Xây dựng quy trình multiplex PCR định týp gen VacA và CagA trên mẫu mô sinh thiết ung thư dạ dày

XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR ĐỊNH TÝP GEN<br /> vacA VÀ cagA TRÊN MẪU MÔ SINH THIẾT UNG THƯ DẠ DÀY<br /> Lê Thị Thanh Bình*, Trần Thiện Trung**<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn ñề: ung thư dạ dày là căn bệnh gây tử vong ñứng hàng thứ II trên thế<br /> giới chỉ sau ung thư phổi. Helicobacter pylori (H. pylori) ñược Viện Nghiên Cứu Ung<br /> Thư Quốc Tế xếp loại là tác nhân loại I gây UTDD vào năm 1994 dựa trên hai<br /> protein gây ñộc chính là VacA và CagA .<br /> Mục tiêu: xây dựng quy trình Multiplex PCR nhằm xác ñịnh nhanh ñồng thời các<br /> týp gen vacA và cagA của Helicobacter pylori từ mẫu mô sinh thiết ung thư dạ dày.<br /> Phương pháp: ñun mô sinh thiết trong dung dịch ñệm PBS, tối ưu chương trình<br /> nhiệt và các thành phản ứng cho quy trình Multiplex PCR, ñiện di, giải trình tự, ño ñộ<br /> nhạy của quy trình, so sánh kết quả quy trình với hai tiêu chuẩn vàng CLOtest và<br /> Chẩn ñoán mô bệnh học (Giải phẫu bệnh).<br /> Kết quả: xây dựng thành công quy trình có ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu hoàn toàn phù<br /> hợp với kết quả CLOtest, chẩn ñoán mô bệnh, kết quả giải trình tự và các kết quả<br /> nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước.<br /> Kết luận: quy trình có thể ñưa vào ứng dụng ñể xác ñịnh các kiểu gen vacA và<br /> cagA của Helicobacter pylori trên bệnh nhân ung thư dạ dày và những bệnh nhân bị<br /> viêm loét dạ dày tá tràng ñể phân loại nhóm nguy cơ cao và nguy cơ thấp. Từ ñó ñưa<br /> ra chiến lược tầm soát và ñiều trị H. pylori triệt ñể góp phần dự phòng UTDD.<br /> Từ khóa: Helicobacter pylori, ung thư dạ dày, quy trình Multiplex PCR.<br /> ABSTRACT<br /> ESTABLISHING A MULTIPLEX PCR FOR GENOTYPING OF vagA AND<br /> cagA GENES OF HELICOBACTER PYLORI FROM GASTRIC CANCER<br /> BIOPSY SAMPLES<br /> Le Thi Thanh Binh, Tran Thien Trung<br /> Background: gastric cancer (stomach cancer) is the second most common cause<br /> of death worldwide behind cancer of the lung. Helicobacter pylori has been as a<br /> class I carcinogen by the International Agency for Research on Cancer 1994 through<br /> VacA and CagA proteins.<br /> Objective: establishing a multiplex PCR for identification of the vagA and the<br /> cagA genes of Helicobacter pylori from gastric cancer biopsies.<br /> Methods: from 88 biopsy samples of 44 pattients with gastric cancer, boiling of<br /> biopsy samples in sterile PBS buffer, optimization of multiplex PCR cycling<br /> conditions and of Multiplex reaction components, centrifugation followed by PCR<br /> assay, sequencing PCR products, and comparing results of PCR with two gold standard CLOtest and histology.<br /> * Bệnh viện Từ Dũ. Liên hệ: Bs Lê Thị Thanh Bình- ĐT: 0909519398<br /> Email: lebinh.genetic@gmail.com<br /> ** Đại học Y Dược TPHCM<br /> <br /> 1<br /> <br /> Results: process gains specificity and the sensittivity suiting the results of<br /> CLOtest, histology, sequencing, studying of authors in country and in the world.<br /> Conclution: This Multiplex PCR assay could apply to determine vacA and cagA<br /> of H. pylori from biopsy specimens of gastric cancer, gastritis or peptic ulcer patients<br /> to class high risk and low risk groups. From the results, clinicals could establish a<br /> strategy for screening and eradicating absolutely H. pylori to prevent gastric cancer.<br /> Keywords: Helicobacter pylori, Gastric cancer, multiplex PCR.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư dạ dày (UTDD) là dạng ung thư phổ biến gây tử vong ñứng hàng thứ II<br /> trên thế giới chỉ sau ung thư phổi. Ung thư dạ dày phát triển chậm qua nhiều năm, tỷ<br /> lệ sống sót thấp nguyên nhân là do phần lớn bệnh thường ñược chẩn ñoán muộn nên<br /> khả năng ñiều trị triệt ñể thấp vì giai ñoạn sớm có ít hoặc không có triệu chứng ñặc<br /> hiệu.<br /> Theo thống kê dịch tễ học và kết quả của các công trình nghiên cứu cho ñến nay,<br /> nhiễm Helicobacter pylori (H. pylori) ñược xem là nguyên nhân quan trọng dẫn ñến<br /> UTDD dựa trên hai protein gây ñộc chính của H. pylori là CagA và VacA. Hai vùng<br /> gen mã hóa cho hai protein này là hai vùng gen ña hình tạo nên các chủng của H.<br /> pylori có ñộc lực khác nhau. Theo Xiang và cs (1995), H. pylori ñược chia thành 2<br /> týp: týp 1 bao gồm các chủng H. pylori có ñộc lực mang kiểu gen s1m1cagA+,<br /> s1m2cagA+ ; týp 2 gồm các chủng H. pylori không có ñộc lực mang kiểu gen<br /> s2m2cagA- [17]. Từ những tính ñộc lực khác nhau này sẽ dẫn ñến các mức ñộ bệnh<br /> khác nhau của dạ dày - tá tràng như viêm dạ dày, loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ<br /> dày. Như vậy có thể thấy việc tầm soát và ñiều trị triệt ñể H. pylori là biện pháp dự<br /> phòng cho ung thư dạ dày. Phương pháp sinh học phân tử là phương pháp duy nhất có<br /> thể giúp xác ñịnh chính xác kiểu gen của H. pylori thuộc nhóm nguy cơ cao hay nguy<br /> cơ thấp gây UTDD.<br /> Chúng tôi xây dựng quy trình Multiplex PCR với mục tiêu xác ñịnh nhanh ñồng<br /> thời các týp gene vacA và cagA của H. pylori trong cùng một phản ứng từ mẫu sinh<br /> thiết của bệnh nhân bị ung thư dạ dày sao cho chính xác và hiệu quả kinh tế.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Chọn mẫu bệnh phẩm : là các mẫu mô sinh thiết dạ dày ñược lấy bằng kỹ thuật<br /> nội soi từ 44 bệnh nhân bị ung thư dạ dày ở 2 vị trí mô lành và mô bệnh tại hang vị<br /> của dạ dày và ñược làm cùng một lúc 3 xét nghiệm chẩn ñoán H. pylori : CLO test<br /> (test urease), Chẩn ñoán mô học (giải phẫu bệnh) và chẩn ñoán bằng PCR. Nguồn thu<br /> mẫu : bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM. Trữ mô ở nhiệt ñộ – 200C.<br /> Mồi: sử dụng 3 cặp mồi ñặc hiệu của H. pylori là CAGA, Va1 và VAG từ công<br /> trình nghiên cứu của Yamaoka và cs (1999), Cover và cs (1994) và Atherton và cs<br /> (1995); 1 cặp mồi chứng nội hGSTP từ công trình của Menegon và cs (1998). Kiểm<br /> tra tính không bắt cặp bổ sung và ñộ ñặc hiệu của các cặp mồi trên các phần mềm<br /> chuyên dụng. Các cặp mồi này ñược tổng hợp từ công ty IDT (Hoa Kỳ) [1,5,10,18].<br /> Chứng nội tại dương tính sẽ chứng minh ñược khâu tách chiết và khuếch ñại ñộ nhạy<br /> không bị ức chế [16].<br /> DNA của mẫu mô : ñược thu nhận từ mẫu mô ñun trong dung dịch ñệm PBS vô<br /> trùng. Các vật liệu và hóa chất khác: thang 100 bp Marker (Bio - Rad), Taq DNA<br /> polymerase (Bio - Rad) kèm theo dNTPs, PCR buffer, MgCl2, và H2O khử ion của<br /> hãng; PBS vô trùng; hóa chất dùng cho ñiện di do công ty Khoa Thương cung cấp.<br /> <br /> 2<br /> <br /> Quy trình Multiplex PCR : khuếch ñại ñồng thời nhiều cặp mồi trong cùng một<br /> phản ứng.<br /> Nguyên tắc khi chuẩn hóa quy trình: (1) ñầu tiên chọn ra chu trình nhiệt cho<br /> PCR mồi ñơn nhưng phù hợp với các cặp mồi ñể làm cơ sở cho việc chuẩn hóa quy<br /> trình PCR mồi ña. Chu trình ñược áp dụng trên cùng một loại máy luân nhiệt; (2) sử<br /> dụng các cặp mồi cùng một nồng ñộ ở bước ñầu tiên, sau ñó dựa vào kết quả phản<br /> ứng sẽ cho biết bước tiếp theo cần phải ñiều chỉnh nồng ñộ mồi và các tham số khác<br /> như thế nào; (3) khi tối ưu một thành phần nào ñó trong phản ứng thì những thành<br /> phần còn lại sẽ ñược giữ cố ñịnh.<br /> Thành phần mix PCR mồi ñơn ban ñầu: Taq DNA polymerase (1U/25µl); 1 cặp<br /> mồi (0,2 µM); MgCl2 (1,5 mM); dNTPs (200 µM/mỗi loại); dung dịch ñệm (1X);<br /> dH20; DNA khuôn (5µl).<br /> Chương trình nhiệt PCR mồi ñơn ban ñầu: (1) Nhiệt ñộ : nhiệt ñộ biến tính là<br /> 95 C, nhiệt ñộ lai là 520C và nhiệt ñộ kéo dài là 720C; (2) Chu kỳ nhiệt: 1 chu kỳ ñầu<br /> tiên là 950C trong 3phút 30 giây; 35 chu kỳ tiếp theo, mỗi chu kỳ gồm : 940C trong 20<br /> giây, 620C trong 40 giây, 720C trong 40 giây; (3) 1 chu kỳ cuối là 720C trong 6 phút.<br /> 0<br /> <br /> Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 3% với 3µl thang DNA 100bp, 5µl dd<br /> nạp mẫu 1X, 9µl sản phẩm PCR, 8 µl ethidium bromide (10mg/ml), hiệu ñiện thế U=<br /> 100Volt trong 35 - 40 phút.<br /> Đánh giá ñộ nhạy của quy trình: dựa trên mẫu sinh thiết ñã biết chắc chắn<br /> dương tính, ño nồng ñộ DNA trong dung dịch, pha loãng theo log cơ số 10 với các<br /> nồng ñộ 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 và sau ñó xác ñịnh nồng ñộ DNA tối thiểu<br /> trong phản ứng PCR có thể phát hiện ñược H. pylori.<br /> Đánh giá ñộ ñặc hiệu của sản phẩm PCR [16]: gửi giải trình tự 3 sản phẩm PCR<br /> của 3 bệnh nhân ở CTY Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả ñược giải theo lần lượt từng<br /> cặp mồi xuôi và ngược. Đọc kết quả trình tự bằng công cụ Blast trên NCBI.<br /> So sánh hiệu quả chẩn ñoán của quy trình với kết quả của hai tiêu chuẩn vàng<br /> CLO test và Chẩn ñoán mô bệnh học. [13]<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Khảo sát vị trí mô<br /> Kết quả khảo sát sơ bộ sự hiện diện của H. pylori trong 32 mẫu bệnh phẩm từ 8<br /> bệnh nhân có kết quả CLOtest dương tính cho thấy tỷ lệ H. pylori dương tính ở mô<br /> lành cao hơn mô bệnh (mô lành là 87,5 % và mô bệnh là 75,0 %). Kết quả trên cũng<br /> phù hợp với nguyên lý của Mobley và cs (2001) [15] về tính bám dính và xâm thực của<br /> H. pylori cũng như sự nhận ñịnh của El - Zimaity (2000) [6], Tang YL và cs (2005) [14],<br /> Chey WD, Wong BCY. (2007) [4] và Nguyễn Ngọc Huyền (2009) [12] về cách chẩn<br /> ñoán sự hiện diện của H. pylori trên mẫu mô sinh thiết. Vì vậy chúng tôi quyết ñịnh<br /> chọn mẫu ở vị trí mô lành ñể tiếp tục cho quy trình nghiên cứu tiếp theo.<br /> Hình 1: Kết quả khảo sát sự hiện diện của H.pylori ở các vị trí mô lành và mô<br /> bệnh có kết quả CLO test dương tính. Sử dụng cặp mồi CAGA ñể khảo sát.<br /> Ký hiệu mẫu: 1,2: mô bệnh; 3,4 : mô lành; .<br /> <br /> 3<br /> <br /> cagA<br /> 349 bp<br /> <br /> Khảo sát nồng ñộ mồi và chương trình nhiệt (mẩu DNA ñược dùng tối ưu là<br /> những mẫu ñã ñược giải trình tự có kết quả hoàn toàn ñặc hiệu với H. pylori)<br /> Tiêu chí ñể chúng tôi khảo sát nhiệt ñộ lai là nhiệt ñộ này phải phù hợp với các<br /> cặp mồi của H. pylori và cặp mồi chứng nội hGSTP sao cho các cặp mồi này ñạt hiệu<br /> quả khuếch ñại cao nhất trong cùng một phản ứng PCR. Đầu tiên chúng tôi khảo sát<br /> chương trình nhiệt PCR một cặp mồi trước, sau ñó lấy kết quả vừa khảo sát làm cơ sở<br /> ñể chuẩn hóa chương trình nhiệt cho quy trình Multiplex PCR 4 cặp mồi. Chúng tôi<br /> ñưa ra nhiều chương trình (khác nhau về nhiệt ñộ lai, số chu kỳ luân nhiệt, thời gian<br /> biến tính, thời gian lai và thời gian kéo dài). Chúng tôi ñiều chỉnh nhiệt nồng ñộ mồi<br /> theo nhiệt ñộ lai. Cuối cùng chúng tôi ñã tìm ñược một chương trình nhiệt chuẩn cho<br /> quy trình Multiplex PCR ((hình 2,3) với nhiệt ñộ lai là 620C, nồng ñộ 4 cặp mồi lần<br /> lượt là : VAG 0,2 µM; CAGA 0,2 µM; VA1 0,5 µM; hGSTP 0,4 µM.<br /> <br /> Hình 2 : Kết quả khảo sát nồng ñộ mồi cùng với các<br /> nhiệt ñộ lai 610C, 620C, 630C, 650C cho 4 cặp mồi<br /> VAG, VA1, CAGA và hGSTP trên 3 bệnh nhân<br /> trong hệ thống Multiplex PCR 4 cặp mồi.; Nồng ñộ<br /> hai cặp mồi VAG và CAGA là 0,2 µM/ 1 cặp mồi;<br /> Nồng ñộ hai cặp mồi VA1(s1/s2) và hGSTP là 0,4<br /> µM / 1 cặp mồi; Mũi tên : là những vạch band không<br /> ñặc hiệu.<br /> <br /> Hình 3 : Kết quả khảo sát nồng ñộ<br /> mồi cùng với các nhiệt ñộ lai 610C,<br /> 620C cho 4 cặp mồi VAG, VA1,<br /> CAGA và hGSTP trên 3 bệnh nhân<br /> trong hệ thống Multiplex PCR. Nồng<br /> ñộ hai cặp mồi VAG và CAGA là<br /> 0,2 µM/ 1 cặp mồi; Nồng ñộ cặp mồi<br /> VA1 là 0,5 µM và hGSTP là 0,4 µM.<br /> <br /> Tối ưu các thành phần phản ứng<br /> Khảo sát nồng ñộ Taq DNA polymerase<br /> Hình 4 : Khảo sát nồng ñộ Taq DNA polymerase trên 3 bệnh nhân với các nồng ñộ 1U,<br /> 2U, 2,5U và 3U<br /> <br /> Kết quả cho thấy Taq DNA<br /> polymerase với nồng ñộ 2U cho<br /> phản ứng tối ưu phù hợp với nồng<br /> <br /> 4<br /> <br /> ñộ Taq DNA polymerase trong thành phần mix multi PCR của chúng tôi ñưa ra và<br /> phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước ñây [2,8,9]. Như vậy, nồng ñộ Taq DNA<br /> polymerase chuẩn là 2U.<br /> Khảo sát chỉ số MgCl2 /dNTPs<br /> Đây là chỉ số quan trọng nhất của quy trình, quyết ñịnh hoạt tính của Taq DNA<br /> polymerase. Ion Mg2+ là cofactor của Taq DNA polymerase. Mg2+ tự do gắn vào Taq<br /> DNA polymerase giúp Taq pol. có thể gắn vào DNA khuôn, vào mồi, vừa gắn vào<br /> dNTPs ñể thực hiện sự tổng hợp. Điều này giải thích tại sao tăng nồng ñộ dNTP lên<br /> cao, sẽ ức chế nhanh phản ứng PCR trong khi tăng nồng ñộ MgCl2 lên cao thường tạo<br /> ra hiệu quả dương tính. Tuy nhiên nếu nồng ñộ MgCl2 quá cao sẽ ức chế hoạt tính của<br /> Taq polymerase, làm giảm số lượng sản phẩm mong muốn.<br /> Giữ nguyên nồng ñộ của các thành phần khác trong mix PCR, chúng tôi lần lượt<br /> thay ñổi nồng ñộ MgCl2 và dNTPs. Kết quả (hình 5 và 6) cho thấy, MgCl2 ở nồng ñộ<br /> 3,5 mM và dNTPs ở nồng ñộ 400 µM cho kết quả sản phẩm PCR ñặc hiệu, rõ, ñẹp và<br /> ổn ñịnh hơn so với các nồng ñộ khác. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu<br /> của các tác giả Newton CR và cs (1997), và Grunenwald H (2003) [7,11]; Henegariu O<br /> (1997) [9]; Zangenberg G và cs (1999) [19].<br /> <br /> Hình 5 : Kết quả khảo sát nồng ñộ MgCl2 với các Hình 6 : Kết quả khảo sát nồng<br /> nồng ñộ 1,5mM, 2mM, 2,5mM, 3mM, 3,5mM, ñộ dNTPs với các nồng ñộ 200<br /> 10,8mM, 20mM<br /> µM, 400 µM và 800 µM; Mũi tên<br /> ñen: các băng không ñặc hiệu.<br /> <br /> Khảo sát nồng ñộ dung dịch ñệm và chất hỗ trợ phản ứng DMSO 5%<br /> Nồng ñộ dung dịch ñệm chuẩn cho một phản ứng<br /> PCR mồi ñơn phụ thuộc vào loại enzyme DNA<br /> polymerase sử dụng. Đối với Taq polymerase, nồng<br /> ñộ ñệm thường là 1X (50 mM KCl; 10 mM Tris - HCl<br /> pH 8,3 và 50 mM KCl; 0,001% gelatin) (Cetus buffer).<br /> Trong hệ thống multiplex PCR, nồng ñộ ñệm có<br /> thể ñược tăng lên 1,6X (Chamberlain và cs, 1988)<br /> hoặc lên ñến 2X (Henegarin và cs, 1997) ñể làm tăng<br /> hiệu quả hoạt ñộng của Taq polymerase.<br /> Hình 7 : Kết quả khảo sát nồng ñộ dung dịch ñệm với các giá trị<br /> 1X; 1,6X; 2X và DMSO 5%<br /> <br /> 5<br /> <br />