều cao pic GP chiết<br /> được tăng dần theo thứ tự methanol <<br /> methanol 70% < methanol 50 %  methanol<br /> 30%; Pic GP đều tinh khiết, đạt hệ số bất đối<br /> và tách hoàn toàn các pic tạp. Như vậy,<br /> methanol 50% được chọn làm dung môi chiết<br /> GP trong cao Dành dành.<br /> <br /> 136<br /> <br /> H<br /> (mAU)<br /> 157,172<br /> 201,762<br /> 227,751<br /> 227,243<br /> <br /> As<br /> <br /> Rs1<br /> <br /> Rs2<br /> <br /> Nbk<br /> <br /> Độ tinh khiết<br /> <br /> 0,94<br /> 1,05<br /> 1,06<br /> 1,07<br /> <br /> 4,0<br /> 4,5<br /> 4,4<br /> 4,4<br /> <br /> 3,5<br /> 4,6<br /> 4,8<br /> 4,8<br /> <br /> 8878<br /> 12194<br /> 12715<br /> 12808<br /> <br /> 1000<br /> 1000<br /> 1000<br /> 1000<br /> <br /> Khảo sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP<br /> Hình 4 và Bảng 3 minh họa kết quả khảo<br /> sát tỷ lệ cao và dung môi chiết GP.<br /> Tỷ lệ cao và dung môi<br /> (mg/ml)<br /> 1:1<br /> 1:2<br /> 1:4<br /> <br /> Hàm lượng GP<br /> (mg/g)<br /> 142,27<br /> 142,24<br /> 142,36<br /> <br /> Chuyên Đề Dược<br /> <br />