Xây dựng quy trình xác định Asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC – ICP/MS

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ASEN VÔ CƠ TRONG CÁ<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – ICP/MS<br /> Nguyễn Hữu Phát*, Cù Hoàng Yến*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Asen tồn tại trong tự nhiên ở dạng Asen hữu cơ và Asen vô cơ (iAs), dạng Asen vô cơ có độc<br /> tính cao hơn dạng Asen hữu cơ. Thủy hải sản là một nguồn tích tụ Asen sinh học, hàm lượng Asen tổng trong<br /> các sinh vật của thủy quyển luôn cao hơn nhiều so với các loài động vật trên đất liền, việc đánh giá chất lượng<br /> thủy hải sản thông qua hàm lượng Asen tổng là không chính xác. Để đánh giá chính xác chất lượng thủy hải sản,<br /> việc xác định các dạng tồn tại khác nhau của Asen là rất cần thiết, hiện nay kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ<br /> plasma (LC-ICP/MS) là lựa chọn hàng đầu với những ưu điểm như lượng mẫu ít, độ chọn lọc và độ nhạy cao.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định Asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC-ICP/MS.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát quá trình tách và định lượng Asen vô cơ ra khỏi các dạng Asen hữu cơ<br /> trong cá nước ngọt và nước mặn bằng cột trao đổi anion trên hệ thống sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma.<br /> Kết quả nghiên cứu: Quy trình xác định Asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC-ICP/MS có giới hạn<br /> phát hiện (MLOD) và giới hạn định lượng (MLOQ) là 15 ng/g và 50 ng/g. Độ lặp lại của phương pháp ở 3 nồng<br /> độ iAs 50, 1000 và 2000 ng/g có RSD < 15%, hiệu suất thu hồi ở nồng độ tương ứng dao động từ 97,9-99,1% và<br /> độ không đảm bảo đo của phương pháp là 11%.<br /> Kết luận: Phương pháp sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma sử dụng cột trao đổi anion là phương pháp phân<br /> tích chính xác để định lượng Asen vô cơ trên nền mẫu cá.<br /> Từ khóa: Asen vô cơ, cá, LC-ICP/MS.<br /> ABSTRACT<br /> DEVELOPMENT OF LIQUID CHROMATOGRAPHY-INDUCTIVELY COUPLED PLASMA MASS<br /> SPECTROMETRY METHOD FOR THE DETERMINATION OF INORGANIC ARSENIC IN FISH<br /> Nguyen Huu Phat, Cu Hoang Yen * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 381 - 386<br /> <br /> Background: Arsenic is usually divided into two main groups: organic arsenic form and inorganic arsenic<br /> form (iAs) in natural environment. The inorganic forms of arsenic are more toxic than organic form. Arsenic does<br /> bio accumulate in seafood. Total arsenic level of organisms in the hydrosphere are always higher than land-<br /> animals. Quality evaluation of aquatic products through total arsenic levels are inaccuracy. Recently, HPLC<br /> followed by detection using ICP-MS allows low sample volume injection, with high selectivity and high<br /> sensitivity.<br /> Objectives: Establishment of a new method for determination of inorganic arsenic in fish by LC-ICP-MS.<br /> Methods: Survey of separation and quantification inorganic arsenic species are conducted by anion exchange<br /> liquid chromatography inductively coupled plasma - mass spectrometry.<br /> Results: The limits of determination (MLOD) and the limits of quantitation (MLOQ) for iAs in fish were<br /> 15ng/g and 50ng/g respectively. At three fortification levels (50 – 1000 – 2000 ng/g), the overall recoveries range<br /> from 97.9 to 99.1% with RSD values less than 15%.<br /> <br /> <br /> * Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: Ths. Nguyễn Hữu Phát ĐT: 0969241883 Email: huuphatk@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 381<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> Conclusion: Anion exchange liquid chromatography inductively coupled plasma - mass spectrometry was<br /> accurate analytical method for quantitation of inorganic arsenic in fish samples.<br /> Keywords: inorganic Arsenic, fish, LC-ICP/MS.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ: Nhằm phục vụ công tác đảm bảo an toàn vệ<br /> sinh thực phẩm, cụ thể là kiểm soát hàm lượng<br /> Thủy hải sản là một nguồn tích tụ Asen<br /> Asen vô cơ trong các sản phẩm cá, chúng tôi tiến<br /> sinh học vô cùng lớn trong tự nhiên, hàm<br /> hành thực hiện xây dựng quy trình xác định<br /> lượng Asen tổng trong các sinh vật của thủy<br /> Asen vô cơ trong cá bằng phương pháp LC-<br /> quyển luôn cao hơn nhiều so với các loài động<br /> ICP/MS trên cột trao đổi anion.<br /> vật trên đất liền. Tuy nhiên, quá trình chuyển<br /> hóa của Asen trong thủy quyển thường tạo Mục tiêu nghiên cứu:<br /> hợp chất Asenbetoine, một dạng Asen hữu cơ Xây dựng quy trình xác định Asen vô cơ<br /> rất bền và độc tính thấp(3). Trong các loài tôm trong cá bằng phương pháp LC-ICP/MS.<br /> và cá, hàm lượng Asen vô cơ thường thấp hơn ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> 0,1 % trong tổng số Asen có trong sinh vật.<br /> DMA (dimethylarsinic acid) và MMA Đối tượng nghiên cứu<br /> (monomethylarsonic acid, Quy trình xác định Asen vô cơ trên nền mẫu<br /> monomethylarsonous acid) cũng tồn tại ở cá nước ngọt và cá nước mặn bằng thiết bị sắc ký<br /> lượng rất thấp trong thủy hải sản, một số loài lỏng kết nối quang phổ ghép cặp plama đầu dò<br /> như cá ngừ thường không tích tụ DMA, MMA khối phổ.<br /> trong cơ thể(2). Như vậy, việc đánh giá chất Phương pháp nghiên cứu<br /> lượng của mặt hàng thủy hải sản thông qua<br /> Thiết bị<br /> hàm lượng Asen tổng là không chính xác. Các<br /> kết quả phân tích khi được công bố sẽ gây ảnh Cân phân tích (độ nhạy 0,1 mg), máy xử lý<br /> hưởng không nhỏ đến nhà sản xuất cũng như mẫu vi sóng ETHOS-1, máy vortex, cột sắc ký<br /> gây bất an trong dư luận. PRP-X100 (150mm × 4,1 mm (id), anion<br /> exchange – HAMILTON), hệ thống LC-<br /> Hiện nay kỹ thuật LC-ICP/MS là lựa chọn<br /> ICP/MS AGILENT 7700x.<br /> hàng đầu cho các ứng dụng phân tích các dạng<br /> tồn tại khác nhau của Asen. Kỹ thuật này có Hóa chất<br /> những ưu điểm như lượng mẫu ít, độ nhạy Nước cất siêu sạch — 18 MΩ; Ammonium<br /> cao(4). Hai dạng sắc ký lỏng thường dùng trong hydroxide suprapur (NH4OH 25%),<br /> phân tích nguyên dạng Asen là sắc ký ghép cặp Hydrochloric acid (HCl 37%), Nitric acid (HNO3<br /> ion và sắc ký trao đổi ion (trao đổi anion và 65%), Hydrogen peroxide (H2O2 30%),<br /> cation). Tuy nhiên, để phân tích nguyên dạng Ammonium carbonate ((NH4)2CO3), Asenate<br /> Asen vô cơ (tồn tại dạng anion trong môi trường Stock Standard (As(V)) 1000 mg/L MERCK,<br /> trung tính và kiềm), phương pháp sắc ký trao Asenite Stock Standard (As(III)) 1000 mg/L<br /> đổi anion đã được các nhà khoa học trên thế giới INORGANIC VENTURE, Dimethylarsinic acid<br /> lựa chọn nghiên cứu như tác giả LAsen – 2005(5), (DMA), Disodium methyl arsonate hexahydrate<br /> Sang-Ho Nam – 2006(6), Georg Raber – 2012(7), (monomethylarsonic acid, MMA), Asenobetaine<br /> Rasmussen – 2012(8) cũng như được dùng trong (AsB) SIGMA ALDRICH.<br /> các phương pháp được đề xuất bởi cơ quan kiểm Điều kiện sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma<br /> soát chất lượng thực phẩm Hoa Kỳ (FDA – EAM (LC-ICP/MS):<br /> 4-11) cùng với các hãng thiết bị LC-ICP/MS<br /> Sử dụng thiết bị LC-ICP/MS với kỹ thuật sắc<br /> (Agilent, PerkinElmer).<br /> ký trao đổi anion trong môi trường pH 8,5 để<br /> <br /> <br /> 382 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> tách dạng Asen (V) ra khỏi các dạng Asen hữu bảng 1.<br /> cơ. Các thông số cụ thể được trình bày trong<br /> Bảng 1: Điều kiện vận hành thiết bị LC-ICP/MS<br /> ICP/MS LC<br /> Năng lượng 1500 W Pha động 30 mM (NH4)2CO3<br /> Dòng Argon tạo plasma 15 L/phút pH 8,50 (± 0,05)<br /> Khí phụ trợ 1,0 L/phút Tốc độ dòng 1,0 mL/phút<br /> Khí mang Tùy thuộc vào chế độ Auto Tune Thể tích tiêm 100 µL<br /> Kiểu phun sương Glass concentric Loại khí Có<br /> Độ sâu torch Tùy thuộc vào chế độ Auto Tune Nhiệt độ cột Nhiệt độ phòng<br /> Tốc độ bơm 0,3 vòng/phút (~1 mL/phút)<br /> 150mm×4,1 mm (id) Hamilton<br /> Nhiệt độ buồng phun sương 2°C Loại cột<br /> PRP-X100 anion exchange<br /> Bộ va chạm Không sử dụng nhằm tăng tín hiệu<br /> Khối ion m/z 75 Thời gian lấy tín hiệu 10 phút<br /> Thời gian lấy tín hiệu 0,8 s (m/z 75)<br /> <br /> Xử lý mẫu độ thấp hơn và thực hiện lại thí nghiệm, tính<br /> Asen trong mẫu cá được chiết khỏi nền mẫu toán lại giá trị R.<br /> bằng hỗn hợp dịch chiết (HCl 0,06 M – 3% H2O2) (d) Độ chính xác và độ đúng của phương<br /> trong lò vi sóng 25 phút ở nhiệt độ 900C. Sau đó pháp được đánh giá thông qua độ lặp lại cùng<br /> mẫu được ly tâm 10 phút với tốc độ 4500 với độ tái lặp nội bộ (RSD %) và hiệu suất thu<br /> vòng/phút, lọc qua màng lọc 0,45 µL và pha hồi H (%) của mẫu thêm chuẩn ở 3 nồng độ: 50<br /> loãng với tỉ lệ 1: 1 bằng (NH4)2CO3 60mM(8). ng/g, 1000 ng/g và 2000 ng/g. Độ lặp lại được<br /> thực hiện bởi 1 kiểm nghiệm viên trong khi độ<br /> Xác định các thông số của phương pháp<br /> tái lặp nội bộ được thực hiện tương tự với một<br /> (a) Độ chọn lọc của phương pháp LC-<br /> kiểm nghiệm viên khác. Hệ số RSD (%) phải <<br /> ICP/MS được xác định dựa trên số khối đặc<br /> 15% và H (%) phải nằm trong khoảng 75 – 125%.<br /> trưng của Asen và khả năng phân tách trên cột<br /> (e) Độ không đảm bảo đo được tính toán<br /> sắc ký.<br /> theo độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm và độ<br /> (b) Độ tuyến tính được đánh giá thông qua<br /> chệch của phương pháp.<br /> hệ số tương quan r > 0,997 của phương trình hồi<br /> quy của đường chuẩn thể hiện mối tương quan KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> giữa tỷ lệ diện tích peak sắc ký và nồng độ chất Điều kiện phân tích bằng LC-ICP/MS<br /> phân tích.<br /> Sau khi áp dụng các thông số sắc ký lỏng và<br /> (c) Giới hạn phát hiện (MLOD) và giới hạn khối phổ vào phân tích dịch chiết của mẫu cá lóc<br /> định lượng (MLOQ) của phương pháp được được thêm chuẩn các dạng Asen: DMA, MMA,<br /> thực hiện thí nghiệm và tính toán theo hệ số R AsB, As(III), As(V). Kết quả thu được sắc ký đồ<br /> với lượng thêm chuẩn 50 ng/g, giá trị như trong hình 1.<br /> MLODđược xác định như sau:<br /> Từ sắc ký đồ mẫu thực có thể thấy trong cá<br /> x tồn tại một lượng đáng kể các dạng Asen hữu cơ<br /> R<br /> LOD  3  SD LOD không tương tác với cột sắc ký. AsB được dùng<br /> như chất đại diện cho tất cả các dạng Asen hữu<br /> Nếu 4 < R < 10 thì giá trị MLOD phù hợp và<br /> cơ không có tương tác với cột sắc ký trao đổi<br /> đáng tin cậy, nếu 4 < R thỉ cần thêm chuẩn nồng<br /> anion (dạng Asen hữu cơ dạng cation hoặc trung<br /> độ cao hơn và thực hiện lại thí nghiệm, tính toán<br /> hòa). Bên cạnh đó, với pha động được lựa chọn,<br /> lại giá trị R, nếu R > 10 thì cần thêm chuẩn nồng<br /> dạng As(V) cần phân tích được tách tốt khỏi các<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 383<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> dạng Asen khác và thời gian phân tích cho mỗi pháp chiết cho thấy không có sự khác biệt giữa 2<br /> mẫu tương đối ngắn giúp giảm lượng muối kết quả (bảng 2), tthực nghiệm ( 1,50) < tlý thuyết (2,07).<br /> đóng vào gây tắc nghẽn thiết bị. Như vậy có thể khẳng định rằng dung dịch chiết<br /> (HCl 0,06 M – H2O2 3%) đã chiết toàn bộ các<br /> dạng Asen ra khỏi nền mẫu trong thời gian 25<br /> phút ở nhiệt độ 90oC.<br /> Đánh giá khả năng oxi hóa As (III)<br /> Sau khi thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 50,<br /> 1000 và 2000 ng/g As(III) vào mẫu cá lóc. Hiệu<br /> Mẫu cá lóc<br /> suất oxy hóa As(III) được đánh giá thông qua tỷ<br /> lệ nồng độ As(V) có trong dịch chiết và nồng độ<br /> As(III) thêm vào ban đầu. Thực hiện phân tích<br /> A<br /> các mẫu thêm chuẩn này và ghi nhận lượng<br /> As(V) có trong dịch chiết, kết quả bảng 3.<br /> Bảng 3: Khả năng oxi hóa As(III) của dung dịch chiết<br /> Nồng độ As (III) thêm vào<br /> Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu thật và mẫu thêm chuẩn 50 1000 2000<br /> mẫu(ng/g)<br /> hỗn hợp các dạng Asen Nồng độ As (V) (ng/g) 51,5 1005 1915<br /> %RSD 3,00 4,74 4,58<br /> Đánh giá khả năng chiết<br /> H% trung bình 103,0 100,4 95,8<br /> Phân tích mẫu sau khi vô cơ hóa theo AOAC H% Min 97,0 94,0 87,3<br /> 986.15 (xử lý khô - ướt kết hợp) và chiết theo quy H% Max 109,0 109,5 102,5<br /> trình của tác giả Rasmussen, kết quả được thể Khảo sát khả năng oxy hóa của dịch chiết<br /> hiện ở bảng 2. cho thấy 95,8% As(III) (ở mức 2000 ng/g) và<br /> Bảng 2: Kết quả phân tích Asen tổng trong mẫu cá 100% As(III) (ở mức 50, 1000 ng/g) được oxy<br /> lóc theo bằng phương pháp AOAC 986.15 và phương hóa thành As(V), các dạng Asen hữu cơ hoàn<br /> pháp chiết theo quy trình của tác giả Rasmussen(1,8) toàn không bị phân hủy thành As(V) (ở mức<br /> Hàm lượng As trung bình (ng/g) 38,3 39,7 2000 ng/g).<br /> Hàm lượng As lớn nhất (ng/g) 48,4 45,7<br /> Hàm lượng As nhỏ nhất (ng/g) 33,2 32,9 Đánh giá độ bền của Asen hữu cơ<br /> %RSD 9,8 10 Asen hữu cơ được thêm vào mẫu sau đó trải<br /> Công cụ “t-Test: Paired Two Sample for qua quá trình xử lý mẫu nhằm đánh giá khả<br /> Means” của phần mềm EXCEL – 2010 được sử năng bị phân hủy thành As(V) gây sai lệch<br /> dụng nhằm so sánh kết quả phân tích hàm dương cho kết quả phân tích. Hàm lượng As(V)<br /> lượng Asen tổng trong mẫu cá lóc giữa phương trong dịch chiết của thí nghiệm càng thấp thì<br /> pháp vô cơ hóa theo AOAC 986.15 và phương dạng Asen hữu cơ càng bền.<br /> Bảng 4: Độ bền của Asen hữu cơ trong dịch chiết<br /> STT DMA (ppb) MMA (ppb) AsB (ppb) As(V) (ppb) STT DMA (ppb) MMA (ppb) AsB (ppb) As(V) (ppb)<br /> 1 2000 2000 2000