Xét nghiệm Neutral Comet và Alkaline Comet nhận diện DNA tinh trùng phân mảnh trên bệnh nhân vô sinh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Xét nghiệm Neutral Comet và Alkaline Comet nhận diện DNA tinh trùng phân mảnh trên bệnh nhân vô sinh trình bày so sánh đặc điểm của các nhóm bệnh nhân asthenoteratozoospermic - ATZ có hoặc không giãn tĩnh mạch thừng tinh; rối loạn nhiễm sắc thể so với người sinh sản bình thường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xét nghiệm Neutral Comet và Alkaline Comet nhận diện DNA tinh trùng phân mảnh trên bệnh nhân vô sinh

Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue 6 (2023) 149-154 INSTITUTE OF COMMUNITY HEALTH NEUTRAL COMET AND ALKALINE COMET TESTS IDENTIFY FRAGMENTED SPERM DNA IN INFERTILITY Pham Tan Hung1, Nguyen Ngoc Hieu2, Tran Thuy Tien1, Pham Thuy Khanh My1, Nguyen Le Thai Duong1, Tran Vo Truc Linh1, Nguyen Thi Han Ny3, Le Huu Tung4, Nguyen Van Huong1* 1 Nguyen Tat Thanh University - 300A Nguyen Tat Thanh, ward 13, district 4, HCMC, Vietnam 2 Duy Tan University, 254 Nguyen Van Linh, Thac Gian, Thanh Ke, Da Nang, Vietnam 3 Hospital for Tropical Disease,764 Vo Van Kiet, ward 1, district 5, HCMC, Vietnam 4 Le Van Thinh Hospital - 130 Le Van Thinh, ward Binh Trung Tay, district 2, HCMC, Vietnam Received 10/05/2023 Revised 31/05/2023; Accepted 26/06/2023 ABSTRACT The Comet test for clinical analysis of sperm DNA provides an assessment of the impact of fragmented DNA on fertility. Objective: To compare the characteristics of groups of asthenoteratozoospermic patients with or without varicocele; chromosomal disorders compared with normal reproductive population. Methods: Factor analysis, correlation between oxidative stress and enzymatic DNA degrada- tion in neutral and alkaline Comet. Results and conclusion: The percentage of infertile patients was mainly from (20-50) years old, in which (20-35) years old accounted for the highest rate 32.7% (p 30 accounted for 12.7% (p
N.V. Huong et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue 6 (2023) 149-154 XÉT NGHIỆM NEUTRAL COMET VÀ ALKALINE COMET NHẬN DIỆN DNA TINH TRÙNG PHÂN MẢNH TRÊN BỆNH NHÂN VÔ SINH Phạm Tấn Hưng1, Nguyễn Ngọc Hiếu2, Trần Thủy Tiên1, Phạm Thuỵ Khánh My1, Nguyễn Lê Thái Dương1, Trần Võ Trúc Linh1, Nguyễn Thị Hàn Ny3, Lê Hữu Tùng4, Nguyễn Vân Hương1* 1Trường Đại học Nguyễn Tất Thành - 300A Nguyễn Tất Thành, phường 13, quận 4, TP.HCM, Việt Nam 2Trường Đại học Duy Tân - 254 Nguyễn Văn Linh, Thạc Gián, Thanh Kê, Đà Nẵng, Việt Nam 3Bệnh viện Nhiệt Đới - 764 Võ Văn Kiệt, phường 1, quận 5, TP.HCM, Việt Nam 4Bệnh viện Lê Văn Thịnh - 130 Lê Văn Thịnh, phường Bình Trưng Tây, quận 2, TP.HCM, Việt Nam Ngày nhận bài: 10/05/2023 Chỉnh sửa ngày: 31/05/2023; Ngày duyệt đăng: 26/06/2023 TÓM TẮT Xét nghiệm Comet phân tích DNA tinh trùng trên lâm sàng đưa ra nhận định về tác động của DNA phân mảnh đến khả năng sinh sản. Mục tiêu: So sánh đặc điểm của các nhóm bệnh nhân asthenoteratozoospermic - ATZ có hoặc không giãn tĩnh mạch thừng tinh; rối loạn nhiễm sắc thể so với người sinh sản bình thường. Phương pháp: Phân tích yếu tố tác động, tương quan giữa stress oxy hoá và phân huỷ DNA bằng enzyme trong neutral và alkaline Comet. Kết quả và kết luận: Tỷ lệ bệnh nhân vô sinh chủ yếu từ (20-50) tuổi, trong đó (20-35) tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất 32,7% (p 30 chiếm tỷ lệ 12,7% (p
N.V. Huong et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue 6 (2023) 149-154 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP bằng 50 μl reaction buffer và enzyme Alu1: 15 IU trong 15 phút, 15 IU trong 25 phút và mẫu đối chứng 0 IU. 2.1. Đối tượng Sau đó, các slide được rửa trong TBE trong 5 phút. Các nghiên cứu được thực hiện trên 75 bệnh nhân nam từ ngày 01/11/2022 – 30/04/2023. Tất cả các bệnh nhân Đối với neutral Comet, slide chứa mẫu điện di trong đồng ý tham gia nghiên cứu và được thông qua Hội đệm TBE ở 20 V (1 V/cm) trong 12 phút và 30 giây, sau đồng Y đức. 75 bệnh nhân được thực hiện xét nghiệm đó rửa trong NaCl 0,9% trong 2 phút. sinh hóa thường quy kết hợp tinh dịch đồ, trong đó 20 bệnh nhân sinh sản bình thường, 20 bệnh nhân ATZ Đối với alkaline Comet, slide được ủ trong dung dịch giãn tĩnh mạch thừng tinh, 20 bệnh nhân ATZ không bị biến tính chứa NaOH 0,03 M và NaCl 1 M trong 2 phút giãn tĩnh mạch thừng tinh, 20 bệnh nhân có sắp xếp lại ở nhiệt độ thường và 30 giây ở 4°C, điện di trong dung cấu trúc nhiễm sắc thể gồm 5 mẫu đối chứng và 5 mẫu dịch NaOH 0,03 M ở 20 V (1 V/cm) trong 4 phút. chuyển vị Robertsonia, 5 mẫu chuyển vị kép t(2;17); t(14;21) và 5 mẫu đảo đoạn inv7. Ủ các slide đã được xử lý trong dung dịch Tris–HCl 2.2. Phương pháp 0,4 M, pH 7,5 trong 5 phút, trong TBE trong 2 phút và khử nước lần lượt 2 phút trong ethanol 70, 90 và 100%. Lấy mẫu tinh dịch: Bệnh nhân không quan hệ và không sử dụng các chất kích thích trong 3 ngày trước Nhuộm và đánh giá mẫu: Tất cả các mẫu được nhuộm khi lấy mẫu. Sau 3 ngày, bệnh nhân tự tiến hành lấy bằng DAPI và quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang. mẫu, mẫu được bảo quản lạnh trong dung dịch đệm Test-yolk buffer [3]. Phân tích thống kê: Tất cả các phân tích thống kê đã được thực hiện bằng phần mềm SPSS. Khoảng tin cậy Neutral Comet và alkaline Comet [4]: Các xét ng- (CI) được tính toán ở mức 95%. Một mặt, các nhóm hiệm được thực hiện đồng thời. Tinh dịch được rã đông được so sánh bằng kiểm định χ2-test, ở mặt khác khi so và rửa ba lần trong dung dịch phosphate và pha loãng sánh tỷ lệ ta dùng Z-test. Các giá trị p
N.V. Huong et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue 6 (2023) 149-154 Bảng 1. Tình trạng bệnh nhân vô sinh Béo phì Tiếp xúc hoá Uống rượu Hút thuốc Tổng bệnh nhân BMI >30 chất (%) (%) Độ tuổi (%) (%) Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ lượng (%) lượng (%) lượng (%) lượng (%) lượng (%) ≤ 20 6 10,9 0 0 4 7,3 3 5,5 0 0 (20 - 35) 18 32,7 5 9,1 11 20 9 16,4 6 10,9 (35 - 50) 16 29,1 7 12,7 12 21,8 10 18,2 5 9,1 (50 - 70) 10 18,2 7 12,7 6 10,9 3 5,5 2 3,6 ≥ 70 5 9,1 5 9,1 4 7,2 4 7,2 5 9,1 Theo nghiên cứu của Gargi, béo phì làm giảm khả năng Comet. sinh tinh: giảm nồng độ tinh trùng, testosterone, tăng estradiol huyết thanh và vô sinh [5]. Johnson SL và Tuy nhiên, khi ủ với Alu 1, dựa vào kết quả alkaline cộng sự cho rằng tuổi tác tăng dẫn đến sự suy giảm và neutral Comet nhận thấy rằng số lượng DNA phân chất lượng tinh dịch do sự xuất hiện đột biến sinh ra từ mảnh tăng, P = 0,009; P = 0,009 và số lượng DNA phân quá trình sao chép DNA tế bào gốc sinh tinh. Theo tổ mảnh của neutral Comet cao hơn 2 lần so với alkaline chức y tế thế giới năm 2022, hơn 60% nam giới trong Comet sau khi ủ 15 phút. độ tuổi sinh sản sử dụng thuốc lá có hình thái biến dạng, Xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng sử dụng trong khả năng di động và nồng độ tinh trùng giảm so với khi quá trình chẩn đoán và tầm soát vô sinh, trong đó sự không hút thuốc. Kim loại nặng gây stress oxy hoá dẫn phân mảnh dsDNA hay ssDNA có giá trị như nhau trong đến tình trạng đột biến và phân mảnh DNA tinh trùng chẩn đoán vô sinh. Ngoài ra, sự đứt gãy DNA có nhiều gây vô sinh ở nam giới [6]. Vì vậy, tùy thuộc vào khu cơ chế tác động do quá trình stress oxy hoá hoặc do hoạt vực và điều kiện sinh sống mà độ tuổi mắc bệnh vô sinh tính nuclease của enzyme tế bào tinh trùng [4]. Mặc dù ở nam giới khác nhau, là một điểm cần lưu ý về dịch tễ. mức độ phân mảnh trong alkaline và neutral Comet là 3.2. Tác động của quá trình oxy hoá và sự phân huỷ khác nhau nhưng đều cho kết quả tăng nồng độ chuỗi DNA bằng enzyme DNA phân mảnh khi được xử lý với H2O2 và Alu1. Từ đó, quá trình stress oxy hóa có thể kích hoạt caspase, en- Phân mảnh DNA tinh trùng ở bệnh nhân có khả năng donuclease trong tinh trùng gây tổn thương DNA kích sinh sản bình thường và các bệnh nhân vô sinh rất thấp thích tình trạng vô sinh ở bệnh nhân [7]. Tuy nhiên, từ (< 25%). Kết quả xét nghiệm alkaline và neutral Com- kết quả của Hình 1 nhận thấy rằng: alkaline Comet có et trên các mẫu ủ với [H2O2] tăng dần, số lượng DNA độ nhạy và đặc hiệu cao trong nhận diện sự phân mảnh phân mảnh tăng tương ứng P = 0,008; P = 0,032. Kết của ssDNA còn neutral Comet có độ nhạy và đặc hiệu quả alkaline Comet có giá trị cao gấp 3 lần so với neutral cao trong nhận diện sự phân mảnh của dsDNA. Hình 1. Kết quả xét nghiệm alkaline và neutral Comet đánh giá sự phân mảnh DNA tương ứng khi ủ với [H2O2] tăng dần (Hình A) và enzyme Alu1 trong các thời điểm khác nhau (Hình B). 152
N.V. Huong et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue 6 (2023) 149-154 3.3. Đánh giá quá trình phân mảnh DNA trên các thừng tinh (P < 0,01). Ngoài ra, nhóm ATZ không có nhóm bệnh nhân giãn tĩnh mạch thừng tinh có giá trị DNA phân mảnh tương đương các nhóm bệnh nhân rối loạn nhiễm sắc Thử nghiệm phân mảnh DNA được thực hiện trên nhóm thể. Ở bệnh nhân vô sinh, giá trị DNA phân mảnh cao đối chứng và ba nhóm bệnh nhân. Kết quả cho thấy, hơn mẫu đối chứng, có ý nghĩa thống kê trên lâm sàng giá trị DNA phân mảnh ở phân nhóm ATZ giãn tĩnh ( P
N.V. Huong et al. / Vietnam Journal of Community Medicine, Vol. 64, Special Issue 6 (2023) 149-154 sao chổi với phần đầu là DNA nguyên vẹn và phần đuôi [2] Eugenia C et al., Comet assay: a versatile but là DNA phân mảnh. Lượng DNA phân mảnh càng cao complex tool in genotoxicity testing. Toxicol Res thì kết quả điện di phần đuôi sao chổi càng sáng và càng (Camb). 2021 Jan; 10(1): 68–78. doi: 10.1093/ dài [13]. toxres/tfaa093. Hình 3. Tinh trùng phân mảnh [3] Qingyuan C et al., Extend the Survival of Hu- man Sperm In Vitro in Non-Freezing Condi- tions: Damage Mechanisms, Preservation Tech- nologies, and Clinical Applications, Cells 2022, 11(18), 2845. [4] Lise B et al., AutoComet: A fully automated al- gorithm to quickly and accurately analyze comet assays, Redox Biology, Volume 62, June 2023, 102680. [5] Gargi RC et al., Obesity and male infertility: multifaceted reproductive disruption, Middle East Fertility Society Journal volume 27, Article number: 8 (2022). [6] Andrea S et al., Smoke, alcohol and drug addic- tion and male fertility. Reprod Biol Endocrinol. 2018; 16: 3. Published online 2018 Jan 15. doi: 10.1186/s12958-018-0320-7. [7] Teppei T et al., Oxidative stress and male infer- tility, Reprod Med Biol. 2021 Jan; 20(1): 41–52. [8] Ashok A et al., Sperm DNA Fragmentation: A New Guideline for Clinicians, World J Mens Health. 2020 Oct; 38(4): 412–471. doi: 10.5534/ wjmh.200128. [9] Nan J et al., An Overview of Comet Assay: Ap- plication for Detecting DNA Damage in Aquatic Animals, Agriculture 2023, 13(3), 623. 4. KẾT LUẬN [10] Soheila P et al., Male factor testing in recurrent pregnancy loss cases: A narrative review.Int J Tỷ lệ bệnh nhân vô sinh chủ yếu từ (20 - 50) tuổi, trong Reprod Biomed. 2022 Jun; 20(6): 447–460. doi: đó (20- 35) tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất 32,7% (p 30 chiếm tỷ lệ 12,7% [11] Daniela S et al., The Antioxidant Therapy: (p